正己烷-乙醇-水三元雙相溶劑浸提法富集南極磷蝦磷脂

郭向融，劉小芳，姜維，辛云，蘇東，劉宇，冷凱良

（1.浙江海洋大學國家海洋設施養殖工程技術研究中心，浙江舟山 316022；2.中國水產科學研究院黃海水產研究所農業農村部極地漁業可持續利用重點實驗室，山東青島 266071）

南極磷蝦作為可持續的遠洋漁業資源，近年來受到越來越多的關注[1]。在南極海洋生物資源養護委員會的監督管理下，南極磷蝦資源正被有序地開發利用[2-3]。我國南極磷蝦漁業自2010 年入漁以來，經過十余年發展已取得長足進步[2-3]。南極磷蝦漁業是海陸聯動型海洋生物資源利用產業，新鮮捕獲的南極磷蝦先在船上加工為南極磷蝦粉、南極磷蝦凍蝦等原料級產品，而后經遠洋冷鏈運輸至陸地再進行后續精深加工利用[1-3]。受捕撈加工船處理能力的限制，捕獲的南極磷蝦少部分可被加工為南極磷蝦粉，大部分仍是以南極磷蝦凍蝦的形式運回陸地。目前，陸基加工利用南極磷蝦粉生產南極磷蝦油、南極磷蝦蛋白肽等高值產品已發展得較為成熟[1，4]，但南極磷蝦凍蝦仍一直作為飼料或者普通食品的原料被低值化應用[5]，一定程度上造成了資源浪費。合理利用南極磷蝦凍蝦資源進行高值產品的開發，對于支撐南極磷蝦產業高質量發展具有重要意義。

磷脂是分子結構中含有磷酸基團的極性脂質成分，其是構成細胞膜的基礎結構物質，并在維持生物體正常代謝和功能穩態中發揮重要作用[6]。南極磷蝦的磷脂含量高[7]，且南極磷蝦所富含的二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等多不飽和脂肪酸主要以磷脂型式存在[8-9]。現有研究指出，磷脂是南極磷蝦最重要的活性脂質成分，與甘油酯、游離脂肪酸等其他脂質成分相比，磷脂在防治心腦血管疾病[10]、調節糖/脂代謝[11-12]、維持腸道功能穩態[12]等方面能夠發揮更優的活性作用。南極磷蝦磷脂的提取生產已引起產業關注，將成為南極磷蝦脂質類高值產品開發的新方向。

磷脂的富集方法主要包括溶劑萃取法、層析分離法及超臨界萃取法等，其中，溶劑萃取法是最常采用的手段，層析分離法和超臨界萃取法則受到加工處理量小、生產投入大、設備要求高等因素限制而尚未在工業化生產中大規模應用[13]。利用不同脂質成分間的極性差異，采用由極性溶劑和非極性溶劑構成的雙相溶劑體系進行萃取可實現目標脂質化合物的富集[14]。以正己烷-乙醇為主體構成的烴-醇型混合溶劑是油脂工業中較為成熟的混合溶劑之一，具有提取效果好且產物安全性高等優勢[14-15]。然而，南極磷蝦含水量接近80%[5，16]，在直接浸提南極磷蝦總脂質的過程中水分也會同步被提取出來，水分的存在會對正己烷-乙醇混合溶劑體系的相平衡產生影響[14]，并最終影響磷脂的富集效果，目前鮮有研究對此進行深入探討[15]。因此，本研究以解凍后的南極磷蝦為原料，針對乙醇浸提南極磷蝦總脂質以及正己烷-乙醇-水三元雙相溶劑萃取富集南極磷蝦磷脂的工藝條件進行優化，并對制備獲得的南極磷蝦磷脂的組成進行分析，以期為南極磷蝦凍蝦資源的合理利用提供參考，為新型南極磷蝦脂質類高值產品的開發提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦凍蝦：遼寧遠洋漁業有限公司；磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）標準品、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）標準品、溶血型磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）標準品、37 種脂肪酸甲酯混標（純度均≥98%）：德國默克生命科學有限公司；三氯甲烷、濃硫酸、濃硝酸、高氯酸：青島潤嵩化學科技有限公司；甲醇、乙醇、異丙醇、正己烷、甲酸銨：國藥集團化學試劑有限公司。除特殊標記外，所用化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BAS224S-CW 型電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；HH-4 型恒溫水浴鍋：常州智博瑞儀器制造有限公司；LXJ-IIB 型離心機：上海安亭科學儀器廠；RE52AA 型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；UV1-102Ⅱ型紫外/可見分光光度計：上海天美科學儀器有限公司；LC-16 型液相色譜儀（配置蒸發光散射檢測器）：日本島津公司；HP-6890 型氣相色譜儀（配置火焰離子化檢測器）：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 南極磷蝦總脂質提取條件優化

南極磷蝦凍蝦進行靜水解凍，以南極磷蝦塊掰開斷裂處蝦體完整作為解凍完全的標志[17]。適量解凍后的南極磷蝦采用乙醇在相應試驗條件下進行總脂質的浸提，浸提完成后進行離心（室溫25 ℃，5 000 r/min，20 min）處理，收集上清液經旋蒸脫溶得總脂質，稱量總脂質的質量并記錄。固定料液比1∶3（g/mL）、浸提溫度40 ℃、浸提時間3 h、浸提3 次，探究料液比[1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5（g/mL）]、浸提時間（1、2、3、4、5 h）、浸提溫度（20、30、40、50、60 ℃）、浸提次數（1、2、3、4、5 次）對總脂質提取效果的影響。以總脂質得率為評價指標，確定各因素的最佳條件。總脂質得率（w，%）計算公式如下。

式中：m為南極磷蝦總脂質質量，g；M為南極磷蝦質量，g。

1.3.2 正己烷-乙醇-水三元雙相溶劑萃取南極磷蝦磷脂的條件優化

參考文獻[14，18]選擇覆蓋正己烷-乙醇-水混合溶劑雙相區域的不同相點進行南極磷蝦磷脂萃取條件的優化，正己烷-乙醇-水三元體系的相平衡圖及各相點對應的正己烷-乙醇-水的體積比分別見圖1 和表1。

表1 不同相點對應的正己烷-乙醇-水的體積比Table 1 Volume ratio of hexane-ethanol-water at the selected phase point

圖1 正己烷-乙醇-水三元體系的相平衡圖Fig.1 Phase equilibrium diagram of hexane-ethanol-water system

取適量南極磷蝦總脂質，按照相應試驗條件進行萃取處理，先加入乙醇，渦旋混勻使脂質充分溶解，然后加入超純水，再次渦旋混勻后加入正己烷，充分混勻后于室溫25 ℃靜置，待分層完全后分別收集上相溶液和下相溶液，經旋蒸脫溶得上相脂質提取物和下相脂質提取物，用于各指標的測定。不同處理組中南極磷脂總脂質與正己烷-乙醇-水混合溶劑的料液比均為1∶100（g/mL）。以脂質得率、磷脂含量、磷脂得率為評價指標，確定正己烷-乙醇-水混合溶劑從南極磷蝦總脂質中萃取富集磷脂的最佳條件。各評價指標按照以下公式計算。

式中：w1為上相脂質得率，%；m1為上相脂質質量，g；m為南極磷蝦總脂質質量，g；w2為下相脂質得率，%；m2為下相脂質質量，g；w3為磷脂得率，%；c為下相脂質中磷脂含量，%；c0為南極磷蝦總脂質中磷脂含量，g。

1.3.3 南極磷蝦磷脂的富集及組成分析

500 g 解凍后的南極磷蝦，水分含量經測定為（78.52±1.63）g/100 g，利用乙醇按照1.3.1 中優化確定的條件進行浸提，浸提完成后進行離心（室溫25 ℃，5 000 r/min 離心20 min）處理，收集上清液即為總脂質提取液，按照1.3.2 中優化確定的正己烷-乙醇-水的體積比依次補齊超純水和正己烷，充分混勻后于室溫靜置，待分層完全后收集下相溶液，經旋蒸脫溶得南極磷蝦磷脂，然后進一步測定磷脂含量、磷脂組成和脂肪酸組成。

1.3.4 評價指標測定方法

1.3.4.1 磷脂含量測定

磷脂含量按照GB/T 5537—2008《糧油檢驗磷脂含量的測定》中的鉬藍比色法進行測定。

1.3.4.2 磷脂組成分析

參照文獻[19-20]的方法進行磷脂組成分析：適量磷脂樣品采用三氯甲烷-甲醇溶液（2∶1，體積比）溶解，采用液相色譜法分析磷脂組成，利用外標法對不同磷脂組分進行定量，而后計算各磷脂組分在總磷脂中所占比例。液相色譜條件：色譜柱ZORBAX Rx-SIL（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流動相A：異丙醇、水、5 mmol/L 甲酸銨體積比85∶14∶1，流動相B：正己烷、異丙醇、5 mmol/L 甲酸銨體積比82∶17∶1；洗脫程序：0 min（A、B 體積比0∶100），5 min（A、B 體積比20∶80），7 min（A、B 體積比40∶60），17 min（A、B 體積比70∶30），23 min（A、B 體積比100∶0），25 min（A、B 體積比100∶0），26 min（A、B 體積比0∶100），30 min（A、B體積比0∶100）；洗脫流速1 mL/min；漂移管溫度60 ℃；霧化器壓力172 kPa；進樣量10 μL。定量分析：在20～500 mg/L 濃度范圍內，PC 定量方程為Y=1.118 8X+3.430 9，R2=0.998 7；PE 定量方程為Y=1.339 3X+2.786 2，R2=0.997 6；LPC 定量方程為Y=1.119 8X+3.213 5，R2=0.999 0；其中，X為各磷脂組分標準品的質量濃度（mg/L），Y為相應峰面積的對數值。

1.3.4.3 脂肪酸組成分析

參照文獻[19-20]的方法進行脂肪酸組成分析：適量磷脂樣品經甲酯化處理后，采用氣相色譜法分析脂肪酸組成，利用峰面積歸一化法對各脂肪酸進行定量。氣相色譜條件：INNOWAX 毛細管柱（0.32 mm×30 m，0.25 μm）；進樣量1 μL；分流比15∶1；升溫程序：自170 ℃按照3 ℃/min 速率升溫至210 ℃，保持30 min；高純氮氣為載氣，流速40 mL/min；檢測器溫度250 ℃，氫氣流速40 mL/min，空氣流速450 mL/min。

1.4 數據處理

試驗結果以平均值±標準偏差的形式表示，采用Excel 2016、IBM SPSS 27.0、Origin 2022 軟件進行數據處理和圖形繪制。采用單因素方差分析進行組間多重比較，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 南極磷蝦總脂質提取條件的確定

料液比、浸提時間、浸提溫度、浸提次數對南極磷蝦總脂質提取效果的影響見圖2。

圖2 不同提取條件對南極磷蝦總脂質提取效果的影響Fig.2 Effects of different extraction conditions on the extraction efficiency of total lipids from Antarctic krill

由圖2A 可知，隨著溶劑體積的增加，總脂質得率逐漸提高，當料液比達到1∶3（g/mL）后，總脂質得率趨于穩定；依據傳質平衡原理，在一定范圍內，隨著溶劑體積的增加，浸出的脂質逐漸增多，當脂質基本被提取出后，繼續增加溶劑并不會改善提取效果，但卻會增加成本和后續脫溶的能耗[21]。因此，選定料液比1∶3（g/mL）為最佳條件。由圖2B 可知，隨著浸提時間的延長，總脂質得率逐漸升高，浸提3 h 時總脂質得率較高；隨著浸提時間的延長，南極磷蝦原料與浸提溶劑中的脂質濃度差不斷縮小，直至擴散基本達到平衡[22]，之后浸提時間繼續延長，總脂質得率基本穩定。因此，選定浸提時間3 h 為最佳條件。由圖2C 可知，總脂質得率隨著浸提溫度的升高而顯著升高（P＜0.05），當浸提溫度高于40 ℃后，繼續升高浸提溫度，總脂質得率無顯著變化（P＞0.05）。適當提高浸提溫度能夠加快分子運動，促進脂質的溶出，但浸提溫度過高會引起料液間氣化層的形成，阻礙分子擴散，無法繼續帶來浸提效果的明顯改變[21，23]。因此，選定浸提溫度40 ℃為最佳條件。由圖2D 可知，總脂質得率隨著浸提次數的增加而增加，浸提超過3 次后總脂質得率基本不變。隨著浸提次數的增加，原料中的脂質不斷被提取，待充分抽提后，增加浸提次數不會帶來浸提效果的改善。因此，選定浸提3 次為最佳條件。

綜上，確定南極磷蝦總脂質提取條件為料液比1∶3（g/mL）、浸提時間3 h、浸提溫度40 ℃、浸提次數3 次，在此條件下重復進行6 次提取試驗，總脂質得率為（4.69±0.13）%，這與前期研究中測得的南極磷蝦總脂質含量保持一致[19，24]，表明在上述條件下，南極磷蝦總脂質已被提取完全。

2.2 正己烷-乙醇-水三元雙相溶劑萃取南極磷蝦磷脂條件確定

正己烷-乙醇-水三元體系不同相點條件對南極磷蝦磷脂萃取效果的影響見圖3。

圖3 A～M 相點條件對南極磷蝦磷脂萃取效果的影響Fig.3 Effects of A-M phase point conditions on the extraction efficiency of Antarctic krill phospholipids

南極磷蝦總脂質中的磷脂屬極性脂質，其因頭部基團中含有磷酸和堿基而具有很強的親水性，在萃取過程中優先富集于極性較高的下相乙醇-水層；而南極磷蝦總脂質中的甘油酯、游離脂肪酸等中性脂質則更易分配至極性較低的上相正己烷層[25]。由圖3（A）可知，與處于均相區的相點A 相比，采用非均相區的相點B～I 對應條件處理，南極磷蝦總脂質可得到不同程度的分離。相點F、H、I 因體系中水的比例過大引起了磷脂乳化[26-27]，而相點D、G 需在總脂質提取液中引入較高比例的正己烷，因此選定相點B、C、E 所對應的三角區域進行進一步的條件優化。由圖3（A）可知，在相點B、C、E、J、K、L、M 對應條件下，南極磷蝦總脂質在正己烷-乙醇-水三元體系中能夠實現雙相分配。由圖3（B）可知，在相點B 對應條件下，下相脂質得率最高，為（55.87±0.53）%，顯著高于其他相點（P＜0.05）；下相脂質得率由高到低順序為B＞J＞K＞C＞L＞M＞E。由圖3（C）可知，在相點J 對應條件下，下相脂質中的磷脂含量最高，為（83.95±0.65）%，顯著高于其他相點（P＜0.05）；下相脂質中的磷脂含量由高到低順序為J＞K＞B＞C＞L＞M＞E。由圖3（D）可知，在相點B 對應條件下，下相磷脂得率最高，達到（94.31±0.48）%，顯著高于其他相點（P＜0.05）；其次為相點J 和相點K，下相磷脂得率分別為（89.87±0.59）%和（72.15±0.70）%；下相磷脂得率由高到低順序為B＞J＞K＞C＞L＞M＞E。綜上，選定相點B、J所對應的直線區域進行進一步的條件優化。

B、N、O、P、J 相點條件對南極磷蝦磷脂萃取效果的影響見圖4。

圖4 B、N、O、P、J 相點條件對南極磷蝦磷脂萃取效果的影響Fig.4 Effects of B，N，O，P，J phase point conditions on the extraction efficiency of Antarctic krill phospholipids

在由相點B 至相點J 的直線區域內，正己烷-乙醇-水三元體系中乙醇的比例保持不變、正己烷的比例逐漸減少、水的比例逐漸增大。由圖4（A）可知，在相點B、N、O、P、J 對應條件下，南極磷蝦總脂質在正己烷-乙醇-水三元體系中能夠實現雙相分配。由圖4（B）可知，在相點B 至相點J 的直線區域內，隨著萃取條件的變化，下相脂質得率逐漸降低；在相點B、N 對應條件下，下相脂質得率顯著高于其他相點（P＜0.05）。由圖4（C）可知，在相點B 至相點J 的直線區域內，隨著萃取條件的變化，下相脂質中的磷脂含量先升高后趨于穩定；在相點N 對應條件下，下相磷脂含量最高，為（85.51±0.37）%。由圖4（D）可知，在相點B 至相點J的直線區域內，隨著萃取條件的變化，下相磷脂得率先升高后下降；在相點N 對應條件下，下相磷脂得率最高，達到（98.39±0.38）%，表明磷脂已基本全部被萃取富集于正己烷-乙醇-水三元雙相體系的下相。綜上，確定相點N 所對應條件為最佳萃取條件，即正己烷-乙醇-水三者體積比為0.275∶0.600∶0.125。

2.3 南極磷蝦磷脂的組成分析

制備獲得的南極磷蝦磷脂12.85 g，經測定磷脂含量為（85.46±0.31）%，這與前述萃取富集工藝研究的結果保持一致。采用本研究優化后的工藝條件進行南極磷蝦磷脂的富集，與張千等[13]采用的水化法（磷脂含量70.78%）和魏山山[28]采用的氧化鋁柱層析分離法（磷脂含量79.83%）相比效果更優，與魏山山[28]采用的硅膠柱層析分離法（磷脂含量97.77%）和陰法文[29]采用的超臨界萃取法（磷脂含量92.81%）相比效果略有不足。本研究所采用的正己烷-乙醇-水三元雙相溶劑浸提法能夠快速高效地實現南極磷蝦磷脂的富集，處理效果理想且未引入有害溶劑，具有較好的規模化應用價值。

南極磷蝦磷脂的磷脂組成和脂肪酸組成分析結果見圖5 和表2。

表2 南極磷蝦磷脂的脂肪酸組成Table 2 Fatty acid composition of Antarctic krill phospholipids%

圖5 磷脂混合標準品和南極磷蝦磷脂的高效液相分離圖譜Fig.5 The HPLC-ELSD spectrum of phospholipids standard and Antarctic krill phospholipids

由圖5 可知，南極磷蝦磷脂主要為PC，含有少量的PE 和LPC；經計算，PC 約占總磷脂含量的（91.29±1.28）%。由表2 可知，南極磷蝦磷脂中多不飽和脂肪酸含量豐富且主要為EPA 和DHA，分別占總脂肪酸含量的（35.65±0.52）%和（17.74±0.47）%，以上結果與已有研究報道保持一致[7，19]。此外，通過對比上相中性脂和下相磷脂的脂肪酸組成可知，南極磷蝦富含的EPA、DHA 等多不飽和脂肪酸更多地以磷脂型式存在。現有文獻指出，與大豆磷脂和卵黃磷脂等陸地食品原料來源的磷脂相比，海洋EPA/DHA 磷脂在防治心腦血管疾病、調節代謝穩態、改善神經系統功能等方面的活性更優[20，30]。南極磷蝦磷脂作為典型的海洋EPA/DHA 磷脂，其后續的開發和應用值得重點關注。

3 結論

本研究以解凍后的南極磷蝦為原料，對乙醇浸提南極磷蝦總脂質以及正己烷-乙醇-水三元雙相溶劑萃取富集南極磷蝦磷脂的工藝條件進行優化，并對制備獲得的南極磷蝦磷脂的組成進行分析。工藝研究結果表明，乙醇提取南極磷蝦總脂質最優條件為料液比1∶3（g/mL）、浸提溫度40 ℃、浸提時間3 h、浸提次數3 次，在此條件下，南極磷蝦總脂質得率為（4.69±0.13）%；正己烷-乙醇-水三元雙相溶劑從南極磷蝦總脂質中萃取富集磷脂的最佳體積比為0.275∶0.600∶0.125，制備獲得的南極磷蝦磷脂中磷脂含量為（85.46±0.31）%。組成分析結果表明，南極磷蝦磷脂主要為PC，含有少量的PE 與LPC；南極磷蝦磷脂是典型的海洋EPA/DHA 磷脂，磷脂中EPA 和DHA 的含量分別占總脂肪酸含量的（35.65±0.52）%和（17.74±0.47）%。正己烷-乙醇-水三元雙相溶劑浸提法能夠快速高效地實現南極磷蝦磷脂的富集，具有較好的應用前景。研究結果對于推進南極磷蝦凍蝦資源合理利用以及新型南極磷蝦脂質類高值產品的開發具有積極意義。