地紅方通過miR-133b/DUSP1/JNK通路干預糖尿病腎病氧化應激損傷

林姿 何衛東 杜思哲

*基金項目：福建省自然科學基金（2021J01896）；福建省衛生健康青年科研課題（2021QNA054）

第一作者簡介：林姿（1987-），女，主治醫師，研究方向：糖尿病及其并發癥中醫藥防治。

摘要：目的? 研究地紅方對糖尿病腎病細胞模型氧化應激損傷的影響。方法? 地紅方含藥血清制備，小鼠腎小球系膜細胞常規培養、傳代。按以下分組：對照組（5.5mmol/L葡萄糖+正常血清）、高糖組（30mmol/L葡萄糖+正常血清）、地紅方低劑量組（30mmol/L葡萄糖+5%地紅方含藥血清）、地紅方中劑量組（30mmol/L葡萄糖+10%地紅方含藥血清）、地紅方高劑量組（30mmol/L葡萄糖+20%地紅方含藥血清）。采用實時熒光定量PCR檢測miR-133b、DUSP1 mRNA表達。Western blotting檢測DUSP1、p-JNK、Drp1、Fis1蛋白表達。Elisa檢測SOD、MDA表達。結果? 與高糖組比較，地紅方組miR-133b、MDA、p-JNK、Drp1、Fis1表達明顯下降（P<0.05），而DUSP1、SOD表達顯著升高（P<0.05）。結論? 地紅方可通過miR-133b/DUSP1/JNK通路調控線粒體分裂改善糖尿病腎病氧化應激損傷。

關鍵詞：地紅方；糖尿病腎病；miR-133b；DUSP1；JNK；氧化應激

中圖分類號：R587.1??? 文獻標志碼：A??? 文章編號：1007-2349（2024）05-0080-05

Study on the Intervention of Didong Decoction on Oxidative Stress Injuryof Diabetic Nephropathy through miR-133b/DUSP1/JNK Pathway

LIN Zi， HE Wei-dong， DU Si-zhe

（The Peoples Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350004， China）

【Abstract】Objective： To study the effect of Dihong Decoction on oxidative stress injury of diabetic nephropathy cell model. Methods： The serum containing Dihong Decoction was prepared， and mouse mesangial cells were cultured and passed through routine. Groups were divided as follows， control group （5.5mmol/L glucose+normal serum）， high glucose group （30mmol/L glucose+normal serum）， low dose Dihong Decoction group （30mmol/L glucose+5% Dihong Decoction containing serum）， medium dose Dihong Decoction group （30mmol/L glucose+10% Dihong Decoction containing serum）， and high dose Dihong Decoction group （30mm ol/L glucose +20% Dihong Decoction containing serum）. Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the mRNA expression of miR-133b and DUSP1. Western blotting to detect the expression of DUSP1， p-JNK， Drp1 and Fis1 proteins. The expressions of SOD and MDA were detected by Elisa. Results： Compared with that of the high glucose group， the expressions of miR-133b， MDA， P-JNK， Drp1 and Fis1 in Dihong Decoction groups were significantly decreased （P<0.05）， while the expressions of DUSP1 and SOD were significantly increased （P<0.05）. Conclusion： Dihong Decoction can regulate mitochondrial division through miR-133b/DUSP1/JNK pathway to improve oxidative stress injury in diabetic nephropathy.

【Key words】Dihong Decoction; Diabetic Nephropathy; miR-133b; DUSP1; JNK; Oxidative Stress

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是由糖尿病（diabetes mellitus，DM）所致的慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD），已成為 CKD 和終末期腎病的主要病因，增加了 DM 的死亡率［1-2］，因此及時防治對于延緩 DN具有極其重大意義。地紅方（滋陰活血調糖飲）是我院多年來用于防治 DN 驗方，臨床效果顯著。地紅方由六味地黃湯、桃紅四物湯化裁而來，滋陰活血之力強，可作為 DN 滋陰活血的代表方。我們團隊在前期臨床研究中表明地紅方可改善DM患者氧化應激指標及炎癥因子［3］，發現地紅方能夠改善DM血管內皮細胞氧化應激損傷［4］。在前期研究的基礎上，本研究探討地紅方基于miR-133b/雙特異性磷酸酶1（dual specificity phosphatase 1，DUSP1）/c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路調控線粒體分裂改善DN氧化應激損傷的機制。

1? 材料與方法

1.1? 實驗動物? SPF 級雄性SD大鼠14只，體質量（180±20）g，適應性喂養1周后，分籠飼養。自由攝食進水，使用基礎飼料喂養。實驗過程符合國家《實驗動物管理條例》。

1.2? 實驗細胞? 小鼠腎小球系膜細胞（SV40 MES 13）購自武漢普諾賽，37℃水浴中進行快速融化，加入含10 mL DMEM培養基中，900 rpm/min，離心5min，加入5 mL DMEM培養基吹打均勻，置入T25培養瓶中培養。待細胞長滿80%融合時，進行傳代處理，用0.25%胰酶消化2min，收集細胞放入15mL離心管中，1000 rpm/min，離心5min，按1∶3進行傳代，細胞傳2代待用。

1.3? 實驗藥物? 熟地黃24 g，山茱萸12 g，山藥10 g，澤瀉9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g，葛根20 g，天花粉15 g，桃仁6 g，紅花9 g，當歸9 g，白芍9 g，川芎9 g，丹參9 g。配齊藥材，先以5倍量清潔自來水在5 min內清洗兩次。加10倍量的蒸餾水浸泡半小時，以700瓦的火力加熱煎煮1 h，過濾取藥液；第二次加6倍量水，以同等火力加熱煎煮40 min，過濾。合并濾液，再以700瓦火力濃縮至每1mL藥液相當于1 g生藥材的藥液（即1∶1藥液），無菌包裝，備實驗使用。

1.4? 主要藥品與試劑? DUSP1抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號：A30451），磷酸化c-Jun氨基端激酶（p-JNK）抗體、線粒體動力相關蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）抗體、線粒體分裂蛋白1（fission protein 1，Fis1）抗體、GAPDH抗體（美國proteintech公司，批號：80024-1-RR、12957-1-AP、10956-1-AP、60004-1-Ig）。增強型RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、Western專用一抗二抗稀釋液、Western Blotting增強型蛋白印跡再生液（武漢博士德生物工程有限公司，批號：AR0102、AR0198、AR0138、AR1017、AR0196）。

1.5? 主要實驗儀器? 漩渦混合器［VORTEX-6］（福州康和爾生物科技有限公司）；超凈工作臺Opticlean-1300（力康生物醫療公司）；冷凍離心機［JID-17R］（廣州吉迪儀器有限公司）；瓊脂糖水平電泳儀［DYCP-31DN］（北京六一生物科技有限公司）；漩渦混合器［VORTEX-6］（福州康和爾生物科技有限公司）；梯度PCR儀［MV-C155-ov71］（杭州米歐儀器有限公司）；QPCR儀［Archimed X6］（鯤鵬基因（北京）科技有限責任公司）；超微量紫外可見分光光度計［ND-100c］（杭州米歐儀器有限公司）。

1.6? 實驗方法

1.6.1? 地紅方含藥血清的制備? 健康雄性SD大鼠14只，體質量（180±20）g，適應性喂養1周后。按隨機數字表法分為正常血清組和地紅方血清組，每組各7只。正常對照組予以等體積蒸餾水灌胃；地紅方組以16.695 g/（kg·d）（臨床等效劑量）進行灌胃。連續1周，于末次給藥2h后，頸動脈取血，離心取血清，56℃水浴30min滅活補體，除菌過濾后，分裝凍存。將收集到的地紅方含藥血清配制成含藥 血清濃度分別為5%、10%、20%的培養液備用。

1.6.2? 實驗分組? SV40 MES 13常規培養、傳代。按以下分組：對照組（N組，5.5mmol/L葡萄糖+正常血清）、高糖組（H組，30mmol/L葡萄糖+正常血清）、地紅方低劑量組（30mmol/L葡萄糖+5%地紅方含藥血清）、地紅方中劑量組（30mmol/L葡萄糖+10%地紅方含藥血清）、地紅方高劑量組（30mmol/L葡萄糖+20%地紅方含藥血清）。于37℃ 5％CO2培養箱中干預培養72h。

1.6.3? 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測miR-133b、DUSP1 mRNA表達? 收集各組細胞，按Trizol說明書進行，提取總RNA，將RNA反轉錄為cDNA，依據熒光定量試劑盒說明。將PCR薄壁管混勻、離心，放入PCR儀，反應條件：95℃ 預變性 30 s；95℃ 30 s；55℃ 1 min；擴增40個循環；95℃ 30s反應終止。反應結束后于-20℃保存。擴增片段大小：DUSP1（165bp）；引物序列如下（按5′-3′排列）：DUSP1-F（Rat）：TACTGGCCCCTCACTGTTCT；DUSP1-R（Rat）：AGCTCGGAGAGGTTGTGATG； rno-miR-133b-3p- F：TCGCGTTTGGTCCCCTTCAAC； rno-miR-133b-3p-R： AGTGCAGGGTCCGAGGTATT； rno-miR-133b-3p-RT： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAGCTG；GAPDH-F（Rat）：ACGGCAAGTTCAACGGCACAG；GAPDH-R（Rat）：GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC；U6-F（Rat）：CTCGCTTCGGCAGCACATATACT；U6-R（Rat）：ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC。每組10個樣本。

1.6.4? Elisa檢測超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）表達? 收集按以上分組的系膜細胞，根據Elisa試劑盒說明書操作，在酶標儀下讀取吸光度值，測定各組細胞內SOD活性及MDA的含量。每組10個樣本。

1.6.5? Western blotting（WB）檢測DUSP1、p-JNK、Drp1、Fis1蛋白表達? 收集各組細胞。用冷的PBS液洗滌細胞2次，提取總蛋白質。配制適量BCA工作液進行蛋白質定量，轉膜，進行膜的染色。5%脫脂奶粉封閉，4℃孵育過夜。將一抗4℃孵育過夜。加入二抗室溫孵育1h。之后進行膠片顯影。每組10個樣本。

1.7? 統計學方法? 采用 SPSS 24.0進行數據分析統計，計量資料數據服從正態分布者以（x±s）表示，服從非正態分布以中位數（四分位間距）即 M（IQR）表示，多組定量資料數據均符合正態分布采用單因素方差分析，否則采用非參數檢驗。

2? 結果

2.1? 各組miR-133b、DUSP1 mRNA 表達比較? 見表1。與對照組比較，高糖組miR-133b mRNA表達明顯升高（P<0.01），而DUSP1 mRNA表達顯著下降（P<0.01）；與高糖組比較，地紅方低、中、高劑量組miR-133b mRNA表達顯著降低（P<0.01），而DUSP1 mRNA表達顯著升高（P<0.01）。與地紅方低、高劑量組，地紅方中劑量miR-133b mRNA表達明顯下降（P<0.01），而DUSP1 mRNA表達顯著升高（P<0.01）。

2.2? 各組SOD、MDA表達比較，見表2。與對照組比較，高糖組SOD表達顯著降低（P<0.01），而MDA表達顯著升高（P<0.01）；與高糖組比較，地紅方低、中、高劑量組SOD 表達顯著增加（P<0.01），而MDA表達顯著減少（P<0.01）。與地紅方低、高劑量組，地紅方中劑量SOD表達明顯增加（P<0.01），而DUSP1 mRNA表達顯著減少（P<0.01）。

2.3? 各組DUSP1、p-JNK、Drp1、Fis1蛋白表達比較，見表3。與對照組比較，高糖組DUSP1蛋白表達顯著降低（P<0.01），而p-JNK、Drp1、Fis1蛋白表達顯著升高（P<0.01）；與高糖組比較，地紅方低、中、高劑量組DUSP1蛋白表達顯著增加（P<0.01），而p-JNK、Drp1、Fis1蛋白表達顯著減少（P<0.01）。與地紅方低、高劑量組，地紅方中劑量DUSP1蛋白表達明顯增加（P<0.01），而p-JNK、Drp1、Fis1蛋白表達顯著減少（P<0.01）。

3? 討論

DN是DM最嚴重的微血管并發癥之一，是終末期腎病的主要原因［1］，其發病機制目前尚未完全闡明。人們越來越認識到，高血糖引起的氧化應激是DN發生和進展的主要觸發因素［5］。本研究采用高糖培養SV40 MES 13建立DN細胞模型，探討地紅方在DN發生及發展過程中，改善機體氧化應激損傷的機制。本研究發現，高糖組抗氧化酶SOD表達下降（P<0.01），脂質過氧化的產物MDA表達上升（P<0.01），提示高糖引起腎小球系膜細胞氧化應激損傷。經過地紅方低、中、高劑量干預后，高糖誘導的腎小球系膜細胞SOD表達顯著升高（P<0.01），MDA表達明顯下降（P<0.01），提示地紅方可改善DN氧化應激損傷，對DN具有一定的療效。

高血糖介導的線粒體分裂引起活性氧（reactive oxygen species，ROS）過度產生，迫使細胞承受氧化應激損傷［6］。由過量的ROS產生或抗氧化能力降低引起的氧化應激，對DN發生發展起關鍵作用，是近期DN機制研究的熱點。本研究重點圍繞miR-133b/DUSP1/JNK通路調節線粒體分裂在DN氧化應激損傷的作用。

微RNA（miR）是一系列小分子非編碼RNA，參與幾乎所有的生物過程，如分化、增殖、凋亡、細胞周期等，在糖脂代謝中起重要作用［7-8］。一般來說，miRNAs通過與下游mRNAs的3非翻譯區（3UTR）相互作用，在基因表達調控中起作用［9］。miR-133家族包含miR-133a和miR-133b的2個成員［10］，劉敏等［11］研究表明聯合檢測人體尿液中miR-133b、miR-30a和miR-342可作為DN診斷的潛在標志物，并探討其靈敏度、特異性和準確度。X S等［12］發現miR-133可能與DN的發生和發展有關；建立大鼠DN模型，沉默的miR-133通過絲裂原活化蛋白激酶/蛋白激酶（MAPK/ERK）信號通路抑制DN的腎損傷，因而表明miR-133可能是治療DN的有效靶點。Junqin S等［13］研究發現慢性高血糖刺激下調了DUSP1。有缺陷的DUSP1表達激活了JNK途徑，后者通過調節線粒體裂變因子（mitochondrial fission factor，Mff）磷酸化來選擇性地打開線粒體裂變。Mff相關的線粒體裂變引起線粒體氧化應激，最終促進線粒體功能障礙、腎小球凋亡和DN的發展。X-L Z等［9］發現LncRNA CASC2上調通過miR-133b/FOXP1調節軸抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞增殖、細胞外基質積累和氧化應激。越來越多證據表明，過表達miR-133b，發揮抗氧化能力，將成為DN防治的熱點。本研究探討miR-133b/DUSP1/JNK通路調節線粒體分裂在DN氧化應激損傷的機制。本研究結果表明，高糖組miR-133b、p-JNK、Drp1、Fis1表達明顯升高（P<0.01），而DUSP1表達顯著下降（P<0.01）；與高糖組比較，地紅方低、中、高劑量組miR-133b、p-JNK、Drp1、Fis1表達顯著降低（P<0.01），而DUSP1表達顯著升高（P<0.01）。本研究提示miR-133b/DUSP1/JNK通路調節線粒體分裂在DN氧化應激損傷起重要作用。

地紅方由六味地黃湯、桃紅四物湯加天花粉、葛根、丹參組成，具有滋陰活血的功效。眾所周知，六味地黃湯是滋陰的代表方，桃紅四物湯是活血養血的經典方。六味地黃湯為陰虛型消渴的經典方劑，全方六藥合用，三補與三瀉相伍，而以三補為主，肝脾腎三陰并治，尤以補腎陰為重；桃紅四物湯中六藥相伍，補中寓行，使補血而不滯血，行血而不傷血，共成補血調血之功；配伍丹參活血化瘀，天花粉清熱瀉火，葛根生津止渴，在六味地黃湯合桃紅四物湯的基礎上增強滋陰瀉火、活血化瘀之功。

臨床實踐和實驗研究方面均有多個六味地黃湯和桃紅四物湯單獨使用治療DN的報道。陶鵬宇［14］研究表明六味地黃丸治療DN大鼠，能夠控制血糖及延緩腎功能下降，改善氧化應激指標，SOD表達上升，MDA表達下降，起到抗氧化應激的作用。多個臨床研究表明桃紅四物湯能一定程度上減少尿蛋白，保護腎功能。侯君等［15］觀察桃仁紅花煎能夠改善2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠腎小球和腎小囊病變，降低DM大鼠血糖、血脂水平，抑制腎臟Wnt/β-catenin信號通路，發揮對腎臟的保護作用。地紅方可作為DN滋陰活血的代表方。課題組在長期的臨床實踐中觀察地紅方可改善DN患者的臨床癥狀，控制血糖及改善腎功能。

中藥湯劑地紅方可作為DN滋陰活血的代表方。我們課題組在長期的臨床實踐及前期的臨床研究中觀察地紅方可改善DN患者的臨床癥狀，具有控制血糖及改善腎功能的功效。現代研究表明地紅方中多味中藥及其活性成分具有保護線粒體功能及抗氧化應激的作用。本課題可望通過微觀實驗角度驗證標本兼治的滋陰活血法防治DN的有效性，并科學的闡釋滋陰活血法，豐富DN中醫治療的科學內涵。因而，筆者團隊基于miR-133b/DUSP1/JNK通路探討地紅方調控線粒體分裂改善DN氧化應激損傷的機制。本課題組也將在今后的研究中進一步驗證地紅方改善DN動物模型的機制研究。這樣有助于中藥復方地紅方在治療DN的應用和推廣，有助于治療DN的新藥開發。

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（收稿日期：2023-10-23）