全基因組測序在食源性沙門氏菌監測中的應用

汪憶夢 于明明

基金項目：濰坊市衛生計生委科研項目計劃（WFWSJK-2021-143，WFWSJK-2022-236）。

作者簡介：汪憶夢（1989—），女，山東東營人，碩士，主管技師。研究方向：食品微生物和病原微生物檢驗。

通信作者：于明明（1983—），女，山東濰坊人，碩士，副主任技師。研究方向：食品和病原微生物檢驗。E-mail： 20932641@qq.com。

摘 要：沙門氏菌是重要的食源性致病菌，給社會帶來了嚴重的公共衛生和經濟影響。隨著高通量測序技術的發展，全基因組序列分析在沙門氏菌的監測中顯示出了極大的發展潛力和價值。本文綜述了全基因組序列分析在沙門氏菌血清型鑒定、分子分型以及耐藥研究領域中的應用前景。利用高通量測序技術與沙門氏菌抗原相關基因數據庫比對進行血清型的預測，在血清凝集方法難以確定血清型的情況下發揮重要作用。與傳統的細菌分子分型方法相比，全基因組測序技術速度更快、分辨率更高，且易于實現實驗室間比較，在公共衛生事件中可用于快速識別病原體并進行溯源分析。利用耐藥基因數據庫從基因水平上發現其攜帶的耐藥基因，結合耐藥表型進一步探索其耐藥機制。隨著高通量測序技術和生物信息技術的不斷成熟，更多的共享數據庫平臺不斷出現，全基因組序列分析將應用于更廣泛的領域。

關鍵詞：全基因組測序；食源性沙門氏菌；血清分型；分子分型；抗生素耐藥

Application of Whole Genome Sequencing for the Monitoring Foodborne Salmonella

WANG Yimeng， YU Mingming*

（Weifang Disease Control and Prevention Center Microbiology Laboratory， Weifang 261061， China）

Abstract： Salmonella is an important food-borne pathogen that is associated with serious public health and economic implications. With the development of high-throughput sequencing technology， Whole genome sequencing has shown great potential and value in the surveillance of Salmonella. The review strives to discuss the serotype identification， molecular typing and antimicrobial resistance profiles of Salmonella in Whole genome sequence and looks forward to its future. The prediction of serotypes using high-throughput sequencing technology compared with Salmonella antigen-related gene databases plays an important role in cases where serotypes are difficult to determine by serum agglutination methods. Whole genome sequencing technology is faster， higher resolution， and easy to achieve inter-laboratory comparisons than traditional bacterial molecular typing methods， and can be used for rapid identification of pathogens and traceability analysis in public health events. The drug resistance gene database is utilized to discover the drug resistance genes they carry at the gene level， and to explore their resistance mechanisms in conjunction with the drug resistance phenotype. With the continuing maturation of high-throughput sequencing and bioinformatics approaches， and the emergence of more shared database platforms， whole genome sequence analysis will be applied to a wider range of fields.

Keywords： whole genome sequence analysis; food-borne Salmonella; serotype; molecular typing; antimicrobial resistance

沙門氏菌是目前公共衛生學公認的人畜共患食源性致病菌，感染力強，血清型復雜[1]，目前已發現2 600多種血清型，其中傷寒、副傷寒沙門氏菌專性感染人類，可引起我國法定傳染病傷寒、副傷寒[2]，其他血清型宿主廣泛，可寄生在禽類和畜類等肉產品來源的養殖動物體內，也可感染人類，引起以發熱、腹痛、腹瀉等癥狀為主的急性腸胃炎、敗血癥以及其他并發癥[3]，每年全球有超過1億例腹瀉病與沙門氏菌感染有關，醫療負擔嚴重[4]。沙門氏菌腹瀉病與食用了被該菌污染的食物密切相關，世界各地每年都有大量沙門氏菌引起的食物中毒和感染的相關報道[5-6]，在我國，70%～80%的細菌性食物中毒事件是由沙門氏菌引起的[7]。世界衛生組織將沙門氏菌列為具有中等危害和嚴重危害的食源性致病菌，是世界各國重點監控的食源性致病菌[8]。

傳統的沙門氏菌檢測方法是利用沙門氏菌對膽鹽、煌綠耐受的特點，將食品或者臨床樣本進行選擇性增菌后，在選擇性平板上劃線分離沙門氏菌，然后利用沙門氏菌的生化特點進行鑒定，該方法需要5～7 d

可分離得到沙門氏菌菌株。隨著飛行質譜、核酸檢測等新技術的應用，分離周期可縮短為3～5 d。

平板劃線法成本低、用時長，可用于風險監測、菌株收集、常規食品等樣本檢測，也是公共衛生事件中得到菌株證據必不可少的手段，但需要借助其他方法對沙門氏菌進行分型、溯源、耐藥等進一步的分析。隨著高通量測序技術的發展，將病原菌整個基因組的核苷酸序列進行解讀，獲得更多的遺傳信息變為可能，在細菌病原學和流行病學研究中得到了越來越廣泛的應用[9]。本文將討論高通量測序技術及全基因序列分析在沙門氏菌監測和流行病學調查中的原理和應用，以及遇到的問題和挑戰。

1 全基因序列分析在沙門氏菌血清分型中的應用

20世紀，沙門氏菌血清分型沿用了世界衛生組織國際沙門菌協作和研究中心公布的懷特-考夫

曼-勒密諾表（White-Kauffmann-Le Minor Scheme，WKLM），是基于沙門氏菌的表面蛋白、莢膜和鞭毛等抗原與特異血清的凝集的分型方法，目前仍是沙門菌血清分型的金標準，該系統將沙門氏菌分為46個

血清群，2 659個血清型，不同血清型對人類和動物的致病性有所差異[10]。由于沙門氏菌存在自身抗原變異現象，以及抗原表達量的高低、操作人員的技術水平、主觀判斷都會影響血清凝集結果的準確性，此外商業化血清種類和質量的局限性，也導致了少數無法凝集確定血清型的現象。如果通過高通量測序和拼接獲得沙門氏菌全基因組序列，便可與已知的沙門氏菌血清型相關抗原序列比對，預測沙門氏菌血清型。隨著生物信息學的飛速發展，ZHANG等[11]公布了沙門菌抗原相關基因序列信息并建立了SeqSero數據庫平臺，目前已更新至2.0版本；YOSHIDA等[12]于2016年建立了SISTR（Salmonella in Silico Typing Resource）數據庫平臺；中國疾控中心傳染病所在已有平臺的基礎上開發優化了沙門菌血清型預測軟件SalmonSeroPredicition，用戶均可提交自己的沙門氏菌基因組序列到平臺預測血清型[13]。此外，檢索沙門氏菌基因組序列中的管家基因并在MLST數據庫中進行比對，也可進行沙門氏菌血清型預測，但由于該方法只比對了7個管家基因，且數據庫中ST型和血清型種類尚未完善，其精準程度低于全基因組SNP系統發育分析，但運行速度快，占用計算機資源少，可作為輔助手段[14]。陳丹妮等[15]將包含50種血清型的509株沙門氏菌分別用SISTR、MLS、SalmonSeroPredicition3個平臺和傳統的血清凝集方法進行結果比對，得到三者的準確率分別為96.67%、93.52%、69.16%；張璐等[16]比較了283株沙門氏菌，分別用SeqSero2.0和傳統血清凝集方法得到的血清型結果，符合率為97.6%，同ZHANG等[11]公布的98.7%相近。基于全基因組序列的沙門氏菌血清分型具有較高的應用價值，隨著數據庫和生物信息學手段的完善，將得到更廣泛的應用。

2 全基因序列分析在沙門氏菌分子分型和疾病暴發事件中的應用

傳統的細菌分子分型技術包括脈沖場凝膠電泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE）、多位點序列分型（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）、多位點序列分型（Multilocus Sequence Typing，MLST）、多位點可變數串聯重復分析（Multiple Locus Variable-number tandem repeat Analysis，MLVA）等，曾是致病菌監測、識別和溯源的標準方法，目前仍是我國國家致病菌識別網Pulsenet和食源性疾病分子溯源網絡的主要工具。這些技術對高克隆化的菌株分辨力有限，以腸炎沙門氏菌為例，85%的腸炎沙門可以歸為5個PFGE型別，難以精準分型，且操作過程煩瑣，檢測通量低[17]；常規AFLP、RFLP、MLST僅對細菌基因組中的一小部分序列進行分析，在疫情暴發監測中逐漸被基于全基因組的單核苷酸多態性分型（wgSNP）和基于全基因組的多位點序列分型（wgMLST）所取代。BAKKER等[18]在一起沙門氏菌疾病暴發事件中，將PFGE圖譜完全相同的沙門氏菌分離株，改用wgSNP分析，準確識別了暴發前后的菌株，并檢測到以往小型暴發；巴伐利亞州食品安全局利用全基因組測序分析技術，追溯了2017—2021年牛群間疫情暴發的原因，發現該事件由山區牧場來源的沙門菌引起[19]。wgMLST可對病原菌基因組上千個基因位點進行分析分型，具有比常規MLST更高的分型能力，可以區分常規MLST型別和PFGE帶型完全一致而在流行病學上不相關的菌株。與wgSNP相比，wgMLST對生物信息分析的要求較低，具有快速、標準化、高分辨的特點[20]。

3 全基因序列分析在沙門氏菌耐藥研究中的應用

患病的人和動物以及攜帶者都是沙門氏菌傳染源，抗生素是治療沙門氏菌病的首選藥物。但在畜牧產業中抗生素常被作為促生劑濫用，以及臨床治療上不規范使用抗生素，均造成了沙門氏菌的耐藥性。沙門氏菌在抗生素選擇的壓力下，可通過以下途徑產生耐藥性。①產生滅活酶、鈍化酶或修飾酶，或作用于抗生素使之失活，或修飾結合位點使藥物無法作用，如超廣譜β-內酰胺酶、頭孢菌素酶、碳青霉烯酶的產生，導致對β-內酰胺藥物的耐藥性[21]；乙酰轉移酶、腺苷轉移酶、磷酸轉移酶等修飾氨基糖苷類藥物使之鈍化[22]。②基因突變或缺失導致藥物的作用靶點的改變，使藥物不能透過細胞膜，或不能與作用靶點結合。如GyrA、GyrB基因變異導致沙門氏菌對喹諾酮類藥物敏感性降低[23]。③從整體上改變細胞膜通透性、主動外排機制、可移動的耐藥遺傳元件等，可使沙門氏菌產生多重耐藥[24]。隨著研究的進步，將有更多的耐藥機制被發現，同時沙門氏菌的耐藥也是動態變化的，對其監測具有重要意義。常規藥敏試驗采用的是美國臨床實驗室標準化委員會推薦的肉湯稀釋法，是經過細菌培養后基于表型的藥敏方法，在基因水平上，常用PCR方法檢測耐藥基因，受限于已知的耐藥基因，而通過全基因組序列分析進行耐藥分析，通量大、耗時少、準確度高，可從基因組范圍檢索更多耐藥基因，在分子水平上探索耐藥機制，結合表型實驗，研究耐藥基因的表達和調控水平。目前最常用的耐藥數據庫為ResFinder和抗生素抗性基因數據庫，張璐等[16]、暢曉輝等[25]分別對藥敏實驗結果與全基因組序列分析耐藥結果進行比對，發現耐藥基因的預測與表型基本一致，其差異之處正是需要進一步研究的契機。

4 結語

食源性沙門氏菌的監測是重要的公共衛生組成部分，也是食品風險監測、食源性疾病監測的重要內容，將全基因組序列分析應用于該領域，發揮其在暴發和溯源分析、流行病學的調查中的領先作用具有重要意義。隨著高通量測序技術的不斷發展，生物信息技術的不斷成熟，研究軟件的不斷更新迭代，全基因組序列分析將成為研究沙門氏菌分型、致病和耐藥機制等領域的常規必備手段。隨著測序技術的發展，其檢測成本不斷降低，全基因組測序將應用于更廣泛的領域。

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