基于MAPK信號通路探討中醫藥治療肝癌的研究進展

張格松 蔣士卿

肝癌是全球常見的惡性腫瘤之一,其分子機制尚未完全明了。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路是生物體內重要的信號轉導系統之一,在細胞的生長、分化、凋亡和死亡過程中起著至關重要的作用[1]。肝癌的發生、發展、侵襲和轉移都與MAPK信號通路的異常活化密切相關[2]。大量臨床實踐已證實,中醫藥在預防肝癌發生、抑制復發轉移、減輕疾病痛苦、延長壽命等方面有著獨特的優勢。中醫藥治療是肝癌綜合治療的一個重要組成部分,應當參與肝癌防治的全過程,也是提高肝癌綜合療效的重要途徑之一[3]。本文概述中醫藥通過干預MAPK通路及有關靶蛋白治療肝癌的機制,以期為中醫藥干預肝癌臨床與科研提供更多思路。

MAPK是一種廣泛存在于真核細胞中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,可將細胞外的多種刺激傳導至細胞內介導各種細胞反應。目前研究發現的MAPK家族信號通路主要有細胞外信號調控激酶1/2(extracellular signal regulated kinase,ERK1/2)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)以及細胞外信號調控激酶5(ERK5)四條途徑,盡管每條MAPK通路都具有其獨特的特征,但迄今為止所研究的MAPK通路都存在著許多共性,都是通過三級激酶級聯反應的方式將細胞外的信號傳達至細胞內,從而調節細胞的生長、分化、凋亡等多種生理和病理過程[4]。目前,ERK1/2、p38、JNK這三條通路研究最廣泛,每條通路可以由不同的刺激因素激活,具有相對獨立的功能,但這些通路之間也存在著廣泛的相關性,具有相互協同或抑制的作用[5]。

根據肝癌的病因及其臨床表現,可以將其歸為中醫的“肝積”“臌脹”“黃疸”“脅痛”等病范疇。肝癌為有形之結塊積聚于脅下,由于陰陽失和、情志失調、飲食勞倦等原因導致臟腑功能失司,氣血津液運行失常,產生氣滯、血瘀、痰凝等病理產物,蘊結于臟腑,相互搏結,日久化為癌毒,癌毒漸耗正氣,邪毒趁虛而入,凝于肝膽,久而為積,肝癌乃成[6]。肝癌初期病機以肝失疏泄,氣機郁結為主,本期可無臨床癥狀,難以發現;由于肝病易傳于脾,中期多為肝脾同病,木郁土虛,本期常有腹脹、納差、腹瀉等表現,臨床中也發現肝癌患者多以消化道癥狀為首發表現;晚期癌毒擴散,正虛邪盛,精氣血虛極,肝脾腎同病[7]。中醫藥治療肝癌重視辨證論治,合理配伍用藥,攻補兼施,標本兼顧,在減輕病人疾病痛苦、抑制腫瘤復發、延長壽命等方面具有極大的優勢。

1 中藥基于MAPK信號通路誘導肝癌細胞凋亡的機制研究

細胞凋亡對機體的組織分化、器官發育和穩態維持有著重要的意義,而腫瘤細胞可使凋亡信號失調,異常激活抗凋亡系統,逃避凋亡或程序性細胞死亡,從而導致惡性腫瘤發生發展。目前,研究最廣泛的凋亡蛋白有半胱氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族和B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)家族。MAPK通路可以調節促凋亡蛋白(如Bax、Bad等)和抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-xL等)的表達,當促凋亡蛋白表達相對增加時會導致線粒體外膜的通透性增加,從而誘發細胞色素c的釋放,進一步激活Caspase級聯反應導致細胞凋亡[8]。

吳茱萸堿是吳茱萸發揮抗腫瘤作用的主要成分,黎彩云[9]通過體內和體外實驗發現吳茱萸堿可以抑制肝癌細胞增殖、促進肝癌細胞凋亡,并證實其是通過激活ERK、p38MAPK信號通路和上調促進凋亡Cleaved parp蛋白下調抑制凋亡Bcl-2蛋白表達,來實現抗肝癌作用。He J等[10]發現淫羊藿苷可以增加人肝癌HepG2細胞中的Bax/Bcl-2比率和激活Caspase-3誘導細胞凋亡,并同時上調JNK1的表達,使用JNK通路特異性抑制劑SP600125后淫羊藿苷誘導細胞凋亡的作用被抑制;說明淫羊藿苷通過激活JNK通路來誘導肝癌細胞凋亡。Wang WZ等[11]人研究發現經姜黃素處理后的人肝癌Huh7細胞中p38MAPK信號通路迅速激活,同時Huh7細胞中的Fas和其配體FasL快速顯著增加并激活Caspase-3,當使用p38MAPK通路抑制劑SB203580后肝癌細胞中Fas、FasL、Caspase-3表達顯著降低;由此證明姜黃素通過激活p38MAPK信號通路上調Fas、FasL、Caspase-3蛋白的表達從而誘導細胞凋亡。Lin W等[12]人通過體內外實驗發現,大黃素可以上調肝癌細胞中ERK、p38的磷酸化并輕度抑制JNK磷酸化,體內實驗結果發現大黃素以劑量依賴性方式抑制腫瘤生長并可抑制小鼠的肺轉移;研究證明大黃素在體外和體內均可抑制肝癌細胞增殖并誘導其凋亡,其作用機制可能與MAPK信號通路轉導有關。

鱉甲煎丸首載于《金匱要略》,全方攻補兼施、氣血并調,具有破血消癥、益氣補血之功。常欣峰[13]通過體內和體外實驗發現,鱉甲煎丸通過阻滯ERK信號通路,激活JNK信號通路,同時提高促凋亡蛋白Bax的表達和降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,來促進腫瘤細胞凋亡,起到抗肝癌作用。沈政潔[14]通過Meta分析發現艾迪注射液可以提高肝癌患者生活質量、增強免疫力、降低甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)水平、延長生存期;設計體外細胞實驗證明,艾迪注射液能夠通過抑制ERK1/2通路和激活p38MAPK、JNK通路來下調凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達和上調促凋亡蛋白Bak、Bid、Bax的表達,從而誘導肝癌細胞凋亡。

2 中藥基于MAPK信號通路抑制肝癌細胞增殖的機制研究

腫瘤發生的關鍵在于破壞正常的細胞周期,導致細胞發生惡性增殖,喪失分化能力[15]。細胞周期受多條信號分子和周期蛋白的調控,而MAPK信號通路可以通過調節周期蛋白D(cyclin D)的表達,從而影響細胞增殖[16]。cyclin D是細胞周期蛋白家族的一員,可由促有絲分裂生長因子激活,當細胞生長因子刺激時,通過MAPK通路將增殖信號傳遞至細胞內部,從而使cyclin D合成的增加,cyclin D與細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)結合形成復合物,使下游的蛋白質Rb磷酸化,從而啟動細胞DNA復制,推動細胞周期由G1期進入S期,促進細胞增殖[17]。

張豐華等[18]研究發現柴胡皂苷D(saikosaponin D,SSD)對SMMC-7721肝癌細胞具有明顯的增殖抑制作用且抑制率與SSD的濃度呈正相關;采用流式細胞儀分析發現SMMC-7721肝癌細胞周期明顯阻滯于G0/G1期;其機制可能與上調p38MAPK通路的表達有關,p38MAPK的活化可以抑制cyclin D的表達,阻滯細胞通過G1的檢驗點進入S期[19],從而使細胞分裂停滯于G0/G1期—抑制細胞增殖,發揮抗癌作用。WU WS[20]研究發現柴胡皂苷A(saikosaponin A, SSA)對肝癌細胞的生長也具有抑制作用,這主要是因為SSA可以磷酸化激活ERK,而活化的ERK又可以激活p15(INK4b)和p16(INK4a)表達,p15和p16通過與cyclin D競爭性結合CDKs導致cyclin D無法發揮其作用[21],從而阻滯細胞由G1期進入S期,抑制肝癌細胞的增殖。斑蝥素酸鎂是斑蝥體內強效抗腫瘤活性成分,劉云等[22]發現斑蝥素酸鎂可以抑制蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A, PP2A)活性,而PP2A對MAPK信號通路具有調節作用[23],同時發現經斑蝥素酸鎂處理后的肝癌細胞中ERK1/2磷酸化水平顯著下調;由此推測斑蝥素酸鎂可以通過抑制PP2A活性來阻滯ERK1/2信號通路傳導,進而抑制肝癌細胞增殖。

大柴胡湯出自《傷寒雜病論》,具有和解少陽,清瀉陽明之功,常用于治療肝癌。喬曦等[24]采用體外細胞培養技術發現,大柴胡湯能夠濃度和時間依賴性地抑制肝癌Hepa1-6細胞惡性增殖,并可抑制ERK1/2、JNK、p38MAPK、STAT3蛋白的磷酸化表達;又建立肝癌小鼠模型,經大柴胡湯干預后模型小鼠體內腫瘤體積較前縮小,肝癌組織中的p38MAPK、STAT3磷酸化表達降低,但ERK1/2、JNK磷酸化無明顯改變;通過體內和體外實驗證明,大柴胡湯可能通過下調p38MAPK和STAT3通路的表達來抑制肝癌的發生發展。

3 中藥基于MAPK信號通路抑制肝癌細胞侵襲、轉移的機制研究

侵襲和轉移是惡性腫瘤的特性,也是導致腫瘤治療失敗的主要原因之一。惡性腫瘤的侵襲是發生轉移的前提,腫瘤的轉移過程復雜,主要受細胞外基質(extracellular matrix,ECM)降解、血管生成、上皮—間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)等多種因素影響[25]。

惡性腫瘤發生侵襲和轉移首先要突破ECM,而降解ECM需要多種特異性蛋白酶發揮作用,其中基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)在此過程中發揮了重要作用[26],而MAPK通路的激活可以促進MMP的表達[27]。Chiu YW等[28]發現,經黃芩素處理后的肝癌細胞生長受到抑制、細胞的侵襲能力顯著下降、遷移水平降低;黃芩素還可降低肝癌細胞中MMP-2、MMP-9的活性以及蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和p38蛋白的的磷酸化水平;這表明黃芩素抑制人肝癌細胞增殖、侵襲、轉移的能力與降低p38MAPK通路活性有關。路景濤[29]研究發現,芍藥苷能夠抑制肝癌細胞的侵襲、轉移,其作用機制可能與抑制ERK通路的傳導和降低MMP-9蛋白的表達有關。蟾毒靈是中藥蟾酥的提取物,通過體內和體外實驗證實蟾毒靈能夠通過抑制ERK通路和激活JNK、p38通路來上調促凋亡蛋白Bax的表達和抑制MMP-2的表達,從而發揮其抑制肝癌細胞增殖、侵襲和轉移的作用[30]。人參皂苷Rh2作為人參總皂苷成分之一,可以抑制肝癌Hep G2細胞的遷移,其作用機制主要是通過MAPK通路抑制AP1轉錄因子從而降低MMP3的表達來實現的[31]。

新血管生成為腫瘤的侵襲和轉移提供足夠的營養保障,在新血管的形成過程中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)發揮重要作用,VEGF尤其受體結合后又可進一步激活ERK1/2通路加速腫瘤發展[32]。壁虎粗多肽由壁虎醇提物經鹽析、透析得到的粗提產品;研究發現,壁虎粗多肽可以通過抑制淋巴管生成來發揮抑制肝癌HepG2細胞的增殖和轉移作用,其機制與抑制血管內皮生長因子-C(VEGF-C)表達和下調p-ERK1/2、p-p38MAPK的表達有關[33]。傳統中草藥南蛇藤具有祛風除濕、活血止痛的作用;研究發現南蛇藤提取物可以抑制肝癌淋巴管的生成,具有抗肝癌的作用,其機制可能與抑制ERK1/2及PI3K/Akt通路的傳導和下調VEGF-C表達相關[34]。

EMT是上皮細胞獲得間質特征的過程,EMT后細胞的黏附性和極性降低從而導致細胞的侵襲性和遷移性增強,因此抑制細胞EMT對惡性腫瘤的治療具有重要意義[35]。SNAIL1是轉錄因子的一員,對于誘導和維持EMT至關重要,ERK信號通路的激活可以穩定SNAIL1的表達誘導細胞EMT[36]。迷迭香酸為中藥石見穿中主要活性成分,具有良好的抗腫瘤效果;研究發現迷迭香酸具有抑制肝癌細胞增殖、侵襲和遷移的作用,其作用機制與抑制ERK、Akt、Smad2/3信號通路的傳導和抑制肝癌細胞EMT有關[37]。地五養肝膠囊為湖北省中醫院研制的院內制劑,由熟地黃、五味子、茵陳、姜黃、甘草組成,有補腎養肝、活血通絡的功效,臨床常用于治療慢性肝炎、肝硬化、肝癌等。研究發現,地五養肝膠囊可以抑制肝細胞EMT而促進間質—上皮轉化(epithelial-mesenchymal transition, MET),并能通過下調Ras/Raf/Mek/ERK和JAK/STAT信號通路的表達來發揮其抑制肝癌發生發展作用[38]。Qu J等[39]人研究發現,姜黃素和重組人腺病毒p53(rAd-p53)聯合使用可以通過調節肝癌細胞中ERK1/2、p38MAPK和JNK信號通路來抑制肝癌細胞EMT,與rAd-p53或姜黃素單獨治療相比,二者聯合使用增強了抑制EMT作用。

4 中藥基于MAPK信號通路促進肝癌細胞自噬的機制研究

細胞自噬可以將錯誤折疊的蛋白質、受損或老化的細胞器和突變的蛋白質隔離在稱為自噬體的雙膜囊泡中,最終融合到溶酶體,導致隔離成分的降解,是維持細胞穩態、實現細胞代謝和某些細胞器更新的重要途徑[40]。當細胞自噬功能抑制或缺陷時,會使自噬介導的細胞垃圾處理失敗,導致細胞和組織進行性損傷,從而引發慢性組織損傷和炎癥,這與DNA損傷和活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的產生密切相關,有助于引發癌癥和促進腫瘤進展[41]。MAPK信號通路可以影響Bcl-2、Bcl-xL磷酸化,進一步影響自噬蛋白Beclin-1從Beclin-1-Bcl-2/Bcl-xL復合物中分離,游離的Beclin1可以募集并激活hVps34蛋白并能與之結合復合物,該復合物在促自噬體蛋白結構形成和吞噬泡組裝中起著至關重要的作用[42]。

白花丹醌是從植物藥材白花丹中分離提純所得,具有抗腫瘤、抗炎、殺菌等作用;研究發現,經白花丹醌處理后的肝癌細胞中自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1、ATG5、ATG7表達增加,并可觀察到自噬液泡的形成,從而誘導肝癌細胞凋亡與自噬,其分子機制可能與抑制p38MAPK與PI3K/Akt/mTOR信號通路的相關蛋白磷酸化有關[43]。槐耳是一種藥用真菌,具有抗癌、止血、止痢之功;研究發現槐耳可以顯著提高肝癌細胞中自噬相關蛋白LC3-Ⅱ和Beclin1的表達量,誘導肝癌細胞發生自噬,其作用機制與與抑制p38MAPK信號通路的傳導有關[44]。Wang N等[45]發現黃連素可以通過激活p38 MAPK和抑制Akt通路傳導,從而上調自噬相關蛋白Beclin1的表達來誘導肝癌細胞誘導自噬性死亡。疏肝祛瘀解毒方是由廣東省名中醫林麗珠教授所創的肝癌經驗方,由柴胡、白芍、枳殼、桃仁、山慈菇等藥物組成。前期網絡藥理學研究顯示,疏肝祛瘀解毒方可能通過調控Ras/MAPK信號通路來發揮其抗癌作用;后期通過體外細胞實驗發現,疏肝祛瘀解毒方含藥血清作用于人肝癌HepG2細胞24小時后可以激活Ras/MAPK信號通路和誘導細胞自噬,48小時后可以抑制Ras/MAPK信號通路并能誘導細胞凋亡;以上研究結果表明疏肝祛瘀解毒方可以雙向調節Ras/MAPK信號通路,早期激活肝癌細胞自噬,晚期誘導肝癌細胞凋亡[46]。

5 小結與展望

目前,現代醫學對于肝癌的治療以手術、放化療、介入治療、局部消融等綜合療法為主,這些療法在治療肝癌的同時也帶來了許多毒副反應,輕者降低生活質量,重者放棄治療。隨著近年來對肝癌發病機制的研究逐漸深入,已經證實MAPK信號通路在肝癌的發生發展中起到關鍵性作用,因此通過調節MAPK信號通路的表達可能成為防治肝癌的新方法、新思路。大量研究已證實,多種中藥單體及其活性物質、中藥復方、中成藥可通過調節MAPK信號通路來抑制細胞增殖,誘導細胞凋亡與自噬,影響肝癌侵襲與轉移。

中醫藥基于MAPK信號通路治療肝癌的研究也存在這一些不足:(1)研究主要集中于中藥單體及其活性物質,對經典方劑的研究較少。(2)在多數研究中,僅是得到抗肝癌作用與通路中關鍵蛋白的表達水平相關,但進一步的作用機制研究較少。(3)在一些研究中發現,中醫藥可以同時干預兩條及以上通路,但研究并未深入探討通路之間的相互作用。(4)中醫外治法(如:針灸、艾灸、穴位敷貼等)對肝癌的治療也具有良好療效,但現無關于中醫外治法通過MAPK信號通路治療肝癌的機制研究,有待拓展。(5)研究局限于細胞實驗和動物實驗,缺乏高質量的臨床對照試驗來驗證。雖然本類研究存在著許多不足,但隨著研究的不斷深入,中醫藥必將為肝癌患者帶來更多希望。