芹菜IDF 與多菌群益生菌連續共培養的培養物特性

楚京嬴，呂嘉櫪*，高捷，楊柳青

（1.陜西科技大學食品科學與工程學院，陜西西安 710021；2.陜西巨子生物技術有限公司，陜西西安 710077）

益生菌是當攝入足夠數量時能給宿主帶來有益健康影響的活的微生物[1]，益生菌膳食補充劑已成為膳食補充劑（dietary supplement）中最重要的種類之一[2-5]。益生菌膳食補充劑中益生菌的活性是評價其質量的重要指標，提高益生菌的活性通常是通過提高其菌體濃度的方法來實現。富集微生物是提高菌體濃度的一種有效方法，其中的生物膜法富集微生物，具有菌體濃度高、活性強、穩定性好等優勢，因此在食品與醫藥等領域的研究與應用越來越受到關注[6]。

生物膜是指依附于載體材料的特殊微生物聚集體，是由高度密集的微生物組成的生態系統[7]。自然界中大多數微生物都以生物膜的形式存在[8]，生物膜富集技術通過微生物與載體材料間的弱相互作用而黏附到載體表面，微生物大量聚集形成生物膜，在流動過程中通過膜富集在載體表面及內部的孔隙來截留微生物，菌體與載體發生共聚集不斷黏附到載體表面，從而達到富集效果[9]。張國麗等[10]研究發現，植物乳桿菌PF3-1 生物膜形成過程中菌活性顯著提高。Speranza等[11]研究了4 株益生菌在不銹鋼材料上形成的生物膜特性，結果表明4 株益生菌在不銹鋼材料上均能富集形成生物膜。浦明珠等[12]利用椰果表面的乳酸菌生物膜對牛乳發酵，發現其對牛奶pH 值的降低速率明顯高于游離乳酸菌組，且發酵終點時的活菌數也高于游離乳酸菌組。陳翠翠等[13]在振蕩培養下，比較了雙歧桿菌在6 種植物基水不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）中成膜的情況及生物膜特性，結果發現雙歧桿菌在葡萄籽IDF 上成膜效果最好，存活率較游離菌株提高4～6.5 倍，模擬胃液耐受性存活率為59.82%，模擬腸液耐受性存活率為13.53%。檀利軍等[14]研究發現，不同種類的益生菌混合培養過程中存在一定的調控因素，混合培養這些益生菌形成的生物膜特性優于單菌。薛勝平等[15]通過模擬腸道環境，選用5 株益生菌，以玉米IDF 為載體，連續培養12 d，發現接入的5 種菌均可穩定共存，掃描電鏡觀察到5 種菌均在玉米纖維上形成了生物膜。瑪依諾·木圖拉等[16]以不銹鋼網布為載體，使嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌在其表面形成混菌生物膜，該混菌生物膜對酸和高溫具有更高的抗性。目前，有關生物膜法富集益生菌方面的研究尚處于起步階段，其中選用的載體至關重要，一般應符合以下條件[17]：具有較大表面積且不影響細胞的生物活性，有利于微生物的黏附，不易被水解，不影響微生物間信號分子的交流和營養物質的傳遞，應為食品級等。

膳食纖維被稱為“第七大營養素”，是平衡膳食結構的必須營養素之一[18]，在益生菌膳食補充劑研制中，膳食纖維不僅可以作為必須營養素的來源，還可作為保護益生菌的微膠囊壁材[19-21]。目前與益生菌復合的膳食纖維多為谷類、低聚糖類或非食品級材料等，水不溶性膳食纖維（IDF）是易獲得的可食性天然食物來源，表面粗糙、比表面積大、有穩定的網狀結構等，不僅具有強的持水力、吸附力、抗氧化、改善便秘等生理功能，而且是富集益生菌的理想載體，對益生菌活性有很好保護作用。

芹菜是一種常見的蔬菜，來源廣泛，產量高，且含有大量的膳食纖維。芹菜中的IDF 含量為59.4%，高于大部分蔬菜[22]；芹菜IDF 主要包括纖維素、半纖維素、木質素和殼聚糖等[23]，結構中維管束大量密集，呈絲狀，其表面粗糙，有大量管狀空腔，比表面積大，利于菌體附著。芹菜IDF 還具有增加飽腹感、有助減肥、減輕水腫、降低血壓和血脂等功效[24]。

綜上，本文利用生物膜富集微生物的原理，以芹菜IDF 為載體，5 株益生菌為菌株，MRS 為營養液，通過自主設計的富集培養裝置，使芹菜IDF 上富集多菌群益生菌，形成富含芹菜IDF 與多菌群益生菌的生物膜培養物，并對其活菌數、菌群結構、代謝物組成、對消化液的耐受性以及抗氧化活性等特性進行分析，以期為進一步研制活性高、功能性強的益生菌與蔬菜膳食纖維有機復合型膳食補充劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

保加利亞乳桿菌LactobacillusbulgaricusG302（Lb G302）、植物乳桿菌L.plantarumG304（Lp G304）、副干酪乳桿菌L.paracaseiG305（Lcp G305）、鼠李糖乳桿菌L.rhamnosusG306（Lr G306）、嗜熱鏈球菌Streptococcus thermophilusQ305（St Q305）：陜西科技大學食品科學與工程學院微生物室提供；芹菜：市售；MRS 肉湯培養基、瓊脂粉（生物試劑）：北京奧博星生物技術有限公司；無水乙醇、戊二醛、鄰苯二甲醛、濃鹽酸、磷酸二氫鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉、尿素、尿酸、硫酸鈉、氰化鉀、磷酸二氫鉀（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）、黏蛋白、α-淀粉酶（3 700 U/g）、胃蛋白酶（豬胃黏膜）（3 000 U/g）、胰酶（生物試劑）（4 000 U/g）：上海源葉生物科技有限公司；DNA 抽提試劑盒、E.Z.N.A.?Soil DNA Kit：美國Omega Bio-Tek 公司；建庫試劑盒、NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit：美國柏爾生物技術公司；DNA 測序試劑盒、NovaSeq Reagent Kits：美國Illumina 公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：美國Fisher Chemical 公司；甲酸（色譜純）：德國CNW 公司。

1.2 儀器與設備

UV-2600 紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；SHA-B 恒溫水浴振蕩器：常州國華電器有限公司；HC-3018R 高速冷凍離心機：安徽中科中佳儀器有限公司；DSX-280A 高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠有限公司；PHENOM-PRO 臺式掃描電鏡：上海飛納儀器有限公司；Illumina Miseq 測序儀：美國Illumina 公司；UHPLC -Q Exactive HF-X 超高效液相色譜串聯傅里葉變換質譜儀：美國Thermo Scientific 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 芹菜IDF 的制備

將芹菜洗凈，切段，按料水比1∶1（g/mL）打漿1 min 后得漿液，漿液過200 目的濾網使芹菜渣與芹菜汁分離，得到芹菜汁和芹菜渣，分離出的芹菜渣即為芹菜IDF。

1.3.2 富集培養裝置的設計

富集培養裝置如圖1 所示。

圖1 芹菜IDF 富集培養多菌群益生菌的培養裝置Fig.1 Celery IDF enrichment culture multi-probiotics culture device diagram

如圖1 所示，富集培養裝置主要包括兩個部分：發酵罐和內置的分室培養支架。發酵罐上設置了發酵罐蓋、進液口、取樣口和出液口，發酵罐蓋上設有螺口，分室培養支架上設有螺桿。分室培養支架可以將富集后的不同益生菌芹菜IDF 分隔開，以便同時獲得不同菌體與芹菜IDF 生物膜培養物，通過旋轉發酵罐蓋可在發酵罐側面的取樣口取不同室內的樣品。富集培養具體操作步驟如下。

滅菌：將發酵罐、分室培養支架于滅菌鍋中121 ℃、15 min 滅菌處理。接種：將選取的5 種益生菌分別以1%接種量接種于裝有MRS 液體培養基和芹菜IDF 的藍口瓶中培養36 h，過濾得到含有5 種不同益生菌的芹菜IDF，然后將其分別放入分室培養支架的5 個分室內，按罐體容積80%加入MRS 培養液，置于恒溫培養箱37 ℃連續動態培養7 d，每隔1 d 更換罐內的MRS 培養液。富集培養：富集培養過程中，于0、1、2、3、4、5、6、7 d 在發酵罐的取樣口取各菌復合培養物，混勻，6 000 r/min 離心10 min，棄上清液，獲得益生菌與IDF 的復合培養物，測定其活菌數，采用高通量測序技術（16S rDNA）對培養物的細菌V3～V4 區進行測序，同時對0、3、7 d 的各菌復合培養物進行代謝組學分析。

1.3.3 芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養物對模擬消化液耐受性

參考文獻[25]方法制備模擬消化液。以培養7 d的多菌群益生菌與芹菜IDF 復合培養物為試驗組，以5 株單菌與芹菜IDF 培養7 d 的培養物為對照組。在模擬口腔消化液中37 ℃恒溫水浴振蕩器中培養0、10 min；在模擬胃消化液中37 ℃恒溫水浴振蕩器中培養0、1、2、3 h；在模擬腸消化液中37 ℃恒溫水浴振蕩器中培養0、2、4、6 h，分別測活菌數。

1.3.4 芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養物的抗氧化活性

以培養7 d 的多菌群益生菌與芹菜IDF 的復合培養物為試驗組，以芹菜IDF 為一個對照組，以5 株單菌與芹菜IDF 培養7 d 的培養物為另一個對照組，分別測定3 組對DPPH 自由基的清除率。

1.4 檢測方法

1.4.1 益生菌活菌數量檢測

參考GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》[26]檢測益生菌活菌數量。

1.4.2 顯微表征

參考文獻[27]方法，進行掃描電鏡顯微觀察。

1.4.3 芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養物菌群結構分析

無菌條件下收集0～7 d 的芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養物，置于離心管中，液氮速凍。在干冰中送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，通過高通量測序技術（16S rDNA）對培養物的細菌V3～V4 區進行微生物多樣性測序。

1.4.4 芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養物代謝組學分析

1.4.4.1 樣本的制備

取200 μg 樣本于2 mL 離心管中，加入一顆直徑6 mm 的研磨珠。用400 μL 提取液（甲醇∶水=4∶1，體積比）含0.02 mg/mL 的內標（L-2-氯苯丙氨酸）進行代謝產物提取。樣本溶液于冷凍組織研磨儀-10 ℃、50 Hz研磨6 min 后，低溫超聲提取30 min（5 ℃、40 kHz）。將樣品于-20 ℃靜置30 min，離心15 min（4 ℃、13 000×g），移取上清液至微量進樣瓶中進行上機分析。此外，取等體積的所有樣本代謝物混合制備成質控樣本（quality control，QC），在儀器分析過程中，每5～15 個樣本中插入一個QC 樣本，以考察整個分析過程的重復性。

1.4.4.2 液相色譜-串聯質譜法（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）測試條件

1）色譜條件：2 μL 樣本經HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm）分離后進入質譜檢測。流動相A 為95%水+5%乙腈（含0.1%甲酸），流動相B 為47.5%乙腈+47.5%異丙醇+5%水（含0.1%甲酸）。柱溫為40 ℃。

2）質譜條件：樣品質譜信號采集采用正負離子掃描模式，質量掃描范圍m/z 70～1 050。鞘氣流速為50 psi（1 psi=6 895 Pa），輔助氣流速為13 psi，輔助氣加熱溫度為425 ℃，正模式離子噴霧電壓設置為3 500 V，負模式離子噴霧電壓設置為-3 500 V，離子傳輸管溫度為325 ℃，歸一化的碰撞能為20V-40V-60 V 循環碰撞能。一級質譜分辨率60 000，二級質譜分辨率7 500，采用數據依賴性采集模式采集數據。

1.4.5 芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養物對消化液耐受性的檢測

參照文獻[25]的檢測方法測定消化液耐受性。

1.4.6 DPPH 自由基清除率的測定

參照文獻[28]的方法測定DPPH 自由基清除率。

1.5 數據處理

芹菜IDF 與多菌群益生菌富集培養活菌數的分析使用OriginPro 9.0 軟件。芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養物對消化液的耐受性、抗氧化活性以及對DPPH 自由基清除率分析使用GraphPad Prism 8 軟件。

采用液相色譜-串聯質譜法分析，使用超高效液相色譜串聯傅里葉變換質譜UHPLC-Q Exactive HF-X 系統進行高分辨非靶向代謝組學分析。將原始數據導入代謝組學處理軟件Progenesis QI 進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊，最終得到一個保留時間、質荷比和峰強度的數據矩陣，同時將MS 和MSMS 質譜信息與人類代謝組學數據庫（Human Metabolome Database，HMDB）和Metlin 以及測試公司自建庫進行匹配，得到代謝物信息。

對預處理后的矩陣文件進行差異分析，R 軟件包ropls（Version1.6.2）進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最二乘判別分析法分析（partial leastsquares discrimination analysis，PLS-DA），篩選芹菜IDF 與多菌益生菌不同培養階段的差異代謝物，篩選的標準為VIP＞1 且差異顯著性檢驗結果P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 富集培養過程中芹菜IDF 上活菌數的變化

芹菜IDF 富集培養多菌益生菌過程中5 株益生菌（Lb G302、Lp G304、Lcp G305、Lr G306 和St Q305）在芹菜IDF 上活菌數的變化如圖2 所示。

圖2 芹菜IDF 富集培養多菌群益生菌過程中IDF 上活菌數的變化Fig.2 Change of viable count on IDF in celery IDF enrichment process of multi-probiotics

如圖2 所示，在0～24 h，芹菜IDF 上的活菌數迅速上升，培養24～120 h，芹菜IDF 上的菌體濃度保持緩慢上升趨勢，120 h 時活菌數最高可達到7.5×1013CFU/g，之后IDF 上的活菌數目開始出現下降，因為生物膜形成一定厚度后，會自動脫落。

2.2 富集培養過程中芹菜IDF 的顯微表征

富集培養過程中，對富集了5 種不同菌株的芹菜IDF 進行掃描電鏡的顯微表征，培養0 d 和培養7 d 時的掃描電鏡圖如圖3 所示。

圖3 5 種菌培養0 d 和7 d 時芹菜IDF 的掃描電鏡圖（2 000×）Fig.3 Scanning electron microscope images of celery IDF after 0 d and 7 d of cultivation with five strains（2 000×）

圖3 顯示，在富集培養7 d 時，5 種益生菌的菌體均在芹菜IDF 表面或空腔內富集，形成了具有一定厚度的生物菌膜。

2.3 富集培養過程中菌群結構的變化

在富集培養0～7 d 過程中，菌群結構在屬水平上的物種相對豐度變化如圖4 所示。

圖4 屬水平上的物種相對豐度Fig.4 Relative abundance of the species at the genus level

由圖4 可知，整個富集培養過程中，在屬分類水平上，芹菜IDF 上的細菌主要由乳桿菌屬（Lactobacillaceae）和鏈球菌屬（Streptococcaceae）組成，且乳桿菌屬在整個培養過程中占據主導地位。乳桿菌屬0～7 d 中的豐度依次為82.58%、96.48%、99.27%、99.92%、99.93%、99.93%、99.96%、99.95%，鏈球菌屬依次為17.23%、3.49%、0.72%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.04%，其結果與加入的菌群結構一致。

2.4 富集培養過程中代謝組學分析

2.4.1 PCA 分析

富集培養過程中，采集0、3、7 d 時的培養物，進行代謝組學分析，其PCA 結果如圖5 所示。

圖5 培養物的PCA 模型得分圖Fig.5 PCA model score plots of the cultures

通過對0、3、7 d 3 組樣本分別進行主成分分析，判斷芹菜IDF 與多菌群益生菌富集培養0、3、7 d 的3 組樣本間以及組內6 個樣本間的變異度大小。如圖5 所示，PC1 為49.50%，PC2 為18.40%，累計貢獻率達67.90%。其中，3 組樣本間出現明顯的分離，表明不同培養時間段多菌群益生菌具有不同的代謝特征。此外，3 組樣本內的6 個重復樣本聚集程度較好，表明組內每個重復樣本的代謝物差異較小。

在樣本組間代謝差異較小時，由于PCA 分析無法很好地分離組間樣本，需采用偏最二乘判別分析法（partial leastsquares discrimination analysis，PLS-DA）建立代謝物表達量與樣本之間的關系模型，使各組樣本間的區分最大化，從而更好地確立樣本關系。根據PLS-DA 模型對1 468 個代謝組數據進行分析，結果如圖6 所示。

圖6 培養物的PLS-DA 模型得分Fig.6 PLS-DA model scores of the cultures

如圖6 所示，PLS-DA 得到2 個主成分，主成分1的貢獻率為35.14%、主成分2 的貢獻率為23.73%。3 組樣品的區分效果非常明顯，0 d 樣本分布在置信區間的右側，3 d、7 d 樣品分布在置信區間的左側，表明多菌群益生菌在培養后期代謝物的變化程度相對于培養前期較小。

在3 組樣本中，共檢測出了1 468 個代謝物，代謝物主要為脂類、肽類、碳水化合物、核酸、有機酸、維生素和輔酶因子等。其中培養0 d 時樣本中有1 432 個代謝物，3 d 樣本中有1 432 個代謝物，7 d 樣本中有1 398 個代謝物。

2.4.2 差異代謝物分析

0、3、7 d 時芹菜IDF 與多菌益生菌培養物差異代謝物的分析結果如圖7 所示。

圖7 多組間差異代謝物的比較分析Fig.7 Comparative analysis of differential metabolites between multiple groups

圖7 表明，3 組樣本中，有16 個差異高度顯著的代謝物，分別是norerythromycin、9，10，13-三羥基-11-十八碳烯酸、山梨醇、肉桂酸、乙酰基-絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸、Val-Leu-Pro-Val-Pro、2-（5-tetradecenyl）cyclobutanone、硫辛酰賴氨酸、苯乳酸、己胺、Simonin IV、2-羥基丁酸、L-山梨糖、3-氨基戊二烯酸、蘋果酸和正亮氨酸。差異極顯著的代謝物有1 個為3-O-原兒茶酰頭孢酸，差異顯著的代謝物有2 個，分別為十二烷基苯磺酸和檸檬酸。

2.4.3 功能性代謝物差異分析

2.4.3.1 神經遞質類代謝物

神經遞質類代謝物的變化分析結果如圖8 所示。

圖8 芹菜IDF 富集培養多菌群益生菌過程中神經遞質類代謝物的變化分析圖Fig.8 Analysis of changes in neurotransmitter metabolites during multi-probiotics cultivation by celery IDF enrichment

如圖8 所示，芹菜IDF 富集培養多菌群益生菌過程中，存在20 種有差異的神經遞質類代謝物。其中2種差異顯著，分別是1-十四烷酰基-2-（9Z，12Z，15Z-十八碳三烯酰基）-sn-甘油和十六酰胺乙醇；2 種差異極顯著，分別是ADP 和乙酰輔酶A；16 種差異高度顯著，分別是Morph、L-谷氨酸、L-谷氨酸鹽、3H-多巴胺、自行素-1、血栓素B2、腺苷、γ-氨基丁酸、5-羥基-L-色氨酸、琥珀酸、血清素、adenosine，8-（butylamino）-N-cyclopentyl、5-羥基吲哚乙酸、L-色氨酸、前列腺素E2 和脫氧腺苷。與培養0 d 相比，培養7 d 時顯著上調的神經遞質類代謝物有14 種，分別是L-谷氨酸、3H-多巴胺、自行素-1、血栓素B2、adenosine，8-（butylamino）-N-cyclopentyl、5-羥基-L-色氨酸、琥珀酸、血清素、5-羥基吲哚乙酸、L-色氨酸、脫氧腺苷、ADP 和乙酰輔酶A；下調的神經遞質類代謝物有6 種，分別是Morph、腺苷、γ-氨基丁酸、前列腺素E2、1-十四烷酰基-2-（9Z，12Z，15Z-十八碳三烯酰基）-sn-甘油和十六酰胺乙醇。

2.4.3.2 維生素和輔酶類代謝物

維生素和輔酶類代謝物的變化分析結果如圖9所示。

圖9 芹菜IDF 富集培養多菌群益生菌過程中維生素和輔酶類代謝物的變化分析圖Fig.9 Analysis of changes in vitamins and coenzyme metabolites during multi-probiotics cultivation by celery IDF enrichment

由圖9 可知，在富集培養過程中，共代謝產生7 種維生素和輔酶類的代謝物且均差異高度顯著。這7 種代謝物分別是β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、泛酸、D-泛酸、葉酸、S-腺苷甲硫氨酸和黃素單核苷酸。

2.4.3.3 肽類代謝物

肽類代謝物的變化分析結果如圖10 所示。

圖10 芹菜IDF 富集培養多菌群益生菌過程中肽類代謝物的變化分析圖Fig.10 Analysis of changes in peptide metabolites during multi-probiotics cultivation by celery IDF enrichment

由圖10 可知，富集培養過程中，共代謝產生21 種有差異的肽類代謝物。其中2 種差異顯著，分別為萘啶酸和高絲氨酸；19 種差異高度顯著，分別為亮索菌素B、伏馬菌素A2、多粘菌素B2、綠僵菌素R、多粘菌素、伏馬菌素B2、L-丙氨酸、左旋多巴、圓孤菌素、L-谷氨酰胺、肌肽、L-谷氨酸鹽、L-蛋氨酸、紅霉素C、脯氨酸、格爾德霉素、L-谷氨酸、氨酸和大觀霉素。與培養0 d 相比，培養7 d 時表達量顯著上調的肽類代謝物有9 種。

綜上，富集培養7 d 與培養0 d 相比，神經遞質類、維生素和輔酶類以及肽類代謝物，不僅種類有所增加，且大部分代謝物的表達量上調，說明芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養物的益生效果有所增強。

2.5 芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養物對消化道的耐受性

芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養物對消化道的耐受性分析結果如圖11 所示。

圖11 芹菜IDF 與多菌益生菌混合生物膜培養物對消化液的耐受性Fig.11 Digestive fluid tolerance of celery IDF and mixed biofilm with multi-probiotics

由圖11 可知，在不同消化液中，隨著時間的延長，活菌數均有不同程度的降低。模擬口腔消化10 min時，單菌與多菌的耐受力差異較小，存活率都達到了98.00%以上，表明人工模擬的口腔消化對益生菌的影響較小；人工模擬胃液處理1、2、3 h 后，單菌和多菌活菌數均持續下降，Lb G302、Lp G304 的存活率最低，且下降速度最快，而多菌存活率下降緩慢，且存活率較比單菌高。經過模擬胃液消化3 h 后，5 株單菌和多菌的存活率分別為7.74%、5.50%、31.52%、26.35%、26.00%、41.28%，芹菜IDF 中活菌數保持在1010CFU/g 左右；在人工模擬的腸液中處理6 h，單菌和多菌的存活率下降均緩慢，且多菌的最后存活率與Lb G302 和Lp G304無明顯差異，5 株單菌和多菌在人工腸液處理6 h 后的存活率分別為55.16%、51.59%、40.79%、42.11%、19.65%、55.07%，且多菌培養物中的活菌數維持在1011CFU/g左右。綜上，在整個模擬消化體系中，模擬胃液消化階段存活率最低，其次是模擬腸道消化和口腔消化；多菌較單菌對消化液有較強的耐受力。

2.6 芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養物的抗氧化活性

富集培養7 d 時培養物對DPPH 自由基清除率如圖12 所示。

圖12 芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養物對DPPH 自由基清除率Fig.12 DPPH free radical scavenging rate of celery IDF and mixed biofilm with multi-probiotics

由圖12 可知，多菌對DPPH 自由基的清除率明顯高于單菌，清除率達到了95% 以上；5 株單菌Lr G306、Lp G304、Lcp G305、Lb G302、St Q305 對DPPH的清除率依次為74.95%、71.86%、67.33%、49.54%、44.10%；芹菜IDF 對DPPH 自由基的清除率為44.28%。說明多菌群復合有助于提高其抗氧化性能。

3 結論

以可食性、易獲取、表面粗糙、表面積大的天然膳食纖維源芹菜IDF 為載體，利用生物膜富集微生物的原理，利用自主設計的富集培養裝置，分室連續共培養5 株試驗菌株，培養7 d 時，獲得的芹菜IDF 與多菌群益生菌的生物膜培養物中的活菌數最高可達到7.5×1013CFU/g；經菌群結構分析，其中加入的乳桿菌屬和鏈球菌屬始終均被檢出；與單菌相比，芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養物對模擬口腔消化液、模擬胃消化液和模擬腸消化液的抗逆性顯著增強，對DPPH 自由基的清除率顯著提高；代謝組學分析結果，培養7 d 與培養0 d 相比，功能性代謝物神經遞質類、維生素和輔酶類以及肽類等，不僅種類有所增加，且大部分代謝物的表達量上調，說明芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養物的益生效果一定程度上有所增強。可見試驗設計采用生物膜法，利用蔬菜IDF 為載體，將有單菌的芹菜IDF 分隔于各分室內，可使5 種不同的益生菌都能富集在各室的芹菜IDF 上，富集培養裝置和培養方法可行。另一方面，芹菜IDF 不僅是富集益生菌的載體，而且是后續研制的膳食補充劑的功能物質，同時還是益生菌的保護劑。研究結果可為進一步研制富集菌濃更高、功能性更強的益生菌與蔬菜IDF 有機復合膳食補充劑提供科學依據和技術支撐。