人參囊泡調控腫瘤免疫微環境的活性成分研究

肖蓮蓮，余靈靜，劉藝芃，胡 楊，張云羽，嵇 晶，程建明*

人參囊泡調控腫瘤免疫微環境的活性成分研究

肖蓮蓮1, 2，余靈靜1, 2，劉藝芃1, 2，胡 楊1, 2，張云羽1, 2，嵇 晶1, 2，程建明1, 2*

1. 南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023 2. 江蘇省經典名方工程研究中心，江蘇 南京 210023

探討人參來源的細胞外囊泡（ginseng-derived nanoparticles，GDNPs）在調控腫瘤相關巨噬細胞表型及抑制黑色素瘤生長方面的潛在物質基礎。采用納米顆粒跟蹤分析儀、透射電鏡測試及紫外-可見分光光度法全面表征GDNPs及其主要成分（蛋白質、多糖和皂苷）的含量；通過qRT-PCR和流式細胞術檢測GDNPs與其含有的多糖、皂苷成分對骨髓來源巨噬細胞（bone marrow-derived macrophage，BMDM）表型的調控影響。收集不同極化程度的BMDM條件培養基（conditional medium，CM）孵育小鼠皮膚黑色素瘤B16F10細胞，CCK-8法測定不同CM處理后B16F10細胞活力，驗證活性成分對腫瘤免疫微環境的調控作用；通過PMP柱前衍生法定量分析GDNPs活性成分組成。透射電鏡下觀察GDNPs形態結構良好，含量測定結果為2.46×1011顆粒的GDNPs含有4.31 mg蛋白質、4.46 mg多糖、1.22 mg皂苷。qRT-PCR和流式細胞術實驗結果顯示GDNPs多糖可以逆轉M2型巨噬細胞表型，向M1方向極化。GDNPs多糖誘導巨噬細胞極化后的CM顯著抑制了B16F10細胞活力。PMP柱前衍生法分析GDNPs多糖成分由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，其物質的量比為4.72∶1.07∶2.15。揭示了GDNPs中多糖成分在調控腫瘤免疫微環境的關鍵作用，為進一步的機制研究和臨床應用提供了實驗依據。

人參細胞外囊泡；腫瘤免疫微環境；巨噬細胞極化；多糖；葡萄糖；半乳糖；阿拉伯糖

目前，腫瘤免疫治療在癌癥的進展及其治療策略中占據核心地位，腫瘤免疫治療是指免疫細胞滲透到腫瘤部位啟動抗癌免疫應答，控制或殺滅腫瘤細胞的療法。但腫瘤細胞會通過劫持免疫檢查點、重塑腫瘤的細胞外基質形成阻止免疫細胞浸潤的屏障，以及通過影響免疫抑制細胞和免疫微環境中相關信號通路形成免疫抑制的腫瘤微環境，從而逃避機體免疫系統識別和攻擊[1-2]。腫瘤免疫微環境由免疫細胞、腫瘤細胞、細胞因子以及其他多種分子間的精細相互作用所構成。癌細胞與腫瘤微環境之間持續、動態的相互作用是促進腫瘤發生、發展和轉移的關鍵因素。在此環境中，巨噬細胞作為免疫反應的關鍵效應細胞，其表型轉變及功能活性對腫瘤免疫微環境具有顯著的調控作用。它們可以根據刺激和環境因素被激活為M1型（經典激活）或M2型（替代激活）。M1型巨噬細胞具備顯著的抗腫瘤能力，呈現出免疫激活態，并能夠釋放免疫刺激性細胞因子。M2型巨噬細胞則具有促進腫瘤生長和擴散的潛力，釋放免疫抑制性因子[3-5]。鑒于此，誘導巨噬細胞向M1型表型的轉變已被視為腫瘤治療的潛在策略，通過調節巨噬細胞極化狀態來優化腫瘤免疫微環境，進而增強免疫治療效果。

幾乎所有的細胞類型，無論是在體內還是體外，都會產生細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），它們的結構、成分和分子加工反映了它們起源細胞中發生的活動[6]。植物來源EVs具有天然生物活性脂質、蛋白質、RNA和其他藥理活性分子，具有獨特的形態和組成特征[7-9]。人參來源的細胞外囊泡（ginseng-derived nanoparticles，GDNPs）已經被證明具有調節免疫[10]、抗腫瘤[11]、抗衰老[12]、促進傷口愈合[13]、抗心肌損傷[14]、抗炎[15]、抗骨質疏松[16]的藥理作用。之前的研究分別從體內、體外實驗證明了GDNPs能夠逆轉腫瘤免疫微環境促進腫瘤相關巨噬細胞由M2向M1表型的極化，產生總活性氧，導致小鼠黑色素瘤細胞凋亡增加并顯著抑制了荷瘤小鼠的黑色素瘤生長[17]。除此之外，藥物通過血腦屏障治療腦腫瘤的能力被認為是最重要的藥物特性之一，而GDNPs在調節腫瘤免疫微環境，募集M1巨噬細胞的同時，對于透過血腦屏障靶向神經膠質瘤具有良好的潛力[18]。早期研究已揭示GDNPs內含豐富的代謝產物，并能夠介導細胞間的信號通訊。這種介導機制主要通過Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）和髓樣分化因子88（myeloid differentiation primary response 88，MyD88）信號通路來實現，進而調節M2型巨噬細胞的功能，使其表現出抗腫瘤活性[17]。盡管有此初步發現，但GDNPs在調控腫瘤免疫微環境中的確切作用的活性成分還不完全。基于此，本研究旨在采用巨噬細胞極化模型，深入探討GDNPs中的活性成分，以揭示其在腫瘤免疫微環境調控中的詳細機制。

1 材料

1.1 動物與細胞株

SPF級雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質量18～22 g，由南京安諾康生物科技有限公司提供，實驗動物合格證編號為NO.202343651，實驗動物使用許可證號SYXK（蘇）2018-0049，飼養溫度為24～25 ℃，相對濕度為50%～60%，自由進食飲水。動物實驗方案經南京中醫藥大學機構動物護理與使用委員會批準（批準號202306A011）。

B16F10小鼠皮膚黑色素瘤細胞系購自上海中科院細胞庫。

1.2 藥品與試劑

GDNPs由實驗室制備，具體方法參考文獻[17]；RPMI 1640完全培養基（批號WHAA23X032）、0.02% EDTA溶液（Versene液，批號WH2622F311）均購自武漢普諾賽生物科技有限公司；巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF，批號0332537CL21）、白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4，批號0332538KE01）、IL-13（批號0332650NG026）均購自蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號GK10009）購自美國GlpBio公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，批號L8880）、紅細胞裂解液（批號20220818）均購自北京索萊寶科技有限公司；甲醇（批號20230228）、乙醇（批號20220325）、三氯甲烷（批號20220311）、正丁醇（批號20221020）、石油醚（批號20220429）、無水磷酸二氫鈉（批號20220217）均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；高氯酸（批號2012003）購自天津鑫源化工有限公司；流式細胞染色緩沖液（批號2207X220780）購自上海懋康生物科技有限公司；PE抗鼠CD206抗體（批號B369245）、FITC抗鼠CD86抗體（批號B367027）、抗鼠CD16/32抗體（批號B343988）均購自Biolegend公司；人參皂苷Re對照品（批號AZ21122181，質量分數為98%）購自成都埃法生物科技有限公司；巖藻糖標準品（批號C20PB02541B）購自普西唐生物科技有限公司；標準品半乳糖（批號S07HB193921）、葡萄糖醛酸（批號R09J11H115178）、阿拉伯糖（批號K28J12B135956）、半乳糖醛酸（批號J09HB187862）、鼠李糖（批號O12A10K95105）、木糖（批號D17N9S74410）購自上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖標準品（批號E1811036）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 儀器

Gallios分析型流式細胞儀（美國Beckman公司）；Nanosight NS300型納米顆粒跟蹤分析儀（英國Malvern公司）；2695型高效液相色譜儀、2998型PDA紫外檢測器（美國Waters公司）。

2 方法

2.1 GDNPs的表征及穩定性測試

2.1.1 透射電鏡觀察 取適量GDNPs，使用PBS稀釋至適當濃度。取10 μL稀釋液滴在銅網上，靜置4 min，隨后用2%磷鎢酸染色3 min。在室溫下自然風干后，置于200 kV電壓的透射電鏡下進行成像。

2.1.2 粒徑與粒子濃度的測定 取適量GDNPs，并用PBS稀釋到所需濃度，隨后在納米顆粒跟蹤分析儀的自動模式下進行測量。

2.1.3 穩定性測試 將GDNPs置于4 ℃保存，每天于同一時間點利用納米顆粒跟蹤分析儀測定粒徑，連續測定7 d，觀察GDNPs粒徑變化。

2.2 蛋白質、多糖、皂苷類成分含量測定

2.2.1 蛋白質含量測定 根據BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質含量，精密量取供試品溶液2 μL，用空白溶劑補足至20 μL，各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置30 min，在562 nm下測定各個樣品吸光度（）值，按標準曲線計算其在GDNPs中的含量。

2.2.2 多糖含量測定 采用苯酚硫酸法測定GDNPs中的多糖含量，精密量取葡萄糖標準品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于干燥至恒定質量的試管中，以蒸餾水補至1.0 mL。精密加入5%苯酚溶液0.5 mL及濃硫酸2.5 mL，充分振搖5 min，置沸水浴加入20 min，立即置于冰水浴中冷卻3 min，在488 nm處測定各溶液的值。精密量取供試品溶液0.1 mL，測定方法同標準品，在488 nm處測定各供試品的值，按標準曲線計算其在GDNPs中的含量。

2.2.3 皂苷類成分含量測定 精密吸取人參皂苷Re對照品溶液0、10、20、40、80、100、120 μL，分別置10 mL干燥的具塞試管中，60 ℃水浴蒸干溶劑，精密加5%香草醛冰醋酸溶液-高氯酸（2∶8）的混合溶液1 mL，置60 ℃水浴中加熱15 min，取出，置冰水浴中冷卻，精密加冰醋酸5 mL，搖勻，在544 nm處測定各溶液的值。精密量取供試品溶液300 μL，測定方法同標準品，在544 nm處測定各供試品的值，按標準曲線計算其在GDNPs中的含量。

2.3 GDNPs多糖、皂苷成分提取方法

取適量GDNPs加入10倍量的去離子水在80 ℃下煎煮2 h，趁熱抽濾，收集濾液，減壓濃縮至10 mL，加入無水乙醇調整體積分數至95%，4 ℃靜置過夜，收集沉淀，純水復溶后使用Sevag法進行脫蛋白處理，蒸干溶劑，純水復溶得到GDNPs多糖樣品（GP）。

取適量GDNPs加入10倍量的70%乙醇溶液回流提取2 h，趁熱抽濾，收集濾液，減壓濃縮至無醇味，依次使用石油醚、三氯甲烷、水飽和正丁醇萃取，回收正丁醇層，蒸干，純水復溶得到GDNPs皂苷樣品（GG）。

2.4 B16F10細胞培養

B16F10細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養液，于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養，每隔3 d傳代1次。

2.5 骨髓來源巨噬細胞（bone marrow-derived macrophage，BMDM）極化相關實驗

2.5.1 BMDM提取 C57BL/6小鼠脫頸處死，迅速浸泡在75%乙醇中5～10 min。在超凈臺上分離小鼠的股骨和脛骨，并轉移至PBS中。利用無菌手術剪刀小心地切除股骨的兩端，隨后用1 mL帶針注射器抽取PBS，并注入股骨兩端，使骨髓細胞流出到培養皿內。利用移液槍反復吹打，使細胞形成單細胞懸液。細胞懸液過100 μm的細胞濾網，以去除細胞團塊、骨碎片、皮毛和其他雜質。細胞懸液于室溫1 500 r/min離心5 min后，去掉上清液。加入1 mL紅細胞裂解液孵育3 min，于室溫1 500 r/min離心5 min，然后用PBS洗滌細胞。將細胞重新懸浮在含20 ng/mL M-CSF的RPMI 1640完全培養基中。在顯微鏡下觀察細胞形態，并放置在CO2恒溫培養箱中培養。每2～3天更換1次培養基，直到第7天觀察到梭形細胞，標志著BMDM的成熟。

2.5.2 qRT-PCR分析BMDM的、mRNA表達 將成熟的BMDM調整至1×106個/孔，設置空白組、模型組和給藥組，空白組只添加不含胎牛血清的RPMI 1640培養基，模型組加入20 ng/mL的IL-4、IL-13），孵育48 h；給藥組在添加20 ng/mL的IL-4、IL-13孵育24 h后，分別添加低、中、高劑量（10、20、40 μg/mL）的多糖提取物（GP1、GP2、GP3）或低、中、高劑量（3、6、12 μg/mL）的皂苷成分提取物（GG1、GG2、GG3）孵育至48 h。給藥結束后棄去培養基，用PBS緩沖液沖洗2次，按照試劑盒說明書提取細胞總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5.3 流式細胞術檢測BMDM的CD206、CD86熒光表達 將成熟的BMDM調整至1×106個/孔，設置空白組、模型組和給藥組，空白組只添加不含胎牛血清的RPMI 1640培養基，模型組加入20 ng/mL的IL-4、IL-13），孵育48 h；給藥組在添加20 ng/mL的IL-4、IL-13孵育24 h后，分別添加10 μg/mL GDNPs或低、中、高劑量（10、20、40 μg/mL）的多糖提取物（GP1、GP2、GP3）或低、中、高劑量（3、6、12 μg/mL）的皂苷成分提取物（GG1、GG2、GG3）孵育至48 h。給藥結束后，每孔加入1 mL 0.02% EDTA溶液，消化收集細胞，加入1 mL細胞染色緩沖液洗滌細胞2次，500 μL細胞染色緩沖液重懸，收集細胞于1.5 mL EP管中。加入Fc受體封閉劑抗鼠CD16/32冰上孵育10 min，然后加入PE抗鼠CD206抗體、FITC抗鼠CD86抗體于冰上染色30 min。孵育結束后，加入1 mL PBS洗滌細胞2次，4 ℃、1 500 r/min離心5 min；棄去上清，加入500 μL PBS重懸細胞，過300目篩網轉移至流式管中，使用流式細胞儀檢測各個標記物的表達情況。

2.5.4 BMDM條件培養基（conditional medium，CM）的制備[19-20]誘導成熟的BMDM分為M1組（加入100 ng/mL的LPS）、M2組（加入20 ng/mL的IL-4、IL-13）、GP1組（在添加IL-4、IL-13孵育24 h后添加10 μg/mL GP孵育至48 h）、GP2組（在添加IL-4、IL-13孵育24 h后添加20 μg/mL GP孵育至48 h）、GP3組（在添加IL-4、IL-13孵育24 h后添加40 μg/mL GP孵育至48 h），給藥孵育后得到不同極化的巨噬細胞，在無血清培養基中孵育24 h后棄去培養基，10 000 r/min離心5 min，收集上清作為CM，分別得到M1-CM、M2-CM、GP1-CM、GP2-CM、GP3-CM用于孵育B16F10細胞，測定B16F10細胞活力以驗證GDNPs中的活性成分。

2.6 CCK-8法檢測B16F10細胞活力

常規培養B16F10細胞，調整細胞數為5×103個/mL，接種于96孔板，每孔加入細胞混懸液100 μL，待細胞貼壁后，加入不同CM繼續培養，空白組與調零孔（不含細胞）加入無血清培養基，24 h后棄去舊培養基，每孔加入100 μL培養基洗滌2次后更換新的培養基，各孔加入10 μL的CCK-8試劑，37 ℃孵育4 h，并于酶標儀上讀取各孔在450 nm處的值，計算細胞活力。

細胞活力＝(給藥－調零)/(空白－調零)

2.7 GDNPs多糖的單糖組成分析及方法學考察[21-23]

2.7.1 PMP柱前衍生法分析單糖組成 取適量GDNPs，加入3 mol/L三氟乙酸溶液3 mL，超聲溶解，封口，110 ℃水解6 h，放冷至室溫，3 000 r/min離心10 min，取上清液減壓蒸干，加甲醇溶解蒸干5～6次，殘渣加超純水溶解定容至1 mL，制得水解后樣品供試液。取葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸標準品溶液及樣品各400 μL，加400 μL的0.5 mol/L PMP甲醇溶液和400 μL的0.3 mol/L氫氧化鈉溶液，混勻，70 ℃水浴加熱100 min后，再加500 μL的0.3 mol/L鹽酸，混勻。加入2 mL三氯甲烷萃取，劇烈搖晃，3 500 r/min離心5 min，棄去氯仿層，過0.22 μm濾膜得PMP衍生化樣品。使用Waters高效液相色譜儀進行分析，色譜條件為Agilent ZORBX SB-aq C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，4 μm）；檢測波長250 nm；柱溫25 ℃；體積流量1 mL/min；流動相為磷酸二氫鈉鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.85）-乙腈（82∶18），等度洗脫。

2.7.2 線性關系考察 按“2.7.1”項下方法制備各對照品系列質量濃度的PMP衍生化標準品溶液，在“2.7.1”項色譜條件下進樣分析。以葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖3個成分的質量濃度為橫坐標（），峰面積為縱坐標（），分析得到其線性回歸方程、線性系數（）和線性范圍分別為葡萄糖＝585 162＋837 782，＝0.999 3，線性范圍1.05～20.96 mg/mL；半乳糖＝901 803＋35 251，＝0.999 6，線性范圍0.20～12.26 mg/mL；阿拉伯糖＝950 752－92 833，＝0.999 7，線性范圍0.35～10.46 mg/mL。結果顯示，3個成分的線性系數在0.999 3～0.999 7，符合線性關系考察要求。

2.7.3 精密度試驗 取上述對照品溶液，按照“2.7.1”項下制備PMP衍生化標準品溶液，在“2.7.1”項色譜條件下連續進樣6次，測定峰面積并計算RSD值。結果顯示，葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖3個成分的峰面積RSD分別為1.23%、1.19%、1.36%，均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.7.4 穩定性試驗 取GDNPs樣品，按照“2.7.1”項下方法制備PMP衍生化供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12 h在“2.7.1”項色譜條件下進樣測定峰面積并計算RSD值。結果顯示，供試品溶液中葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖3個成分的峰面積RSD分別為2.34%、2.78%、2.06%，均小于3%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.7.5 重復性試驗 取GDNPs樣品，按照“2.7.1”項下方法平行制備6份PMP衍生化供試品溶液，按“2.7.1”項色譜條件下進樣測定峰面積并計算RSD值。結果顯示，供試品溶液中葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的峰面積RSD分別為1.40%、1.82%、1.52%，均小于3%，表明該方法重復性較好。

2.7.6 加樣回收率試驗 精密量取6份已測定單糖含量的GDNPs樣品，每份1 mL，分別精密加入樣品中指標成分質量與對照品質量比例約為1∶1的對照品溶液，按照“2.7.1”項下方法制備PMP衍生化供試品溶液，在“2.7.1”項色譜條件下進樣測定，計算各供試品的加樣回收率和RSD值。結果顯示，葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖3個成分的平均加樣回收率分別為98.30%、102.11%、101.76%，RSD分別為2.52%、2.08%、1.79%，且均小于3%，加樣回收率試驗結果良好。

2.8 統計學分析

3 結果

3.1 GDNPs的表征及穩定性測試

GDNPs是由人參細胞分泌的一種具有膜結構的小泡，能夠攜帶蛋白質、mRNA、miRNA和代謝物等成分，在植物機體中參與生長代謝過程。對GDNPs進行表征如圖1-A所示，在透射電鏡下可以看出GDNPs呈雙層膜結構的圓形小泡，獨特空間結構可作為載體運載人參的活性成分靶向受體部位，介導一系列的生物學功能。使用納米顆粒跟蹤分析儀測定GDNPs的粒徑，結果見圖1-B，GDNPs的粒徑分布在60～320 nm。本研究利用納米顆粒跟蹤分析儀連續7 d監測GDNPs在4 ℃環境存放過程中的粒徑變化，結果如圖1-C所示，GDNPs的粒徑并無明顯變化，表明在4 ℃條件下GDNPs可以儲存7 d，且穩定性良好。

A-GDNPs超微結構；B-GDNPs粒徑；C-GDNPs在4 ℃環境存放過程中的粒徑變化。

3.2 GDNPs的含量測定

2.46×1011顆粒的GDNPs含有4.31 mg蛋白質、4.46 mg多糖、1.22 mg皂苷，結果顯示多糖成分的含量最高。在目前的研究報道中，人參中多糖成分與皂苷均具有逆轉巨噬細胞表型，調控腫瘤免疫微環境的作用[3,24]。前期研究已經證明GDNPs脂質和蛋白質導致了M2型巨噬細胞極化的改變[17]。本研究進一步對GDNPs中的皂苷與多糖是否為調控巨噬細胞表型活性成分進行研究。

3.3 不同成分對M2型BMDM極化的影響

3.3.1 不同成分對M2型BMDM、mRNA表達的影響 為探究GDNPs逆轉M2巨噬細胞表型的活性成分，分別提取了GDNPs的多糖與皂苷成分。CD206為M2型巨噬細胞表面標志物，CD86為M1型巨噬細胞表面標志物。由圖2可知，GP組可以改變巨噬細胞表型，向M1方向極化，而GG組不能逆轉M2型巨噬細胞的極化表型。

3.3.2 不同成分對M2型BMDM CD206、CD86熒光表達的影響 如圖3所示，GP組與GG組結果同qRT-PCR實驗結果一致，GP組誘導的巨噬細胞表面標志物CD86和CD206均呈顯著性升高和降低（＜0.05、0.01）。其中GDNPs組對于逆轉M2型巨噬細胞表型藥理效應最佳，這可能與GDNPs具有納米囊泡結構有關，提高了生物利用度。GG組雖然沒有對M2型巨噬細胞表型起逆轉作用，但其驅使巨噬細胞繼續向替代激活的M2抗炎表型極化，其抗炎作用可能協同其他活性成分，防止過度逆轉M2表型，避免GDNPs對機體造成炎癥損傷。

與空白組比較：##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，圖3同。

3.4 活性成分處理的巨噬細胞CM抑制B16F10細胞增殖

為了進一步驗證GP是否為GDNPs介導調控腫瘤免疫微環境發揮抗癌效應的活性成分，制備不同成分誘導后的巨噬細胞CM，使用不同CM處理B16F10細胞24 h，通過CCK-8法評價不同CM對B16F10細胞增殖作用的影響。如圖4所示，M2-CM無明顯抑制B16F10細胞增殖的作用，GP-CM能夠顯著抑制B16F10細胞的增殖。

3.5 活性多糖成分的單糖組成分析

采用PMP柱前衍生法對活性GP進行單糖組成分析，圖5-A、B分別為單糖標準品色譜圖、GDNPs活性多糖成分水解液的色譜圖。經HPLC測定GDNPs活性多糖由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，其物質的量比為4.72∶1.07∶2.15。

與空白組比較：***P＜0.001。

A-單糖標準品色譜圖（1-PMP，2-巖藻糖，3-半乳糖，4-葡萄糖醛酸，5-阿拉伯糖，6-半乳糖醛酸，7-鼠李糖，8-葡萄糖，9-木糖）；B-水解GDNPs多糖樣品的色譜圖（1-PMP，2-葡萄糖，3-半乳糖，4-阿拉伯糖）。

4 討論

目前，治療癌癥方法不再專注于靶向腫瘤細胞本身，因為癌癥的進展是由腫瘤細胞和腫瘤部位環境之間的相互作用調控的，腫瘤微環境是一個以腫瘤為主體，由腫瘤細胞、基質細胞、免疫細胞和細胞外基質組成的復雜的腫瘤生態系統。在腫瘤微環境中，巨噬細胞與腫瘤細胞、免疫細胞和基質細胞的密集對話可以驅動促或抗腫瘤表型。反之，腫瘤相關的巨噬細胞在腫瘤微環境中強烈塑造細胞因子和代謝物水平，因此在抗腫瘤免疫中發揮重要作用。M1型巨噬細胞通過支持1型T輔助性細胞（1 type helper T-lymphocyte，Th1）介導的抗癌反應和促進細胞毒性T細胞的招募來促進腫瘤相關巨噬細胞的抗腫瘤反應[25-28]。

植物來源的EVs相較于動物細胞外囊泡展示出一系列顯著的優越性[29-32]。這些優勢主要體現在植物EVs的低免疫原性上，這一特性在治療應用中顯得尤為重要，因為它極大降低了引發免疫系統反應的可能性。此外，從經濟和可持續發展的角度來看，植物細胞的批量培養過程既經濟又高效，相比之下，動物細胞的培養更為復雜和成本較高。植物EVs在極端環境條件下展現出的穩定性，如高溫和干燥條件下的穩定性，對于藥物的長期儲存和運輸是一個不可忽視的優點。從藥物遞送的角度來看，植物EVs作為天然的載體，能夠有效地運輸包括RNA、DNA和蛋白質在內的多種藥物分子。這種生物相容性強的特性，減少了在臨床應用中產生不良反應的風險。而且，選擇植物源的EVs作為遞送載體，可以避免與動物源相關的污染和病原體傳播的風險。在某些情況下，特定植物的EVs還可能包含有獨特的生物活性成分，這為開發新型治療策略提供了潛在的途徑[33]。

植物EVs在藥物輸送系統中的應用尤其引人注目。它們被認為是一種生物兼容、可生物降解且來源廣泛的納米輸送系統，可用于無細胞治療。在臨床前和臨床研究中，植物EVs已顯示出比傳統合成載體更多的優勢，為新型藥物輸送系統開辟了新的前沿領域。例如，姜源EVs在改變腸道菌群和調節宿主生理以抑制結腸炎方面展現出了潛力[34]。Umezu等[35]證明了針葉櫻桃衍生的納米囊泡在封裝和保護核酸方面的可行性，以及它們在將這些化合物遞送至體內靶位點的有效性。Pomatto等[36]研究了來源于柑橘汁的EVs作為口服給藥的編碼嚴重急性呼吸系統綜合征冠狀病毒2型S1蛋白亞基的信使核糖核酸疫苗的載體，該疫苗具有胃抗性口服膠囊制劑。加載到EVs中的mRNA受到保護，并且在冷凍干燥和封裝后在室溫下穩定1年。

GDNPs在調節腫瘤免疫微環境方面已顯示出顯著的潛力，Han等[37]研究證明GDNPs可以重組腫瘤相關巨噬細胞，增加CC類趨化因子5（CC chemokine ligand 5，CCL5）和趨化因子CXC配體9（C-X-C motif chemokine 9，CXCL9）的分泌，招募CD8+T細胞進入腫瘤床，將冷腫瘤微環境轉換為熱腫瘤微環境改善免疫檢查點抑制劑治療效果。Lv等[10]研究發現由于GDNPs改變了精氨酸酶-1的表達，從而激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）活性，同時上調由mTOR活性調節的T-bet表達。而促進T細胞耗竭的T細胞中轉錄因子Eomes和Tox的表達受到抑制，最終降低了免疫檢查點的表達，改善了T細胞耗竭，恢復了T細胞的抗腫瘤作用，更好地治療癌癥。為了進一步研究GDNPs的藥理學作用機制，本研究對其物質基礎進行了分析討論，GDNPs多糖相較于蛋白質、皂苷含量最多，可以有效逆轉腫瘤相關巨噬細胞的表型，同時GDNPs多糖作用巨噬細胞后的培養基可有效抑制B16F10細胞的增殖能力。M1型巨噬細胞主導的免疫微環境有助于炎癥反應，但也可能導致周圍健康組織的損傷。此外發現，GDNPs皂苷能夠調節炎癥環境，促進腫瘤環境中的巨噬細胞向抗炎表型極化，可以避免持續的炎癥反應導致組織損傷與功能障礙。綜上，本研究揭示了GDNPs中多糖成分的關鍵作用，為進一步的機制研究和臨床應用提供了有價值的信息。未來的研究可以進一步探討GDNPs的其他活性成分，以及如何優化其在腫瘤治療中的應用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Active components of ginseng vesicles regulating tumor immune microenvironment

XIAO Lianlian1, 2, YU Lingjing1, 2, LIU Yipeng1, 2, HU Yang1, 2, ZHANG Yunyu1, 2, JI Jing1, 2, CHENG Jianming1, 2

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Jiangsu Classic Famous Formula Engineering Research Center, Nanjing 210023, China

To explore the potential material basis of ginseng-derived nanoparticles (GDNPs) in regulating tumor-associated macrophage phenotype and inhibiting melanoma growth.GDNPs and their major components (proteins, polysaccharides and saponins) were comprehensively characterized using nanoparticle tracking analyzer, transmission electron microscopy test and UV-Vis spectrophotometry. The regulatory effects of GDNPs and their polysaccharide and saponin components on the phenotype of bone marrow-derived macrophages (BMDM) were examined by qRT-PCR and flow cytometry experiments. B16F10 cells were incubated in BMDM conditioned medium (CM) with different degrees of polarization, and the viability of B16F10 cells was determined by CCK-8 assay to verify the modulation of the tumor immune microenvironment by the active ingredients. The active ingredient composition of GDNPs was quantified by PMP pre-column derivatization.The morphology and structure of GDNPs were well observed under transmission electron microscopy. 2.46 × 1011particles of GDNPs contained 4.31 mg of protein, 4.46 mg of polysaccharides, and 1.22 mg of saponins. qRT-PCR and flow cytometry experiments showed that the polysaccharide group of GDNPs reversed the phenotype of the M2-type macrophage cells, which were polarized toward M1. GDNPs polysaccharides induced macrophage polarization after CM significantly inhibited the viability of B16F10 cells. PMP pre-column derivatization analysis of the polysaccharide components of GDNPs consisted of glucose, galactose, arabinose, and the substance amount ratio was 4.72∶1.07∶2.15.The experimental results reveal the key role of the polysaccharide components of GDNPs in the modulation of the tumor immune microenvironment, and provide the experimental basis for further mechanism study and clinical application.

ginseng extracellular vesicles; tumor immune microenvironment; macrophage polarization; polysaccharides; glucose; galactose; arabinose

R285.5

A

0253 - 2670(2024)09 - 3006 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.015

2023-10-18

國家自然科學基金青年基金項目（81803391）

肖蓮蓮，碩士研究生，研究方向為中藥制藥技術與產品開發。E-mail: 20210939@njucm.edu.cn

通信作者：程建明，研究員，博士生導師，主要從事中藥新劑型、新技術研究及其產品開發。E-mail: 320320@njucm.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]