注射用鹽酸多西環素質量評價

傅小雅?劉月

摘要：目的 對國產注射用鹽酸多西環素的質量現狀進行評價。方法 采用法定標準對86批抽檢樣品進行檢驗；結合注射劑一致性評價要求，利用參比制劑，通過對原料藥精制工藝、維生素C質量控制、制劑處方工藝、包材、有關物質及血管刺激性試驗和溶血試驗等關鍵項目的比較研究，分析不同企業制劑的質量差異及現行標準的合理性。 結果 86批樣品法定檢驗合格率為100%。探索性研究優化了有關物質測定方法，并對雜質來源進行了歸屬；建立了主要輔料維生素C的雜質和含量檢測方法；發現使用未精制原料的企業，雜質含量明顯高于使用精制原料的企業；國內仿制制劑與參比制劑在性狀、灌裝量、包材、有關物質及穩定性等方面存在差異；發現制劑使用與臨床不良反應間的相關性。 結論 國內三家生產企業質量狀況分別為“好、一般、差”，與參比制劑在一些質量屬性方面存在差異，建議國內企業優化生產工藝尤其是冷凍干燥工藝及使用更好質量的包材以提升產品質量；現行標準可進一步提高。

關鍵詞：注射用鹽酸多西環素；評價性抽驗；質量評價；一致性評價；有關物質；維生素C

中圖分類號：R978.1，R917文獻標志碼：A

Quality evaluation of doxycycline hyclate? for injection

Fu Xiaoya and Liu Yue

（Hainan Provincial Institute of Inspection and Testing Drug Control，Haikou 570216）

Abstract Objective The quality of domestic doxycycline hydrochloride for injection was evaluated. MethodsA total of 86 batches of samples underwent testing in accordance with the prescribed regulatory criteria. According to the requirements of consistency evaluation of injections， the quality difference of preparations from different enterprises and the rationality of current standards were analyzed by comparing the refining process of apis， quality control of vitamin C， formulation process， packaging materials， related substances， vascular irritation test and hemolysis test with reference preparations. Results The qualified rate of 86 batches of samples was 100%. The method of determination of related substances was optimized and the source of impurities was attributed. The method of impurity and content determination of vitamin C was established. It was found that the impurity content of the enterprises using unrefined raw materials was obviously higher than that of the enterprises using refined raw materials. There were differences in properties， filling amount， packing materials， related substances and stability between the domestic generic preparation and the reference preparation. Associations were found between clinical use and adverse reactions. Conclusion The quality status of the three domestic production enterprises was “good， average and poor” respectively， and there were differences in some quality attributes with the reference preparations. It was recommended that domestic enterprises optimize the production process， especially the freeze-drying process and the use of better quality packaging materials toimprove product quality. Current standards could be further improved.

Key words Doxycycline hydrochloride for injection; Evaluative testing; Quality evaluation; Consistency evaluation;? Impurity; Vitamin C

多西環素是四環素類抗生素，能特異性地與細菌核糖體30S亞基的A位置結合，抑制肽鏈的增長和影響細菌蛋白質的合成[1]，是目前臨床上常用的抗菌活性最強的四環素類抗生素[2]。鹽酸多西環素最早是由美國Pfizer公司研發，1967年12月6日其膠囊劑獲FDA批準，1972年9月5日注射用鹽酸多西環素（商品名：VIBRAMYCIN）被FDA批準上市。多西環素注射劑克服了口服刺激胃腸道的缺點，臨床主要用于立克次體屬等微生物以及革蘭陰性菌引起的感染。不良反應有胃腸道反應、肝腎毒性、免疫及血液系統損害等[3]。

注射用鹽酸多西環素國內現行質量標準有YBH09982008、YBH02832019、WS1-（X-012）-2014Z，美國藥典2023在線版[4]亦有收載。國內現有4家生產單位和6個批準文號，規格有0.1 g和0.2 g。注射用鹽酸多西環素為2023年國家評價性抽驗品種，抽驗涉及國內24個省、自治區和直轄市的藥品生產、經營和使用單位，共獲得86批次樣品，涉及3家生產企業（A、B、C企業），各生產企業處方中均采用維生素C作為抗氧劑（表1）。本文采用現行法定標準對全部抽檢樣品進行檢驗，依據發現的問題開展探索性研究；對當前注射用鹽酸多西環素的質量狀況進行客觀評價和分析。

1 儀器及試藥

1.1 儀器

LC-20AD高效液相色譜儀（Shimadzu）；Agilent 1260 高效液相色譜儀（Agilent）；XS205電子天平（Mettler Toledo）；D8 ADVANCE多晶X射線衍射儀（Bruker）；NKT 2010-L激光粒度儀（山東耐克特分析儀器有限公司）；LHH-250GSP綜合藥品穩定性試驗箱（上海一恒科學儀器有限公司）；Leica DM2500型偏光顯微鏡（Leica）等。

1.2 試藥

86批次注射用鹽酸多西環素均為2023年度國家藥品評價性抽驗樣品，涉及3家生產企業（A、B、C企業），一種規格0.1g；參比制劑為Fresenius Kabi USA LLC生產的商品名為DOXY100的產品（批號：6023593）。

多西環素對照品（批號：130485-202104） 、β-多西環素（即雜質A，批號：130405-200907）、美他環素（即雜質B，批號：130499-200802）、土霉素（即雜質E，批號：130487-201321）、維生素C（批號：100425-201504）均來自中國食品藥品檢定研究院；雜質C（批號：CPD-2106051B）、雜質D（批號：CPD-2004121B）、雜質F（批號：CPD-2007061A）均來源于奧遜（上海）生物科技有限公司；糠醛（批號：B2315432）來源于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

乙腈為色譜純（西隴化工）， N，N-二甲基甲酰胺、磷酸、三乙胺、冰醋酸等試劑均為分析純（廣州化學試劑廠），實驗用水均為超純水。

2 試驗方法

2.1 法定檢驗

按照藥品標準YBH09982008和WS1-（X-012）-2014Z，對86批注射用鹽酸多西環素進行檢驗。主要檢驗項目包括性狀、鑒別、酸度、溶液的澄清度與顏色、有關物質、雜質吸光度、干燥失重、細菌內毒素、無菌及含量測定等。

2.2 探索性研究

2.2.1 原料藥精制工藝

制劑三家生產企業（A、B和C企業）中C企業未對原料藥進行精制。通過目視法檢視原料藥的性狀、流動性，采用新優化的有關物質檢驗方法對雜質進行比對，采用偏光顯微鏡及粉末X射線衍射分析測試晶型，并進行粒度和粒度分布測試，比較精制前后原料質量的差異，確定精制工藝的必要性和不同精制工藝的差異性，評估原料藥精制工藝對終產品制劑質量的影響。

2.2.2 維生素C質量控制

維生素C的主要降解產物是草酸和糠醛，建立 HPLC法測定其雜質及含量。糠醛在有關物質檢測中同時進行。

草酸HPLC檢測方法[5]：采用資生堂Agilent ZORBAX Extend C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，

5 μm）；以磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鉀1.36 g，加水500 mL溶解后，加10%四丁基氫氧化銨溶液32 mL，加水至1000 mL，用磷酸調節pH值至6.5）-乙腈（80：20）為流動相；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長205 nm；進樣體積20 μL，樣品室溫度5 ℃。

維生素C HPLC含量檢測方法：采用Agilent ZORBAX SB-C18 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm），以磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L磷酸二氫鉀，用磷酸調pH至2.55，用0.22 μm濾膜過濾）為流動相。流速為

0.6 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測波長245 nm；進樣體積2 μL；樣品室溫度4 ℃；運行時間10 min。

2.2.3 制劑處方工藝、包材、配伍合理性分析

①測定制劑晶體形態，結合各企業凍干工藝參數，分析不同制劑產品質量差異的原因。

②模擬實際生產工藝，選擇不同溫度（20 ℃和

30 ℃）、5個配比（原料與不同輔料搭配）、時間（0、6和12 h）等條件進行配液溫度、藥液存放時間及原輔料兼容性試驗考察。

③參比制劑存在過量灌裝，因而開展灌裝量分析，即按參比制劑說明書臨床用法對樣品復溶后開展抽提試驗，測定西林瓶中的殘留量和注射器中的死體積，計算臨床使用中損失量。

④藥物和包材相容性試驗選擇在40 ℃下，同一批次A企業制劑分別置低硼硅與中硼硅玻璃管制注射劑瓶，分別在0、5、10、20和30 d取樣檢測，同步進行參比制劑的比較。

2.2.4 HPLC法測定有關物質

在現行標準的有關物質檢測方法基礎上，以有效分離注射用鹽酸多西環素的主要已知雜質為目標，對HPLC方法進行了優化。

色譜條件：采用資生堂Agilent ZORBAX Extend C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以醋酸鹽緩沖液[0.25 mol/L醋酸銨溶液-0.1 mol/L乙二胺四醋酸二鈉溶液-三乙胺（100：10：1），用冰醋酸或氨水調節pH值至8.8]-乙腈（87：13）為流動相；流速為1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；檢測波長280 nm；進樣體積20 μL。

2.2.5 血管刺激性試驗和溶血試驗[6-7]

血管刺激性試驗：成年家兔15只分為3組，采用同體左右側自身比對法，各家兔右側耳緣靜脈給予各組供試品溶液，左側耳緣靜脈均給予等體積的0.9%氯化鈉注射液作為陰性對照。每天給藥總量為臨床擬用最高劑量5 mg/kg BW，1次/d，連續給藥3 d。觀察注射部位、給藥血管局部及周圍組織的變化，并進行組織病理學檢查：剖檢及光鏡下觀察。

體外試管法溶血試驗：采用1 mg/mL的供試品溶液；取試管22支，依次加入2%兔紅細胞混懸液、0.9%氯化鈉注射液、超純水、3家生產單位的注射用鹽酸多西環素，置37 ℃±0.5 ℃的恒溫水浴鍋中孵育3 h。分別在15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、3 h 各時間點取出試管，觀察有無溶血或紅細胞凝聚現象，有疑似凝聚結果出現時進行顯微鏡檢查。

3 結果與討論

3.1 法定檢驗結果

按現行法定標準檢驗，86批注射用鹽酸多西環素全部符合規定，合格率為100%。

3.2 法定檢驗中發現的問題

法定檢驗中發現以下問題：①C企業使用的原料為非注射級，且未對使用的原料進行精制，使得其制劑的溶液顏色及產品中原料工藝雜質的檢出量大于A、B企業及參比制劑，尤其是多批次制劑的雜質A接近不合格限度；②現行質量標準有關物質檢測方法不完善，缺少對主要輔料維生素C的雜質和含量測定；③參比制劑存在過量灌裝，國內3家生產企業未考慮注射劑在臨床實際使用中存在的約3%的抽提損失量；④國內生產企業均采用低硼硅玻璃管制注射劑瓶，參比制劑采用中硼硅，本品為偏酸產品，低硼硅包裝不能確保產品質量。

3.3 探索性研究

3.3.1 原料藥精制工藝的探討

目前國內尚無注射用鹽酸多西環素原料藥上市。參比制劑及國內3家生產企業（A、B、C企業）中僅C企業未對原料藥精制后使用。原料精制后粉末顏色變淺，流動性改善，雜質含量降低，工藝雜質A、雜質F及總雜質均有所下降。如A企業的原料，精制后雜質A由1.27%降低至0.14%、雜質F由0.60%降低至0.21%、總雜質由2.09%降低至0.73%。各企業的精制工藝基本是原料合成工藝中的最后一步酸乙醇成鹽工序的重復。A企業精制品的雜質下降幅度大于B企業；相較于A企業，B企業精制工藝缺少酸化步驟；酸化通過維持pH環境，避免雜質降解，且可增加原料的溶解度；說明A企業的精制工藝優于B企業。精制前后原料藥的晶型沒有變化，但粒度有變化。考慮本品制劑工藝的原料需溶解，因而認為原料的晶型及粒度對制劑質量的影響較小。

3.3.2 維生素C質量控制

主要輔料維生素C作為抗氧劑保護鹽酸多西環素免于氧化降解。維生素C在處方中的占比接近50%，且本身不穩定，但A、B、C企業均未對維生素C的含量及氧化降解雜質草酸進行控制。對86批次樣品中的維生素C含量進行測定，其范圍為96.75%～103.06%，參比制劑為107.95%；所有樣品包括參比制劑中均未檢出草酸。

3.3.3 有關物質分析

根據鹽酸多西環素合成路線及降解途徑分析注射用鹽酸多西環素中雜質的可能來源。鹽酸多西環素以土霉素（雜質E）為起始原料，在中間產物美他環素（雜質B）轉變成多西環素的過程中，β-多西環素（雜質A）為副產物。發生差向異構化形成4-表多西環素（雜質C），4，6-表多西環素（雜質D）是β-多西環素的4-表異構體，是一種次要的衍生物。土霉素（雜質E）發酵過程中產生的2-乙酰-2-脫氨甲酰土霉素在鹽酸多西環素生產中會轉換成2-乙酰-2脫氨甲酰多西環素（雜質F）。輔料維生素C在有氧條件的降解產物是草酸，無氧條件下則為糠醛。優化后的有關物質分析方法的典型色譜圖見圖1。

86批次抽檢樣品及1批次參比制劑中的雜質均主要為A、B、C。已過效期的參比制劑中雜質的檢出情況明顯好于A、C企業。對國產不同企業的產品進行比較，彼此間差異十分明顯（圖2）：①雜質A：參比制劑檢出結果為0.59%；未對原料進行精制的C企業產品的均值為1.74%，遠大于A企業均值0.60%和B企業均值0.96%；②雜質B：參比制劑未檢出；A企業產品含量集中在0.25%左右，高于B、C企業；③雜質C：A、B企業的產品中含量較為接近，C企業產品的含量范圍為0.17%～0.74%，數據批間分離較大，其可能原因是其配液的溫度最高，雜質C的含量與制劑配液溫度的高低相對應。雜質含量與制劑工藝明顯相關。

3.3.4 制劑處方工藝、包材、配伍合理性分析

（1）國內仿制制劑與參比制劑的外觀存在明顯差異。參比制劑外觀良好，無分層、破碎、顏色不均勻的情況；A、C企業存在凍干餅塊顏色不均勻，A企業還存在破碎的情況。

（2）國內B企業的產品處方與參比的處方一致，粉末X射線衍射分析其衍射圖譜基本一致，僅強度略有不同（圖3），不僅可判斷二者的晶型基本一致，且說明B企業的預凍、升華溫度等凍干參數接近參比制劑[8-9]。

（3）制劑過程中鹽酸多西環素的降解反應，特別是異構化反應與配液溫度、配液時間、配液完成到除菌過濾的時限有直接的關系。鹽酸多西環素水溶液的穩定性極差，會發生氧化、水解、異構化等多種降解反應，其中差向異構化形成的雜質C是其主要降解反應。在溶液狀態下，輔料維生素C會加劇差向異構化降解形成雜質C，通常前6 h的降解反應比較激烈，6 h之后放緩。

（4）國內生產企業均采用低硼硅玻璃瓶，參比制劑采用中硼硅玻璃瓶。置低硼硅玻璃瓶中的樣品溶液，放置30 d后色調發生改變，顏色由黃綠色4號變成黃色6號；置中硼硅的樣品溶液與參比制劑溶液顏色變化情況基本一致，色調未改變，顏色變成黃綠色5號；雜質變化趨勢：低硼硅＞中硼硅＞參比制劑，尤其是雜質C的增加趨勢最明顯。此外，偏酸性的注射用鹽酸多西環素對溫度敏感，其在中硼硅玻璃瓶中與在低硼硅玻璃瓶中相比具有更好的熱穩定性和化學穩定性（耐酸、堿）。

3.3.5 血管刺激性試驗和溶血試驗

血管刺激性試驗顯示，在臨床使用濃度下

（1 mg/mL），3家企業的制劑對家兔耳緣靜脈有明顯刺激性反應，與注射部位及血管損害、靜脈炎、血管炎及血管刺激等不良反應存在相關性。體外試管法溶血試驗表明，在臨床使用濃度下樣品對家兔紅細胞混懸液具有溶血作用，3家企業的樣品結果基本一致，與說明書中對血液系統的不良反應報道，如溶血性貧血、血小板減少癥、中性白細胞減少癥和嗜酸性粒細胞增多可能存在相關性。即注射用鹽酸多西環素自身存在較明顯的不良反應。

4 結論

本次國家評價性抽驗采用前期調研、文獻檢索、法定標準檢驗結合探索性研究的方式對3家企業86批次注射用鹽酸多西環素的質量進行了評價。探索性研究以有關物質、草酸、維生素C含量、鹽酸多西環素含量等為指標，對不同的制劑過程、包材、配伍合理性等進行了比較，并對國內現行標準（YBH02832019、WS1-（X-012）-2014Z、YBH09982008）的質控能力進行了評價。與參比制劑相比較，國產制劑的有關物質控制差距較大。對現行標準進行評價，標準YBH02832019“好”，標準 “一般”，標準YBH09982008“差”；對不同企業產品進行評價，B企業產品質量“好”，A企業產品質量“一般”，C企業產品質量“差”。

建議C企業在制劑過程增加對原料的精制，提高質控標準，使用更好的包材。在臨床使用中需關注產品自身的不良反應，特別是患者注射部位及血管的刺激情況；臨床如長期使用應關注患者的血項指標。

參 考 文 獻

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作者簡介：傅小雅，女，生于1973年，副主任藥師，主要從事藥品檢驗及藥品質量研究工作，E-mail： 911794134@qq.com

第一作者：傅小雅，女，生于1973年，畢業于中國藥科大學藥學專業，副主任藥師，1995年起至今就職于海南省藥品檢驗所，主要從事藥品檢驗及藥品質量研究工作，承擔并完成多個品種國家評價性抽驗工作、質量標準的起草與復核、國家藥品標準提高、進口藥品標準復核等工作。