月桂酸淀粉酯Pickering 乳液的制備及負載姜黃素

李佳楠，李玉鋒，王小鳳，張一凡，3，朱旻鵬，3*

（1.沈陽師范大學糧食學院，遼寧沈陽 110034；2.味之源生物科技（遼寧）有限公司，遼寧沈陽 110042；3.沈陽市糧油深加工重點實驗室，遼寧沈陽 110034）

Pickering 乳液是乳狀液中的一種，不添加表面活性劑，用固體顆粒吸附于油水界面上，形成單層或多層膜，從而起到穩定乳液的作用。相比于化學表面活性劑，天然固體顆粒穩定的Pickering 乳液具有更好的生物降解性和安全性，可廣泛應用于食品、藥品及化妝品行業[1-3]。淀粉是一種豐富、環保的天然顆粒，其中大米淀粉資源豐富，廉價易得，顆粒粒徑較小，具有制備Pickering 乳液的潛力，但由于其親水性較強，制得的Pickering 乳液穩定性較差[4]。通過酯化改性提高淀粉疏水性以提高其乳化能力是常用的方法。Wang 等[5]使用辛烯基琥珀酸酐（octenyl succinic anhydride，OSA）對不同晶型淀粉進行改性，結果表明OSA 改性顯著改善了淀粉的乳化性能。Wang 等[6]將制得的辛烯基琥珀酸酐（OSA）改性抗性淀粉用作乳化劑，制備的乳液具有良好的乳化性。Li 等[7]使用壬烯基琥珀酸酐（nonenyl succinic anhydride，NSA）對藜麥淀粉進行改性，所得中等取代度的NSA 改性藜麥淀粉在穩定Pickering乳液方面最有效。盡管部分酸酐類酯化劑可對天然淀粉進行疏水改性，但因安全性因素，其在使用上受到一定的限制。脂肪酸作為一種安全無毒的酯化劑，越來越受到研究者的重視。Mirzaaghaei 等[8]采用不同類型的脂肪酸氯化物（fatty acid chlorides，FACs）代替OSA，所得改性淀粉乳化能力與OSA 改性淀粉相似，且具有更短的反應時間，在食品中添加無限制。

月桂酸（lauric acid，LA）是一種兩親性中鏈飽和脂肪酸，對人體無毒，被列為“一般公認安全”[9]。淀粉分子與LA 酯化后，會引入疏水性LA 長鏈，兼備親水親油性，乳化性顯著提高[10]。相比傳統方法，淀粉的微波輔助改性技術可有效提高反應速度，提高反應效率，同時可以顯著改變天然淀粉的理化特性，提高其消化率，促進乳化并降低其黏度[11]。基于此，本研究以大米淀粉為原料，通過微波輔助合成月桂酸淀粉酯（lauric acid starch ester，LAS），以LAS 顆粒構建Pickering 乳液，研究乳液穩定性，對負載姜黃素的Pickering 乳液進行抗氧化性及模擬體外釋放性能分析，以評估LAS制備乳液負載姜黃素的潛力，為脂肪酸改性淀粉作為食品遞送體系提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米淀粉：安徽省聯河米業有限公司；LA：上海麥克林生化科技股份有限公司；中鏈甘油三酯（mediumchain triglycerides，MCT）、2，2′-聯氨-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽[2，2′-biamine-bis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diamine salt，ABTS]：上海源葉生物科技有限公司；人工胃液、人工小腸液：北京雷根生物技術有限公司；2，2-聯苯基-1-苦基肼基（2，2-biphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）：上海金穗生物科技有限公司；ProClean 950 抑菌防腐劑：上海碧云天生物技術股份有限公司；氘代二甲基亞砜：上海西格瑪奧德里奇貿有限公司。

1.2 儀器與設備

T25 高速均質機：德國IKA 公司；MAS-ⅡPLUS 常壓微波合成/萃取反應器：上海新儀微波化學試劑有限公司；M3000 激光粒度分析儀：英國Malwern 公司；Ascend III 500MHz 核磁共振氫譜儀：德國布魯克公司；UV-1200S 紫外分光光度計：翱藝儀器（上海）有限公司；DSA100 接觸角測量儀：德國KRUSS 公司；ZP-5B壓片機：上海天凡藥機制造廠；ZQPW-70 恒溫振蕩箱：天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 微波輔助LAS 的制備

將10 g 大米淀粉用去離子水配成濃度為45%的淀粉乳。用45 ℃乙醇將LA 和鹽酸溶解，其中LA 用量為大米淀粉干基的4%、5%、6%、7%和8%，鹽酸用量為大米淀粉干基的0.06%、0.08%、0.10%、0.12%和0.14%，將LA 乙醇溶液加入到制備好的大米淀粉乳中，置于微波反應器中分別在400、500、600、700、800 W 功率下反應10、15、20、25、30 min（反應期間保持機械攪拌），得到LAS。反應結束后，淀粉酯用熱乙醇反復洗滌，至洗滌液用AgNO3檢測不產生白色沉淀為止。最后將淀粉酯于45 ℃烘干后粉碎過80 目篩，常溫下密封保存。

1.3.2 取代度測定

參考陳海龍[10]的方法并稍作修改。在250 mL 錐形瓶中加入1.2 g LAS、3 mL 無水乙醇和70 mL 去離子水，沸水浴中充分混勻20 min 后，隨即加入7 mL 0.25 mol/L的NaOH 溶液，攪拌1 h。滴入2～3 滴酚酞指示劑直至液體顏色變為粉紅色，將其搖晃均勻，用0.1 mol/L 的標準HCl 溶液滴定至粉紅色剛好消失，記錄消耗的鹽酸體積V1（mL）?？瞻滓栽竺椎矸圩鲗φ?，其余條件不變，記錄消耗的鹽酸體積V0（mL）。按下列公式計算脂肪酸淀粉酯的取代度（D）。

式中：162 為葡萄糖酐單元（anhydroglucose，AGU）的分子量，g/mol；183 為月桂酸酰基的分子量，g/mol；m為月桂酸淀粉酯樣品質量，g；c為鹽酸標準溶液的濃度，mol/L。

1.3.3 顆粒粒徑測定

制備濃度為2% 的淀粉酯溶液，通過激光粒度分析儀測定顆粒的粒徑大小。測定參數：顆粒折射率為1.590，分散劑為水，分散劑的折射率為1.330。

1.3.4 核磁共振氫譜測定

取適量的LAS 溶于氘代二甲基亞砜中，光譜在500 MHz、60 ℃下獲得，脈沖角30°，延遲時間10 s，采集時間2 s。

1.3.5 顆粒三相接觸角測定

參考Zhang 等[12]的方法。使用壓片機將凍干粉末壓成直徑13 mm、厚度2 mm 的薄片放置于接觸角測量儀上，使用注射器將一滴去離子水輕輕滴入薄片表面，使用接觸角測量儀的高速攝像機以每秒10 幀的速率記錄液滴形狀的演變，利用OCA 20 軟件將水滴的輪廓數據自動擬合到拉普拉斯-楊方程中，以確定接觸角。

1.3.6 Pickering 乳液的制備

以一定濃度的LAS 水溶液作水相，中鏈甘油三酯（medium-chain triglycerides，MCT）作油相，將油相水相混合，使用高速均質機在轉速13 000 r/min 下均質2 min，得到乳液，于乳液中加入ProClean 950 抑菌防腐劑以防止微生物生長，室溫下保存。

1.3.7 Pickering 乳液乳化指數測定

將制備好的Pickering 乳液放置于帶有刻度具塞試管中，觀察室溫下Pickering 乳液，通過乳化指數來表征乳液的穩定性，乳化指數（E，%）按下列公式計算。

式中：H0為乳化層體積，mL；H為乳液總體積，mL。

1.3.8 乳液穩定性

1.3.8.1 LAS 添加量對Pickering 乳液穩定性的影響

選取取代度為0.016 7 的LAS 為乳化劑，MCT 為油相，油相體積為50%，LAS 添加量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%，以1.3.6 方法制備乳液，記錄不同時間的乳化指數。

1.3.8.2 油相體積對Pickering 乳液穩定性的影響

選取取代度為0.016 7 的LAS 作為乳化劑，MCT做油相，LAS 添加量為2.0%，油相體積分別取20%、30%、40%、50%、60%、70%，以1.3.6 方法制備乳液，記錄不同時間的乳化指數。

1.3.8.3 LAS 的取代度對Pickering 乳液穩定性的影響

選取不同取代度（0.012 1、0.014 7、0.015 1、0.016 7）的LAS 作為乳化劑，MCT 作為油相，油相體積為50%，LAS 添加量為2.0%，以1.3.6 方法制備乳液，記錄不同時間的乳化指數。

1.3.9 抗氧化性測定

1.3.9.1 負載姜黃素Pickering 乳液的制備

將一定量姜黃素溶于適量MCT 中，8 000 r/min 離心5 min，上清液作油相。油相體積為60%，LAS 顆粒（取代度0.016 7）添加量為2.5%，其余方法同1.3.6，得到姜黃素Pickering 乳液。

1.3.9.2 DPPH 自由基清除率的測定

配制濃度為0.2 mmol/L DPPH 乙醇溶液，將姜黃素Pickering 乳液按不同添加量（0.1、0.2、0.3 mL 和0.4 mL）與2 mL DPPH 乙醇溶液充分混合，避光反應30 min，反應結束后，將測試樣品于517 nm 波長下測量吸光度A，用無水乙醇作對照，測量其吸光度A0。DPPH 自由基清除率（R，%）計算公式如下。

1.3.9.3 ABTS+自由基清除率的測定

將7 mmol/L 的ABTS 溶液和2.45 mmol/L 過硫酸鉀溶液等體積混合，避光反應12 h 制得ABTS 溶液。使用前用乙醇稀釋ABTS 溶液，使其在734 nm 處的吸光度為0.70±0.02。將姜黃素Pickering 乳液按不同添加量（30、40、50、60 μL）與4 mL ABTS 溶液充分混合，避光反應30 min，反應結束后，將待測樣品置于734 nm 處測定其吸光度A，用無水乙醇作對照，其測量吸光度A0。ABTS+自由基清除率（Q，%）計算公式如下。

1.3.10 姜黃素乳液體外消化測定

1.3.10.1 姜黃素包埋率測定

包埋率參考Zeng 等[13]的方法稍作修改。將姜黃素乙醇溶液配制成不同濃度梯度標準液進行標準曲線的繪制（Y=0.156 8X+0.009 5，R2=0.999 6），其中X和Y分別對應姜黃素濃度和吸光度。將一定量姜黃素溶于MCT 中用作油相，取10 mL 油相用無水乙醇稀釋100 倍，于425 nm 波長下測定吸光度，結合標準曲線計算油相中姜黃素的含量m0（mg）；另取9 mL 油相以1.3.9.1 方法制備乳液，收集10 mL 姜黃素乳液并加入3 mL 無水乙醇于恒溫振蕩箱中以200 r/min 振蕩5 min進行破乳，以8 000 r/min 的速度離心10 min，收集上清液并用無水乙醇稀釋100 倍，紫外分光光度計于425 nm 波長下測量吸光度，計算乳液中姜黃素的含量m（mg），空白用水代替乳液。根據以下公式計算包埋率（P，%）。

1.3.10.2 姜黃素乳液體外模擬消化

參考吳唯娜等[14]的方法并作修改。模擬胃消化：姜黃素Pickering 乳液與人工胃液等體積混合，調節混合液的pH 值為2，置于37 ℃恒溫振蕩箱中以100 r/min的速度連續振蕩2 h，在不同時間段（0、30、60、90、120 min）取消化液以10 000 r/min 的速度離心分離10 min，取上清液并記錄體積。取5 mL 上清液與5 mL 無水乙醇渦旋混勻1 min，用紫外分光光度計在418 nm 處測混合液吸光度，根據標準曲線（Y=0.156 8X+0.009 5，R2=0.999 6）計算姜黃素含量，以得出姜黃素釋放量。模擬腸消化：將姜黃素Pickering 乳液與人工腸液等體積混合，調節pH 值為7，后續操作與模擬胃消化步驟相同，測定姜黃素含量。姜黃素釋放率（C，%）的計算公式如下。

式中：A為最初添加到消化系統中的姜黃素的量，mg；A1為消化過程中不同時間下的姜黃素的量，mg。

1.4 數據分析

本研究試驗重復測定3 次，采用SPSS 25 軟件處理試驗數據并進行數據分析；采用Origin 2021 軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 取代度對LAS 粒徑的影響

圖1 為不同取代度LAS 顆粒的粒徑分布。

由圖1 可知，不同取代度的LAS 粒徑大多分布在10 μm 左右，還有部分顆粒分布在45 μm 左右，呈雙峰分布，這可能是由于原淀粉中含有A 型淀粉（直徑＞10 μm）和B 型淀粉（直徑≤10 μm）[15-16]，與LA 發生酯化反應時均被引入疏水性長鏈。月桂酸淀粉酯的顆粒粒徑隨著取代度的增加而增加，說明引入更多疏水基團導致LAS 粒徑變大。當取代度為0.014 7 時，LAS 顆粒的體積平均直徑（D4，3）為21.30 μm，平均粒徑（D50）為10.30 μm，取代度為0.016 7 時，D4，3為21.90 μm，D50為10.75 μm，取代度對LAS 粒徑的影響并不明顯，這可能是因為所選LAS 顆粒樣品的取代度都較低。

2.2 核磁共振氫譜分析

圖2 為LAS 的核磁共振氫譜圖。

圖2 LAS 的核磁氫譜圖Fig.2 Nuclear magnetic hydrogen spectrum of lauric acid starch ester

由圖2 可知，化學位移2.49 和3.30 處有較強峰出現，分別為DMSO-d6的質子峰和殘留的H2O 的質子峰，化學位移5.5、5.4、5.1 和4.5 的為原大米淀粉的OH-3、OH-2、H-1 和OH-6 的4 個質子峰，化學位移3.6 附近的吸收峰為原大米淀粉的H 質子峰[17]。當LA 和大米淀粉發生酯化反應時酯化鏈上的甲基末端會存在3 個質子，化學位移0.8 處的峰是月桂?；┒思谆鶜洌℉-10）的質子峰、酰基上殘余氫（H-9）的質子峰位于化學位移1.2 附近、1.05 的吸收峰是其他亞基基團的氫核吸收峰[18]，在化學位移0.8～2.2 之間存在的吸收峰說明淀粉與LA 發生了酯化反應。

2.3 顆粒接觸角分析

研究表明，固體顆粒的三相接觸角越接近90°，乳化性能越好，同時，固體顆粒從油水界面脫離所需要的能量就越高，制得的乳液穩定性越好[19]。大米淀粉及LAS 的接觸角見圖3。

圖3 大米淀粉及LAS 的接觸角Fig.3 Contact angle of rice starch and lauric acid starch ester

由圖3 可知，A 為原大米淀粉，接觸角θ為53.0°，B、C 分別是取代度0.014 7、0.016 7 的LAS 顆粒，接觸角θ分別為80.2°、83.0°，隨著LAS 取代度的增加，顆粒接觸角也增大，接近90°。結果表明引入月桂酸疏水基團后大米淀粉的疏水性能明顯改善。

2.4 Pickering 乳液穩定性分析

2.4.1 LAS 添加量對Pickering 乳液穩定性的影響

圖4 為不同LAS 添加量對Pickering 乳液穩定性的影響。

圖4 不同LAS 添加量對Pickering 乳液穩定性的影響Fig.4 Effect of the amount of lauric acid starch ester on the stability of Pickering emulsion

由圖4 可知，LAS 在添加量為1.0%～3.5% 的條件下，均能形成一定體積的乳液，乳液體積隨LAS 添加量的增加而增大，表現出良好的乳化能力。1 d 后可以明顯看出隨著LAS 添加量的增加，乳化層體積逐漸變大，儲存15 d 后，乳液體積略有降低，乳液表現出較強的穩定性，LAS 添加量越大，乳液穩定性越強。這說明LAS 顆粒形成Pikcering 乳液需要滿足一定數量要求，足量的LAS 可吸附在油水界面，形成物理屏障，維持乳液穩定性。

2.4.2 油相體積對Pickering 乳液穩定性的影響

不同油相體積對Pickering 乳液穩定性的影響見圖5。

圖5 不同油相體積對Pickering 乳液穩定性的影響Fig.5 Effect of oil phase volume on the stability of Pickering emulsion

由圖5 可知，當油相體積從20%增加到60%時，乳化層體積不斷增加，乳液乳化指數增大，15 d 后均表現出較好的穩定性。如圖5B 所示，當油相體積增加到70% 時，有較多的油相析出，無法形成穩定的乳液。其中，油相體積為60%時，形成乳液的體積最大，乳化指數為80%，此時的油水比最佳。這說明LAS 構建Pickering 需要合適的油水相比，過高和過低均不利于乳液的形成和穩定，這與田亞超[20]的研究結果類似。

2.4.3 LAS 取代度對Pickering 乳液穩定性的影響

LAS 取代度對Pickering 乳液穩定性的影響見圖6。

圖6 LAS 取代度對Pickering 乳液穩定性的影響Fig.6 Effect of degree of substitution of lauric acid starch ester on the stability of Pickering emulsion

由圖6 可知，不同取代度LAS 穩定的Pickering 乳液的乳化指數相差不大，這可能是由于LAS 樣品取代度差異不明顯。隨著儲藏時間的延長，乳化指數均不同程度的降低，取代度越大，其制備的乳液乳化穩定性越好[21]。當取代度為0.016 7 時，1 d 后乳液乳化指數為73.76%，15 d 后乳化指數仍為73%，表現出良好的穩定性。這可能是由于取代度提高增強了LAS 顆粒的疏水性，使LAS 顆?？梢愿€定地吸附于油水界面，從而增強乳液的穩定性，這與顆粒三相接觸角的結果一致。

2.5 姜黃素乳液抗氧化性分析

2.5.1 DPPH 自由基清除率

姜黃素具有抗氧化功能，是對人體健康非常重要的多酚。但是由于其不易溶于水且本身極易受環境影響而降解，使得姜黃素在人體中的生物利用率降低，因此使用乳液對其進行包埋可有效提高此類活性物質的利用率[22]，將姜黃素嵌入Pickering 乳液中，可以有效提高其在消化液中的分散性，同時乳液液滴周圍的緊密界面可隔離空氣，對姜黃素起到屏障保護作用[23]。

本研究由LAS 制備的Pickering 乳液中姜黃素包埋率達68.00%。DPPH 自由基與抗氧化劑發生反應轉移電子，從而清除自身自由基。通過測量DPPH 溶液的吸光度變化，可以評估待測物質對DPPH 自由基的清除能力，進而體現其抗氧化能力[24]。不同Pickering乳液用量對DPPH 自由基的清除作用見圖7。

圖7 不同Pickering 乳液用量對DPPH 自由基的清除作用Fig.7 Scavenging of different Pickering emulsions against DPPH free radical

由圖7 可知，LAS 制備的姜黃素Pickering 乳液具有清除DPPH 自由基的能力，隨著乳液添加量的增加，LAS 制備的乳液DPPH 自由基清除率從41.98% 增加到87.08%，乳液表現出較好的抗氧化活性，此結果與Li 等[25]的研究結果一致。

2.5.2 ABTS+自由基清除率

由于單一方法無法真正評估乳液抗氧化性，且DPPH 法反應時間較長，為了更加準確評價姜黃素乳液的抗氧化性，使用了ABTS+自由基清除法評價姜黃素Pickering 乳液的抗氧化性[26]。不同Pickering 乳液的添加量對ABTS+自由基的清除作用見圖8。

圖8 不同Pickering 乳液的添加量對ABTS+自由基的清除作用Fig.8 Scavenging of different Pickering emulsions against ABTS+free radical

由圖8 可知，隨著乳液添加量的增加，LAS 制備的乳液ABTS+自由基清除率從46.06% 增加到85.62%。因此，由LAS 制備的姜黃素Pickering 乳液對DPPH 自由基和ABTS+自由基均有清除作用，這可能因為DPPH和ABTS+自由基等疏水自由基與姜黃素分子的疏水區域相互作用，隨著乳液中姜黃素含量的增加，相互作用也在增加，從而增強對自由基的清除能力[27]。

2.6 體外消化分析

經過消化的乳液可以逐漸釋放姜黃素，使姜黃素在胃腸道里發揮抗氧化、抗炎等功能[28]，同時姜黃素的釋放速率可在一定程度上反映乳液在不同條件下對疏水性功能物質的遞送能力。姜黃素乳液在胃腸液中姜黃素釋放率見圖9。

圖9 姜黃素乳液在胃腸液中的姜黃素釋放率Fig.9 Release of curcumin emulsion in gastrointestinal fluid

由圖9 可知，在胃液消化和腸液消化的條件下，前30 min，乳液對姜黃素的釋放均存在突釋現象，這可能是由于附著于LAS 顆粒表面的姜黃素迅速釋放。胃液消化階段，30 min 以后姜黃素釋放速度減慢，這是由于乳液內部的姜黃素開始緩慢釋放[29]，Pickering 乳液在消化時間為90 min 時姜黃素釋放率為54.51%。當胃部消化120 min 時，LAS 制備的Pickering 乳液中姜黃素的釋放率達到最大，為70.37%。在腸液中，隨著消化時間的延長，姜黃素的釋放量逐漸增加，在前60 min 時，姜黃素釋放速率較大，釋放率為60.85%，60 min 后姜黃素釋放速度較慢，在120 min 時，姜黃素釋放率為78.09%。姜黃素Pickering 乳液在腸液中的釋放率高于胃液中的釋放率，這主要是由于環境pH 值的改變，導致腸液中乳液破乳較嚴重，使得姜黃素釋放速度加快。

3 結論

LA 與大米淀粉酯化后，能顯著提高顆粒疏水性，形成穩定的水包油型Pickering 乳液。乳液穩定性受LAS 取代度、添加量和油相體積影響。使用取代度為0.016 7 的LAS，添加量為3.5%、油相體積為60%時制備的乳液最為穩定，儲存15 d 后仍能保持較高乳化穩定性。LAS 構建的Pickering 乳液可負載姜黃素，其包埋率為68.00%，姜黃素Pickering 乳液對DPPH 和ABTS+自由基均有較強的清除能力，隨著清除率隨乳液用量的增加而增加，對DPPH 自由基清除率為87.08%，ABTS+自由基清除率為85.62%，表現出良好的抗氧化特性。模擬胃腸消化結果表明，Pickering 乳液包封姜黃素可在胃部和腸道有效釋放，前30 min 存在突釋現象，隨后釋放速度降低，胃中的釋放率低于腸道，120 min時的釋放率分別為70.37%、78.09%，證明淀粉月桂酸酯制備的Pickering 乳液可作為遞送疏水性功能物質姜黃素的有效系統。本研究為豐富淀粉脂肪酸酯的應用、構建新型食品級功能物質乳液遞送系統提供了理論依據。