測試片法檢測食品中大腸菌群的驗證評價

摘 要：為探究大腸菌群測試片法在食品檢測中的可行性，依據國際標準ISO 16140-2：2016中的性能指標驗證要求，對MicroFast?大腸菌群測試片法進行包容性、排他性，以及與國家標準《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》（GB 4789.3—2016）中方法的一致性驗證，采用t-檢驗和Bland-Altman分析方法進行一致性分析評價。16株目標菌在測試片上形成典型菌落，24株非目標菌中的23株均未在測試片上形成菌落，阿巴特圖巴沙門氏菌ATCC 35640在測試片上形成非典型菌落。測試片法和GB 4789.3—2016中方法的檢測結果呈正相關（R2＞0.976）；95%置信區間的樣品比例為1∶25，滿足不得高于1∶20的要求；所有食品類型的β-期望容忍區間（β-ETI）均在±0.5對數單位范圍內，測試片法和GB 4789.3—2016方法具有很好的一致性。MicroFast?大腸菌群測試片法對純菌株的包容性和排他性良好，在一致性方面符合ISO 16140-2：2016對方法等效性的要求，可作為替代方法，用于檢測食品中的大腸菌群。

關鍵詞：測試片法；大腸菌群；平板計數法

Validation of Coliform in Food by Test Tablets Method

TAO Wenjing1， DONG Bin2， JIAO Fenglian3， ZHOU Qi1， QU Lianhai1， WANG Qi3*

（1.Beijing Meizheng Bio-Tech Co.， Ltd.， Beijing 102200， China; 2.Beijing Guangming Jianeng Dairy Co.， Ltd.， Beijing 101300， China; 3.SGS-CSTC Standards Technical Services Co.， Ltd.， （Qingdao）， Qingdao 266071， China）

Abstract： This study was aimed to evaluate the feasibility of coliform detection in food by coliform test tablets. Based on performance indicator verification requirements of international standard ISO16140-2：2016， MicroFast? coliform test tablets method was used for evaluation， including inclusivity， exclusivity， and consistency with"GB 4789.3—2016 method， and t-test and Bland-Altman analysis were used for consistency analysis and evaluation. The 16 target strains all grew typical colonies on the test tablets， and 23 of the 24 non-target strains had no colonies on the test tablets. Salmonella Abatetuba ATCC 35640 formed atypical colonies on the test tablets. There was a positive correlation between the test tablets method and the national standard method （R2＞0.976）. The proportion of samples exceeding the 95% confidence interval of the total average value of the difference was 1∶25， which met the ratio requirement of no more than 1∶20. The β-expected tolerance interval （β-ETI） for all food types was ±0.5log10 units， the two methods were in good agreement. MicroFast? coliform count plate had good performance in terms of inclusivity and exclusivity to pure strains， met the requirements of ISO16140-2：2016 for method equivalence in terms of consistency. It can be used as an alternative method for testing coliforms in food.

Keywords： test tablets method; coliforms; plate count method

大腸菌群（Coliforms）是指在一定培養條件下能發酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌[1]。大腸菌群是表明食品衛生狀況的指示菌，已經規定了49種食品大腸菌群的限量指標[2]，大腸菌群作為食品衛生管理和安全性評價的微生物檢測項目越來越受到人們的重視[3]。

目前，食品中大腸菌群計數的常規方法是平板計數法，主要參照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》（GB 4789.3—2016）[1]進行檢驗，該方法雖然是微生物檢驗的“金標準”，但其操作流程復雜，工作量較大且對操作人員的經驗要求較高，致使檢測效率不高[4]。隨著國際交流合作的開展、標準的進一步互認，逐漸出現多種經過國際權威組織認證的即用型大腸菌群檢測產品，如測試片等[5]。測試片主要成分包括顯色劑（由顯色基團和微生物代謝物組成）、培養基、冷水可凝膠等，微生物生長代謝產生的酶與顯色劑中的特定代謝物反應，使顯色基團顯色[6]。測試片法操作簡單，結果易觀察，誤差小。大腸菌群測試片操作簡單，結果判定符合GB 4789.3—2016中對大腸菌群“產酸、產氣”的定義，培養時間僅18～24 h[7]，實驗工作效率高。因此，測試片法在食品檢測領域應用廣泛。許金榜[8]采用大腸菌群4種目標菌對測試片和VRBA進行分離與選擇性比較，結果表明，VRBA和測試片的檢測性能均可滿足大腸菌群的定量檢測要求。

本研究擬采用MicroFast?大腸菌群測試片，以平板計數法[1]為參考方法，參考國際標準ISO 16140-2：2016[9]的性能指標驗證要求，對測試片法進行包容性、排他性及方法一致性驗證。

1 材料與方法

1.1 試劑及設備

MicroFast?大腸菌群測試片，北京美正生物科技有限公司；營養肉湯、磷酸鹽緩沖液、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂、煌綠乳糖膽鹽肉湯，北京陸橋技術股份有限公司。BAGMIXER 400均質器，法國Interscienc公司；VORTEX GENIUS3渦旋振蕩器，德國IKA公司；LRH-250恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 菌株

目標菌株共16株，包括大腸埃希氏菌（Escherichia coli，CGMCC 1.0090；ATCC 25922；ATCC 8739；CICC 23657；CICC 10305；CICC 10354；ATCC 8099）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella peneumoniae，ATCC 4352）、產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes，ATCC 13048）、莫金斯克羅諾桿菌（C. muytjensii，ATCC 51239）、腸產毒性大腸埃希氏菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，CICC 10667）、腸侵襲性大腸埃希氏菌（Enteroinvasive Escherichia coli，CICC 10662）、大腸埃希氏菌O157（Escherichia coli O157，CICC 10907）、腸道致病性大腸埃希氏菌（Enteropathogenic Escherichia coli，CICC 24189）、腸道出血性大腸埃希氏菌（Enterohemorrhagic Escherichia"coli，CICC 24187）、腸道集聚性大腸埃希氏菌（Enteroag-gregative Escherichia coli，CICC 24186）。

非目標菌株共24株，包括阿巴特圖巴沙門氏菌（S. abaetetuba，ATCC 35640）、銅綠假單胞菌（P. aeruginosa，ATCC 9027）、銅綠假單胞菌（P. aeruginosa，AS 1.1129）、銅綠假單胞菌（P. aeruginosa，ATCC15442）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri，ATCC 12022）、屎腸球菌（Enterococcus faecium，ATCC 8459）、副溶血性弧菌（Vibrio para，ATCC 17802）、金黃色葡萄球菌（S. aureas，ATCC 6538）、金黃色葡萄球菌（S. aureas，ATCC 25923）、金黃色葡萄球菌（S. aureas，ATCC 6538p）、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，ATCC 49619）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis，ATCC 33186）、熒光假單胞菌（P. fluoresoens，ATCC 13525）、德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus，CICC 6045）、伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii，CICC 21663）、英諾克李斯特氏菌（Listeria innocua，CICC 10297）、蠟樣芽孢桿菌（B. cereus，ATCC 11778）、蠟樣芽孢桿菌（B. cereus，CMCC 63301）、釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes，CICC 10373）、萊士曼氏乳酸桿菌（Lactobacillus leichmannii，ATCC 7830）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus casei spp. rhamnosus，ATCC 7469）、單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，ATCC 19115）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis，ATCC 11774）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis，ATCC 6633）。

1.3 食品基質

選用5大類食品類型，每個大類選擇6種食品基質，包括市售乳及乳制品，冷凍飲品，水果和蔬菜，肉及肉制品，糧食和糧食制品。其中22種采取人工污染接種方式的食品基質見表1。

1.4 試驗方法

1.4.1 參考方法

以《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》（GB 4789.3—2016）[1]中的平板計數法為參考方法。

1.4.2 測試片法

參照MicroFast?大腸菌群測試片說明書進行操作。打開測試片覆蓋膜，將1 mL樣液滴入培養基中央，慢慢蓋上蓋膜，待樣液完全滲入培養基內，置于恒溫培養箱內，（36±1）℃培養18～24 h，計數測試片上帶氣泡的紅色菌落。

1.4.3 包容性和排他性驗證

分別將目標菌和非目標菌共40株進行復蘇培養后，梯度稀釋成濃度為10～100 CFU·mL-1的菌液，分別取上述菌液1 mL添加到測試片上，（36±1）℃培養18～24 h，觀察菌落生長情況和菌落形態。

1.4.4 方法一致性驗證

（1）菌株準備。選用大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、肺炎克雷伯氏菌（ATCC 4352）和產氣腸桿菌（ATCC 13048）3株陽性菌作為目標菌，復蘇培養后，梯度稀釋成濃度為250～2 500 CFU·mL-1、2 500～25 000 CFU·mL-1 和25 000～250 000 CFU·mL-1的低、中、高3種濃度的菌液。

（2）樣本準備。食品基質選擇自然污染樣品和人工添加樣品，每個食品類型的基質包括低、中、高3種污染水平，每種食品基質做5個重復測試。因為食品基質含有背景菌，所以只添加目標陽性菌。每個樣品稱取5份，每份25 g，分別加入1 mL 1.4.4（1）中對應濃度的目標菌，使得每份樣品中目標菌的含量為低濃度10～100 CFU·g-1、中濃度100～1 000 CFU·g-1、高濃度1 000～10 000 CFU·g-1。

（3）樣品測試。在制備好的樣本中加入225 mL無菌生理鹽水，用BAGMIXER 400均質器拍打2 min，制成1∶10的樣品勻液。吸取1∶10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注入盛有9 mL稀釋液的無菌試管中，在渦旋振蕩器上振蕩混勻，制成1∶100的樣品勻液。按照上述操作制備梯度稀釋液。選擇3個適宜稀釋度的稀釋液，分別按照參考方法和測試片法進行測試。

1.5 數據處理

為方便統計，以10為底對檢測結果取對數。使用t-檢驗分析測試片法和參考方法的偏倚范圍和β-期望容忍區間，使用Bland-Altman方法，采用Microsoft Excel繪制散點圖評估測試片法與參考方法的一致性。

2 結果與分析

2.1 包容性和排他性驗證試驗結果

培養后對MicroFast?大腸菌群測試片上的菌落形態進行觀察，16株目標菌在MicroFast?大腸菌群測試片上均長出紅色有氣泡的典型菌落，24株非目標菌中的23株未在測試片上形成菌落，只有阿巴特圖巴沙門氏菌ATCC 35640在測試片上形成非典型菌落，MicroFast?大腸菌群測試片法的包容性和排他性均非常良好。

2.2 方法一致性驗證結果

參考ISO 16140-2：2016中的性能指標，以GB 4789.3—2016平板計數法為參考方法，分析MicroFast?大腸菌群測試片法對每種食品類型的檢測結果在線性、相對正確度、準確度方面的性能。

2.2.1 線性分析

以參考方法檢測結果x為橫坐標，測試片法檢測結果y為縱坐標，繪制5種食品類型的散點圖，見圖1。計算各食品類型的直線回歸方程，相關系數（R2）分別為乳制品0.986 3，冷凍飲品0.976 5，水果和蔬菜0.996 2，肉及肉制品0.979 0，糧食和糧食制品0.997 7。

上述結果說明，大腸菌群測試片法與參考方法檢測結果呈正相關。

2.2.2 相對正確度分析

使用Bland-Altman方法分析獲得的檢測結果，計算參考方法和測試片法的平均值和差值。偏倚可以用這兩種方法測定結果差值的平均值D進行估計，平均值D的變異情況則用差值的標準偏差SD描述。檢測的5大類150個樣品的差值在-0.477 1～0.845 1，所有樣品的差值的總平均值為-0.010 5，標準偏差為0.144 7。按照公式（1）計算所有樣品差值的總平均值的95%置信區間為（-0.298 0，0.277 0）。95%置信區間的計算公式為

式中：D為兩種方法檢測結果的差值的平均值；T為t-分布的百分位數；SD為兩種方法檢測結果差值的標準偏差；n為成對數據的個數。

以兩種檢測方法結果的平均值A為橫坐標，以兩種檢測方法結果的差值D為縱坐標繪制散點圖，見圖2。由散點圖可以看出，偏離比較大的樣品的檢測結果均＜2lg CFU·g-1（即＜100 CFU·g-1）。因平板計數法更適用于高濃度污染樣品的檢測，對于含量在100 CFU·g-1以下的檢測結果會有較大的偏差。整體來看，150個樣品中超出差值的總平均值的95%置信區間的樣品數量為6，比例為1∶25，滿足ISO 16140-2：2016中要求的不得高于1∶20的比例，所以在相對正確度上測試片法符合性能指標要求。

2.2.3 準確度分析

對人工污染樣品，通過比較參考方法和測試片法結果，進行準確度分析。對每種樣品的5個平行測試結果取中間值，測試片法結果的中間值（Zi）的β-期望容忍區間（β-ETI）的計算公式為

式中：β-ETI為測試片法結果的中間值（Zi）的β-期望容忍區間；偏倚Bi為測試片法結果的中間值（Zi）與參考方法結果的中間值（Mi）的差值，Salt為Zi的標準偏差，計算結果詳見表1。

根據ISO 16140-2：2016的要求，準確度的可接受性限值AL=±0.5對數單位。由表1可知，所有食品類型的β-期望容忍區間（β-ETI）的上限值和下限值均在可接受性限值范圍內。所以可認為測試片法與參考方法是等效的。

驗證結果表明，測試片法在對純菌株的包容性和排他性方面的性能良好，目標菌均呈現典型菌落形態，非目標菌不能生長或呈現非典型菌落形態；與參考方法的檢測結果呈現良好的線性關系，在相對正確度和準確度方面也均符合ISO 16140-2：2016對于方法等效性的要求。根據本次評估數據，測試片法可以用于檢測食品中的大腸菌群項目。

3 結論與討論

本研究以GB 4789.3—2016平板計數法為參考方法，依據ISO 16140-2：2016中的性能指標驗證要求，對MicroFast?大腸菌群測試片法進行包容性、排他性及方法一致性驗證，選用40株標準菌株，5大類食品150個樣本，使用t-檢驗分析和Bland-Altman分析方法對結果一致性進行分析。

使用Bland-Altman方法分析GB 4789.3—2016平板計數法和MicroFast?大腸菌群測試片方法結果，5大類150個樣品的差值在-0.477 1～0.845 1，所有樣品差值的總平均值為-0.010 5，標準偏差為0.144 7。

150個樣品中超出差值總平均值的95%置信區間的樣品數量為6，比例為1∶25，滿足ISO 16140-2：2016中要求的不得高于1∶20的比例，所以在相對正確度上MicroFast?大腸菌群測試片方法符合性能指標要求。

對人工污染樣品，通過比較GB 4789.3—2016平板計數法和MicroFast?大腸菌群測試片方法結果，進行準確度分析。所有食品類型的β-期望容忍區間（β-ETI）的上限值均小于0.5對數單位，下限值均大于-0.5對數單位。所以，可以認為MicroFast?大腸菌群測試片方法與GB 4789.3—2016平板計數法等效。

綜上所述，MicroFast?大腸菌群測試片方法與GB 4789.3—2016平板計數法具有很好的一致性和等效性，且測試片法在檢驗的前期準備和后續驗證方面比國標法更簡便省時，提高了檢驗的效率，且其輕便的包裝節省空間，具有一定的優勢。在此，也建議GB4789.3—2016在修訂過程中引入大腸菌群測試片方法，對于提高實驗室檢測效率、準確度等具有重要意義。

參考文獻

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作者簡介：陶文靖（1987—），女，山東青島人，碩士，工程師。研究方向：微生物檢驗技術和標準制修訂。

通信作者：王琦（1985—），女，山東青島人，本科，工程師。研究方向：微生物檢驗技術和食品污染控制。E-mail： catherine-q.wang@sgs.com。