磷蝦油中有機砷脫除工藝優化

方素瓊，朱東奇，林錦淮，楊繼國，3，4*

（1.仙樂健康科技股份有限公司，廣東汕頭 515041；2.華南協同創新研究院，廣東東莞 523808；3.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640；4.嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室河源分中心，廣東河源 517000）

南極磷蝦油富含二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等對人體存在重要生理功能的長鏈多不飽和脂肪酸，其能調節人體的脂質代謝、預防心腦血管疾病、抗癌、降低體脂肪過度積累、促進生長發育和提高幼體的成活率[1-3]，磷蝦油中DHA 和EPA 主要結合在磷脂上[4-6]，磷蝦油中磷脂型的DHA 和EPA 生物利用度高于甘油三酯型和乙酯型[7-9]，磷蝦油中還含有天然類胡蘿卜素、蝦青素[10-11]。考慮到磷蝦油中不飽和脂肪酸易氧化及蝦青素受熱易分解等特性，磷蝦油的加工應盡量控制在較低溫度條件下進行。亞臨界流體技術具有工作壓力低、工作溫度相對較低、運作環境為真空狀態、溶劑易回收等特點，適于進行磷蝦油脫砷工藝，可以對磷蝦油中熱敏性強、易氧化等的成分進行保護[12-17]，而且，亞臨界狀態下的分子擴散性能增強，傳質速度加快[18-19]。

隨著現代工業的發展，海水中砷含量增加，南極磷蝦又以海中浮游動植物為食，這也導致其體內的砷越來越多，且后續加工時也會在不同程度上使砷進一步被富集，因此南極磷蝦制品尤其是南極磷蝦油中總砷含量較高。南極磷蝦中的砷主要是有機砷，對磷蝦油中砷形態分析可知，磷蝦油中無機砷主要為砷酸[arsenic acid，As（Ⅲ）]和亞砷酸[arsenious acid，As（Ⅴ）]，有機砷主要為砷甜菜堿（arsenobetaine，AsB）、砷膽堿（arsenocholine，AsC）、一甲基砷（monomethylarsonic，MMA）、二甲基砷（dimethylarsinic，DMA）砷糖和砷脂。砷甜菜堿是一種親水雙離子型四元烷基砷化合物，占總砷含量90%左右[20-22]，同時，磷蝦油中還含有一些脂溶性有機砷[23]。

目前，關于南極磷蝦精深加工的研究多集中于磷蝦油的提取、精煉、南極磷蝦中氟的脫除，或重點研究砷形態，而對磷蝦油中砷脫除方法鮮有研究[24]。活性炭化學性質穩定，孔隙結構豐富，比表面積大，吸附能力強，價格便宜[25]，現有研究表明，可利用活性炭吸附除去水體中的重金屬[26-27]。本研究以不含無機砷的南極磷蝦油為原料，選用椰殼活性炭吸附和水為脫除劑，對磷蝦油中有機砷進行脫除，以期為今后磷蝦油多種方式相結合脫除有機砷提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磷蝦油：青島康鏡海洋生物科技有限公司[總砷含量：（4.10±0.11）mg/kg，無機砷含量：未檢出]；椰殼活性炭：深圳市興萬邦活性炭有限公司；正己烷、丙三醇、1，2-丙二醇（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；硝酸、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；丁烷（分析純）：佛山市科的氣體化工有限公司；砷（標準品）：中國計量科學研究院。

1.2 儀器與設備

BS201S Sartorius 精密天平：德國賽多利斯集團；TGL20 臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；700X 電感耦合等離子質譜儀（IPC-MS）：安捷倫科技（中國）有限公司；JTWB-16 密閉式智能微波消解儀：上海屹堯儀器科技發展有限公司；CBE-1L 型亞臨界流體萃取設備（丁烷溶劑，1L 定制款）：河南亞臨界萃取技術有限公司；5GV-3-K 攪拌機：香港松下電機集團有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 磷蝦油中有機砷的脫除單因素試驗

1.3.1.1 脫除劑對磷蝦油中有機砷脫除的影響

稱取100 g 磷蝦油置于亞臨界萃取罐內，在脫砷溫度為45 ℃、脫砷時間為3 h 條件下，考察脫除劑單獨使用和同時使用對磷蝦油中有機砷脫除的影響。設置只添加椰殼活性炭（添加量3%）、只添加水（添加量30%）、同時加入3% 椰殼活性炭和30% 水（各添加量均以磷蝦油計），關閉進料口，抽真空至-0.1 MPa，加入丁烷溶劑，打開攪拌機攪拌至3 h 后停止攪拌，靜置，待分層后，將上層溶劑相通過管道輸送至溶劑回收罐內，回收丁烷溶劑，用正己烷洗出萃取罐中的混合物，過濾除去吸附劑，除水，回收正己烷，得到除砷后的磷蝦油，檢測總砷含量，計算脫砷率。

1.3.1.2 脫砷溫度對磷蝦油中有機砷脫除的影響

設置脫砷溫度為35、40、45、50、55 ℃，同時加入3%椰殼活性炭和30%水，后續處理參考1.3.1.1，考察不同脫砷溫度對磷蝦油中有機砷脫除的影響.

1.3.1.3 椰殼活性炭添加量對磷蝦油中有機砷脫除的影響

設置脫砷溫度為45 ℃，加入30%水，再分別加入3%、5%、7%、9%、11% 椰殼活性炭，后續處理參考1.3.1.1，考察椰殼活性炭添加量對磷蝦油中有機砷的脫除的影響。

1.3.1.4 水添加量對磷蝦油中有機砷脫除的影響

設置脫砷溫度為45 ℃，加入9% 的活性炭，再分別加入25%、30%、35%、40%、45%、50% 水，后續處理參考1.3.1.1，考察水添加量對磷蝦油中有機砷的脫除的影響。

1.3.1.5 脫砷時間對磷蝦油中有機砷脫除的影響

設置脫砷溫度為45 ℃，同時加入9%椰殼活性炭和40%水，脫砷時間分別為1、2、3、4、5、6 h，后續處理參考1.3.1.1，考察脫砷時間對磷蝦油中有機砷的脫除的影響。

1.3.2 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，考慮磷蝦油中含有熱敏性、易氧化等物質，為確保磷蝦油脫砷后的品質，脫砷溫度不宜過高，因此選取椰殼活性炭添加量（A）、水添加量（B）、脫砷時間（C）作為變量，脫砷率（Y）為響應值，設計響應面試驗，因素和水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface design

1.3.3 磷蝦油有機砷脫除率的計算

總砷的測定參照GB 5009.11—2014《食品安全國家標準食品中總砷及無機砷的測定》中的方法進行測定。磷蝦油經檢測，無機砷含量未檢出，為0 mg/kg，總砷含量即為有機砷含量。有機砷脫砷率（T，%）計算公式如下。

式中：A0為初始磷蝦油中總砷含量；At為脫除后磷蝦油中總砷含量，mg/kg。

1.3.4 有機砷脫除前后磷蝦油質量指標檢測

色澤、透明度參考GB/T 5525—2008《植物油脂透明度、氣味、滋味鑒定法》中的方法進行測定。

磷脂含量參考GB/T 5537—2008《糧油檢驗磷脂含量的測定》中的方法進行測定。

酸價參考GB 5009.229—2016《食品安全國家標準食品中酸價的測定》中的第二法進行測定。

過氧化值參考GB 5009.227—2016《食品安全國家標準食品中過氧化值的測定》中的第一法進行測定。

DHA、EPA 含量參考GB 5009.168—2016《食品安全國家標準食品中脂肪酸的測定》中的第一法進行測定。

蝦青素含量參考美國藥典《磷蝦油》中的方法進行測定。

1.4 數據分析

所有數據均重復測定3 次，結果以平均值±標準差表示。數據采用Design-Expert 13 進行分析處理。運用Design-Expert 13 進行響應面圖表繪制，其他圖表使用Origin 8.5 及Excel 進行繪制。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 脫除劑對磷蝦油中有機砷脫除的影響結果

脫除劑對磷蝦油中有機砷脫除的結果如圖1 所示。

圖1 脫除劑對磷蝦油脫有機砷的影響Fig.1 Effect of removal agent on removal of organic arsenic in krill oil

由圖1 可知，椰殼活性炭+水組、水組、椰殼活性炭組的脫砷率依次為32.43%、20.97% 和9.76%，椰殼活性炭與水同時使用脫砷效果最佳。于樹芳[26]、鐘福隆等[27]研究表明，活性炭可用于砷的脫除；砷甜菜堿是磷蝦油中有機砷的主要物質，具有親水性[22]，水能脫砷可能是砷甜菜堿溶解于水中后被脫除，考慮到磷蝦油中砷的形態及脫除難度[23]，后續試驗采用椰殼活性炭和水同時添加進行脫除。

2.1.2 脫砷溫度對磷蝦油中有機砷脫除的影響結果

脫砷溫度對磷蝦油中有機砷脫除的影響如圖2所示。

圖2 脫砷溫度對磷蝦油脫有機砷的影響Fig.2 Effect of arsenic removal temperature on organic arsenic removal in krill oil

由圖2 可知，磷蝦油中有機砷的脫砷率隨著脫砷溫度的升高呈現出先增加后降低的趨勢，當脫砷溫度為45 ℃時，有機砷脫砷率為32.43%，主要原因是活性炭隨著脫砷溫度的增加，導致吸附能力減弱，這與活性炭的吸附動力學一致[26，28]。因此，選擇脫砷溫度為45 ℃進行后續試驗。

2.1.3 椰殼活性炭添加量對磷蝦油中有機砷脫除的影響結果

椰殼活性炭添加量對磷蝦油中有機砷脫除的影響如圖3 所示。

圖3 椰殼活性炭添加量對磷蝦油有機砷脫除的影響Fig.3 Effect of addition of coconut shell-activated carbon on removal of organic arsenic in krill oil

由圖3 可以看出，當椰殼活性炭的添加量從3%增加至9%時，磷蝦油中有機砷脫砷率從32.43%升至46.34%，繼續增加椰殼活性炭添加量，磷蝦油中有機砷不再減少，考慮到磷蝦油中有機砷存在多種形態，尤其還含有脂溶性有機砷，吸附脫除難度大，活性炭可能只會吸附某些形態的有機砷，當可吸附形態的有機砷被吸附后，其他形態的有機砷因無法被吸附，隨著活性炭添加量過多，使得顆粒堆積并造成吸附位點的重疊與聚集，導致活性炭的總活性位點減少從而導致吸附量減少[29]，所以無法進一步將磷蝦油中其他形態的有機砷脫除。因此，選擇椰殼活性炭添加量7%、9%、11%進行響應面優化試驗。

2.1.4 水添加量對磷蝦油中有機砷脫除的影響結果

水添加量對磷蝦油中有機砷脫除的影響如圖4所示。

圖4 水添加量對磷蝦油有機砷脫除的影響Fig.4 Effect of water addition on removal of organic arsenic in krill oil

由圖4 可知，隨著水添加量的增加，磷蝦油中有機砷脫砷率升高，當水添加量為40% 時，磷蝦油中有機砷脫砷率達到58.39%，繼續增加水添加量，有機砷脫砷率不會繼續增高，這主要原因可能是磷蝦油中砷甜菜堿已經溶解至水中，其他形態的有機砷，尤其是脂溶性的有機砷無法溶解至水中[23]，導致脫砷率不增加，因此，選擇水添加量35%、40%、45% 進行響應面優化試驗。

2.1.5 脫砷時間對磷蝦油中有機砷脫除的影響結果

脫砷時間對磷蝦油中有機砷脫除的影響如圖5所示。

圖5 脫砷時間對磷蝦油有機砷脫除的影響Fig.5 Effect of arsenic removal removal time on removal of organic arsenic in krill oil

由圖5 可知，隨著脫砷時間的延長，磷蝦油中有機砷脫砷率升高，當脫砷時間到5 h 后，脫砷率增加緩慢，一方面，可溶于水中的有機砷已經被最大程度地溶解至水中，另一方面，活性炭吸附位點已經被占領，導致有機砷無法進一步被吸附，或者其他形態的有機砷無法溶解于水或無法被活性炭吸附，使整個脫砷過程達到動態平衡[27]。因此，選擇脫砷時間4、5、6 h 進行響應面優化試驗。

2.2 磷蝦油有機砷脫除響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計及結果

根據1.3.2 和Box-Behnken 的中心組合設計原則，設計了三因素三水平試驗方案，結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface design and results

2.2.2 建立回歸模型及方差分析

根據表2 的結果，利用Design-Expert 13 軟件對試驗結果進行回歸擬合，所得回歸方程為Y=68.39+1.60A+2.85B+3.04C+0.0250AB+1.18AC-0.1550BC-1.30A2-3.03B2-4.02C2。

對磷蝦油中有機砷脫除試驗的回歸方程模型進行方差分析，并檢驗其模型系數的顯著性，其結果如表3所示。

表3 響應面模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface model

由表3 可知，回歸模型P值＜0.000 1，達到極顯著水平，失擬項P=0.774 3，表現為不顯著，說明回歸模型良好。另外得出模型的決定系數R2=0.993 7，調整后決定系數R2Adj=0.985 5，表示回歸模型與預測值之間的擬合度好，在試驗條件范圍內能明確反映脫砷率的變化，因此可以利用上述方程模型對磷蝦油中有機砷最優脫除工藝進行分析和預測。一次項中A、B、C，二次項中A2、B2、C2影響均極顯著（P＜0.01），交互項中AC影響顯著（P＜0.05），以及由F值大小可判斷出3 個單因素對脫砷率的影響順序為C（脫砷時間）＞B（水添加量）＞A（椰殼活性炭添加量）；交互項影響大小為AC＞BC＞AB；二次項影響大小為C2＞B2＞A2。

2.2.3 響應面分析

椰殼活性炭添加量、水添加量和脫砷時間的交互作用對磷蝦油中有機砷脫砷率的影響如圖6 所示。

圖6 因素間交互作用對磷蝦油中有機砷脫除影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface diagram and contour diagram of interactions between factors on removal of organic arsenic in krill oil

圖6 反映了椰殼活性炭添加量、水添加量和脫砷時間相互作用對磷蝦油有機砷脫除的影響。在等高線圖中，如果兩個因素之間的交互作用較弱，則等高線更接近圓形；如果交互作用較強，則等高線更接近橢圓形。在響應面圖中，如果曲面較陡峭，則響應值的變化幅度較大，表明兩個因素之間的交互作用較強。磷蝦油有機砷脫砷率在三因素所設定的水平范圍內均存在最高值。

2.2.4 最優組合和驗證試驗

通過模型預測，得到磷蝦油有機砷脫除的最佳工藝條件為椰殼活性炭添加量9.81%、水添加量39.25%、脫砷時間5.49 h，在此工藝條件下磷蝦油有機砷脫除率為68.71%。結合實際操作情況，將最優方案調整為活性炭添加量10.0%、水添加量39.0%、脫砷時間5.5 h，在上述條件下測定有機砷脫砷率，重復5 次，結果如圖7 所示。

圖7 磷蝦油中有機砷脫除最優組合驗證重復試驗Fig.7 Repetitive verification of optimal combination of organic arsenic removal in krill oil

由圖7 可知，利用椰殼活性炭吸附同時加上水溶解脫除磷蝦油中有機砷，磷蝦油中的有機砷脫砷率達到（68.68±0.91）%，與預測值相近，重復性好，表明該模型達到預期效果，具有可行性。

2.3 磷蝦油有機砷脫除前后主要質量指標

脫除前后磷蝦油的主要質量指標結果見表4。

表4 磷蝦油有機砷脫除前后質量指標Table 4 Quality indexes before and after removal of organic arsenic in krill oil

由表4 可知，利用椰殼活性炭與水同時添加的方式脫除磷蝦油中有機砷，脫除后磷蝦油樣品各項主要質量指標與脫除前沒有明顯變化，主要指標磷脂和蝦青素并未因處理而有所損失，說明在亞臨界流體丁烷體系下，對磷蝦油中的一些敏感物質存在保護作用。

3 結論

本研究以不含無機砷的磷蝦油為原料，以有機砷脫的砷率為指標，通過單因素和響應面優化，得到最優脫除有機砷的工藝條件為椰殼活性炭添加量10.0%、水添加量39.0%、脫砷時間5.5 h。在最佳條件下，磷蝦油中有機砷由初始的4.10 mg/kg 降低至1.28 mg/kg。通過試驗重復驗證，磷蝦油中有機砷脫砷率為68.68%，對脫砷前后磷蝦油主要質量指標進行檢測，磷脂、蝦青素含量、酸價、過氧化值等指標沒有明顯變化。本研究選用椰殼活性炭和水作為脫除劑、同時添加的方式，在不破壞磷蝦油主要質量指標前提下，可以對磷蝦油中有機砷進行穩定脫除，為磷蝦油中有機砷的脫除提供參考依據。