紫斑牡丹籽粕總黃酮純化工藝研究

陶波 楊文瑾

基金項(xiàng)目：2021年甘肅省高等學(xué)校創(chuàng)新基金項(xiàng)目“臨夏紫斑牡丹籽粕中總黃酮提取純化工藝及抗氧化性和抑菌活性研究”（2021B-568）。

作者簡(jiǎn)介：陶波（1989—），男，甘肅張掖人，碩士，講師。研究方向：動(dòng)物病理學(xué)及中獸藥研發(fā)。

摘 要：選用D101、AB-8、NKA-9型大孔樹(shù)脂進(jìn)行靜態(tài)吸附及解析性能試驗(yàn)，篩選出AB-8型大孔樹(shù)脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)試驗(yàn)研究，獲得了紫斑牡丹籽粕中總黃酮的最佳純化工藝條件。結(jié)果顯示，利用AB-8型大孔樹(shù)脂在上樣液濃度為5 mg·mL-1、pH值為5、流速為3 BV·h-1、上樣液體積為5 BV條件下進(jìn)行吸附，在洗脫液為70%乙醇、洗脫液流速為1.5 BV·h-1、洗脫液體積為7 BV條件下洗脫，純化后紫斑牡丹籽粕總黃酮含量由8.54%提高到32.36%，該工藝可行性較高，可為紫斑牡丹籽粕中總黃酮純化提供有效理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紫斑牡丹籽粕；總黃酮；大孔樹(shù)脂；純化

Study on Purification Process of Total Flavonoids from Paeonia rockii Seed Meal

TAO Bo， YANG Wenjin

（Department of Biotechnology， Linxia Modern Vocational College， Linxia 731100， China）

Abstract： D101， AB-8 and NKA-9 macroporous resins were selected for static adsorption and resolution performance tests， and AB-8 macroporous resin was screened for dynamic tests to obtain the optimal purification process conditions for total flavonoids in Paeonia rockii seed meal. The results show that the AB-8 macroporous resin was used for adsorption under the conditions of sample solution concentration of 5 mg·mL-1， pH value of 5， flow rate of 3 BV·h-1， and sample solution volume of 5 BV， and when the eluent is 70% ethanol， the eluent flow rate is

1.5 BV·h-1， and the eluent volume is 7 BV， the total flavonoid content of purified Paeonia rockii seed meal increases from 8.54% to 32.36%. This process has high feasibility and can provide an effective theoretical basis for the purification of total flavonoids in Paeonia rockii seed meal.

Keywords： Paeonia rockii seed meal; total flavonoids; macroporous resin; purification

紫斑牡丹（Paeonia rockii）既是觀賞性花卉植物，又是重要的藥用植物，其花、皮具有一定的活血化瘀、抗病毒、抗菌等藥用價(jià)值。紫斑牡丹中黃酮類(lèi)化合物是重要的活性物質(zhì)[1-2]，現(xiàn)已被廣泛研究開(kāi)發(fā)并取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益[3]。紫斑牡丹籽油中含有較高濃度的α-亞油酸，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、美容防輻射等功效[4]，目前也作為保健食品原料被開(kāi)發(fā)利用[5]，但紫斑牡丹籽粕卻成為工業(yè)廢料而未能有效利用。前期提取工藝試驗(yàn)研究表明，紫斑牡丹籽粕中總黃酮粗提物含量為8.54%，本文旨在研究紫斑牡丹籽粕總黃酮的純化工藝，為進(jìn)一步提高紫斑牡丹種子的利用率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫斑牡丹籽粕由臨夏河州牡丹農(nóng)業(yè)科技有限公司贈(zèng)送，烘干粉碎備用。

無(wú)水乙醇、石油醚（60～90 ℃）、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉和三氯化鋁均為分析純；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：153-18-4）；AB-8型樹(shù)脂、D-101型樹(shù)脂、NKA-9型樹(shù)脂，均購(gòu)自安徽三星樹(shù)脂有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NBL-124e型電子天平，艾德姆衡有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SUS304中藥粉碎機(jī)，慈溪丁帥電器公司；SHZ-D2型循環(huán)水真空泵，上海力辰邦西儀器設(shè)備有限公司；V-5100B型可見(jiàn)分光光度計(jì)，元析儀器有限公司；SHA-CA型恒溫振蕩器，常州潤(rùn)華電器有限公司。

1.3 紫斑牡丹籽粕黃酮提取與測(cè)定

（1）紫斑牡丹籽粕預(yù)處理。將干燥后的紫斑牡丹籽粕粉碎過(guò)篩后裝入燒杯，按1∶3（V/V）加入石油醚封口，脫脂1.5 h（3次），至石油醚無(wú)色后抽濾干燥待用[6]。

（2）紫斑牡丹籽粕總黃酮粗提物制備。在乙醇濃度76%、提取溫度74 ℃、提取時(shí)間133 min及料液比1∶36（g∶mL）的條件下提取預(yù)處理后的紫斑牡丹籽粕，對(duì)總黃酮粗提物溶液進(jìn)行減壓蒸餾，干燥至恒重，獲得紫斑牡丹籽粕總黃酮粗提物。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。準(zhǔn)確稱(chēng)取10.00 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL棕色容量瓶，以濃度70%乙醇溶解并定容，即得蘆丁對(duì)照品原液（0.1 mg·mL-1）。準(zhǔn)確吸取對(duì)照樣品原液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、

4 mL和5 mL置于25 mL容量瓶，加入蒸餾水6 mL，

加入5%NaNO2溶液1 mL混勻，反應(yīng)6 min后加入10% Al（NO3）3溶液1 mL混勻，反應(yīng)6 min后加入4% NaOH溶液10 mL，以蒸餾水定容至刻度線后混勻，靜置顯色15 min并在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]。

1.4 大孔樹(shù)脂純化工藝單因素試驗(yàn)

1.4.1 大孔樹(shù)脂預(yù)處理

用3 BV的95%乙醇將選用的D101、AB-8、NKA-9 3種型號(hào)樹(shù)脂浸泡24 h，使其充分溶脹，用蒸餾水多次沖洗至流出液清澈無(wú)醇味，抽濾后封口備用[7]。

1.4.2 大孔吸附樹(shù)脂型號(hào)選擇

準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)1.4.1處理的3種型號(hào)大孔樹(shù)脂

1.0 g置于具塞錐形瓶（平行3組），各加入一定量已知濃度紫斑牡丹籽粕總黃酮粗提物溶液，振搖12 h

后取一定量濾液，測(cè)定濾液中總黃酮濃度并按公式（1）計(jì)算其吸附率；將各錐形瓶中剩余液體過(guò)濾并用適量蒸餾水對(duì)大孔樹(shù)脂進(jìn)行沖洗，吸干水分，各加入50 mL 60%的乙醇振搖12 h，過(guò)濾后取一定量濾液，測(cè)定解析液中總黃酮濃度并按公式（2）計(jì)算其解

析率[8]。

吸附率=（C0-C1）/C0×100%（1）

解析率=C2/（C0-C1）×100%（2）

式中：C0為總黃酮粗提物初始濃度，mg·mL-1；C1為吸附平衡后總黃酮粗提物濃度，mg·mL-1；C2為解析液中總黃酮粗提物濃度，mg·mL-1。

1.4.3 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附性能的考察

（1）上樣液濃度對(duì)吸附性能的影響。配制濃度分別為0.87 mg·mL-1、1.74 mg·mL-1、2.61 mg·mL-1、

3.48 mg·mL-1、4.35 mg·mL-1、5.22 mg·mL-1、

6.09 mg·mL-1、6.96 mg·mL-1和7.83 mg·mL-1的紫斑牡丹籽粕總黃酮粗提物樣品液，向盛有1.0 g AB-8型樹(shù)脂的錐形瓶中加入上述濃度樣品液各50 mL，振搖6 h后過(guò)濾，取濾液測(cè)定其總黃酮濃度，確定AB-8型樹(shù)脂的最佳吸附濃度[9]。

（2）上樣液pH值對(duì)吸附性能的影響。稱(chēng)取1.0 g AB-8型大孔樹(shù)脂置于具塞錐形瓶中，各加入濃度為5 mg·mL-1樣品溶液50 mL（平行3組），分別將各試驗(yàn)組溶液pH值調(diào)至3、4、5、6、7，振搖6 h后測(cè)定剩余液體總黃酮濃度，確定AB-8型大孔樹(shù)脂最佳上樣液pH值[9]。

（3）上樣液流速對(duì)吸附性能的影響。取一定體積AB-8型大孔樹(shù)脂濕法裝柱，上樣液濃度為

5 mg·mL-1，分別在2 BV·h-1、3 BV·h-1、4 BV·h-1、

5 BV·h-1條件下過(guò)柱，每10 mL收集一次漏液并測(cè)定總黃酮含量，確定上樣液總黃酮最佳吸附流速[9]。

1.4.4 大孔吸附樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附及解析性能試驗(yàn)

（1）動(dòng)態(tài)吸附透過(guò)試驗(yàn)。取一定量AB-8型大孔樹(shù)脂濕法裝柱，上樣液濃度為5 mg·mL-1，以

1 BV·h-1流速過(guò)柱，每20 mL收集一次漏出液，測(cè)定流出液吸光值并計(jì)算其濃度，確定其最大吸附量[10]。

（2）洗脫液濃度及用量對(duì)解析效果的影響。選用乙醇溶液作為總黃酮洗脫劑，在洗脫劑流速為

1 BV·h-1下，分別以60%、70%、80%乙醇對(duì)吸附飽和的AB-8型大孔樹(shù)脂進(jìn)行洗脫，每20 mL收集一次漏出液，測(cè)定其吸光度，確定洗脫劑最佳解析濃度及充分洗脫時(shí)洗脫劑用量。

（3）洗脫流速對(duì)解析效果的影響。用適量蒸餾水對(duì)吸附飽和的AB-8型大孔樹(shù)脂進(jìn)行沖洗，濾干水分后以70%乙醇在流速為1.0 BV·h-1、1.5 BV·h-1、

2.0 BV·h-1、2.5 BV·h-1進(jìn)行過(guò)柱洗脫，各流速層析柱每20 mL收集一次漏出液，測(cè)定其吸光度，確定AB-8型大孔樹(shù)脂最佳洗脫流速[11]。

1.5 純化工藝驗(yàn)證

基于上述單因素試驗(yàn)結(jié)果選取最佳純化工藝條件，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)定純化后紫斑牡丹籽粕總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

在510 nm處測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=8.75x+0.000 7，R2=0.999 6。

2.2 大孔吸附樹(shù)脂純化工藝

2.2.1 大孔吸附樹(shù)脂型號(hào)選擇

由表1可知，在相同條件下對(duì)各型號(hào)大孔樹(shù)脂的吸附及解析性能進(jìn)行比較，AB-8型大孔吸附樹(shù)脂吸附及解析性能優(yōu)于其余2種型號(hào)大孔吸附樹(shù)脂，故選擇AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)紫斑牡丹籽粕總黃酮進(jìn)行純化。

2.2.2 上樣液濃度對(duì)吸附性能的影響

由圖1可知，AB-8大孔樹(shù)脂吸附性能在一定范圍內(nèi)隨上樣濃度增大而增加，當(dāng)濃度過(guò)大時(shí)，由于總黃酮雜質(zhì)吸附沉積于大孔樹(shù)脂表面導(dǎo)致其吸附性能下降。當(dāng)上樣液濃度在5.22 mg·mL-1時(shí)，AB-8大孔樹(shù)脂吸附性能最佳，為考慮實(shí)際生產(chǎn)情況，最終選擇上樣液濃度為5 mg·mL-1進(jìn)行吸附。

2.2.3 上樣液pH值對(duì)吸附性能的影響

由圖2可知，上樣液pH值對(duì)大孔樹(shù)脂的吸附性能有一定影響，當(dāng)上樣液pH值為5時(shí)，AB-8大孔樹(shù)脂吸附性能最佳。

2.2.4 上樣液流速對(duì)吸附性能的影響

由圖3可知，上樣液流速對(duì)大孔樹(shù)脂的吸附性能有一定影響，當(dāng)上樣液流速為2 BV·h-1時(shí)，AB-8大孔樹(shù)脂吸附性能最佳，但考慮到實(shí)際生產(chǎn)中流速過(guò)慢會(huì)提高生成成本，最終選用上樣液流速為3 BV·h-1進(jìn)行總黃酮吸附。

2.2.5 動(dòng)態(tài)透過(guò)曲線繪制

由圖4可知，當(dāng)上樣液濃度為5 mg·mL-1，上樣液體積達(dá)到140 mL時(shí)，大孔吸附樹(shù)脂已基本吸附飽和。為減少原料浪費(fèi)并確保大孔樹(shù)脂吸附飽和，最終選用上樣液體積為150 mL（5 BV）。

2.2.6 洗脫液濃度及用量對(duì)解析效果的影響

由圖5可知，不同濃度乙醇對(duì)總黃酮洗脫作用有所差異，濃度為60%、70%、80%乙醇在用量分別為260 mL、200 mL、180 mL時(shí)總黃酮全部析出。為確保完全洗脫并考慮節(jié)省生產(chǎn)成本，最終選用濃度為70%的乙醇作為洗脫液，洗脫液用量為210 mL（7 BV）。

2.2.7 洗脫流速對(duì)解析效果的影響

由圖6可知，隨洗脫液流速增加，洗脫液對(duì)總黃酮解析效果下降，為保證解析效果及提高生產(chǎn)效率，最終選用洗脫液流速為1.5 BV·h-1對(duì)總黃酮進(jìn)行解析。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定最佳純化工藝條件為上樣液濃度為5 mg·mL-1、上樣液pH值為5、上樣液流速為3 BV·h-1、上樣液體積為5 BV條件下利用AB-8型大孔樹(shù)脂進(jìn)行吸附，以70%乙醇在流速

1.5 BV·h-1、體積7 BV條件下進(jìn)行洗脫，按照此條件進(jìn)行總黃酮純化并測(cè)定其含量，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。結(jié)果表明，純化后紫斑牡丹籽粕總黃酮含量達(dá)到32.36%。

3 結(jié)論

試驗(yàn)選擇D101、AB-8、NKA-9型3種大孔樹(shù)脂對(duì)總黃酮進(jìn)行吸附及解析，篩選出性能較好的AB-8型大孔樹(shù)脂進(jìn)行紫斑牡丹籽粕總黃酮純化工藝研究。結(jié)果表明，紫斑牡丹籽粕總黃酮在上樣液濃度為5 mg·mL-1、上樣液pH值為5、上樣液流速為3 BV·h-1、上樣液體積為5 BV條件下進(jìn)行吸附，以70%乙醇在流速1.5 BV·h-1、體積7 BV條件下進(jìn)行洗脫，紫斑牡丹籽粕總黃酮含量由8.54%提高到32.36%，該工藝安全可靠，具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，可為工業(yè)生產(chǎn)提供有效理論依據(jù)。

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