復合垂直流人工濕地基質理化性質對nirS和nirK型反硝化菌多樣性的影響

趙偉 朱四喜 夏國棟 高寧 趙斌 王眾

摘要：深入研究復合垂直流人工濕地基質理化性質及其對相關脫氮反硝化微生物的影響，可為解析人工濕地污水處理及提高脫氮效率提供理論依據。2020年12月采集貴州喀斯特地區復合垂直流人工濕地4口池（一級垂直流下行池、一級垂直流上行池、二級垂直流下行池、二級垂直流上行池）的基質樣品，用Illumina 高通量測序技術獲得反硝化功能基因序列，分析其種群組成和多樣性特征，并采用冗余分析揭示反硝化菌群落與基質理化性質之間的相關性。結果表明，復合垂直流人工濕地中4口池的基質理化性質存在顯著差異；pH在4口池中均呈中性，溶解氧（DO）呈先下降后升高趨勢，下行池的基質電導率（EC）均比上行池要高；總氮（TN）、總磷（TP）含量隨著人工濕地梯級呈顯著下降趨勢，未出現厭氧現象；NO3--N和NH4+-N含量在二級垂直流下行池中大量積累并達到峰值。在多樣性分析中，nirS、nirK型反硝化菌豐度隨著人工濕地梯級呈先降低后升高的趨勢，多樣性隨人工濕地級數逐漸降低，且下行池豐度多樣性顯著高于上行池。基質中nirS型反硝化菌共5門9屬，nirS型為6門14屬，變形菌門是nirS、nirK型反硝化菌群的共同優勢菌門，相對豐度為55.36%～65.72%、30.06%～45.66%。nirS、nirK型反硝化菌共有OTUs數分別為392、245，并與反硝化菌群OTUs數目趨勢一致，從多角度表明nirS型反硝化菌群豐度明顯高于nirK型，且共有OTUs占有率高達41.6%和41.7%，表明各級池中反硝化菌群相似度較高。冗余分析表明基質中nirS和nirK反硝化菌群的構建主要受pH、NH4+-N、DO、TP、TN影響，且nirS型對pH、nirK型對NH4+-N的響應更為強烈。

關鍵詞：nirS和nirK型；反硝化菌；Illumina高通量測序；冗余分析；復合垂直流人工濕地

中圖分類號：Q178.1? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? 文章編號：1674-3075（2024）02-0132-09

因人工濕地污水處理系統具有低成本、低功耗、低碳排放的優點，現已得到廣泛應用（Chen et al，2011）。人工濕地中反硝化微生物多樣性是濕地凈化污水的一個關鍵因素，其凈化原理是利用植物、微生物和基質三者的相互作用達到去除污染物的效果（雷旭等，2015）。復合垂直流人工濕地綜合了地表流和潛流濕地系統特征，水流在基質床中呈上下垂直流動，具有脫氮效率高且運行穩定的優點，對場地要求低且不受季節影響還能實現高效凈化效果（賀鋒等，2005）。因而，復合垂直流人工濕地基質理化性質及相關脫氮反硝化微生物的深入研究，對于解析復合垂直流人工濕地污水處理機制以及提高脫氮效率具有重要意義。

近幾年，隨著高通量測序技術的快速發展，反硝化菌群落研究領域取得了較大進展（Han et al，2021；Xue et al，2021），主要體現在反硝化微生物的篩選、反硝化基因的識別、反硝化微生物群落的演替特征及驅動因素分析和人工濕地生物強化技術（康鵬亮等，2018；邵汝英等，2019；文剛等，2020）等方面。研究較多的有nirS和nirK型微生物，其多樣性結構主要受溫度、NO3--N、溶解氧（DO）和pH等影響，基質中nirS豐度顯著高于nirK（張盛博等，2017），而且nirS和nirK群落種屬豐度和結構因基質理化性質的改變而不同（Li et al，2019）。同時，nirS和nirK占據了不同的生態地位，且隨基質理化性質而改變（Yuan et al，2012）。因此，人工濕地反硝化菌群多樣性特征對脫氮效率的影響是研究關鍵。

在增強人工濕地氮處理能力研究中，黃鐵礦（Xu et al，2021）、沸石（Du et al，2020）等特殊基質材料可大大提高脫氮效率，添加外源菌（Wang et al，2021）或耐鹽菌劑（Wang et al，2020）等可以定向改變濕地中的反硝化菌群落結構，增強人工濕地對特殊廢水的反硝化作用，提高凈化效率。然而，人工濕地反硝化菌群落結構豐度及脫氮強化研究主要集中于單一的水平和垂直流人工濕地中，該領域針對復合垂直流人工濕地研究較少，尤其是復合垂直流人工濕地處理污水過程中該菌群落變化及其驅動機制鮮見報道。因而，本文基于Illumina高通量測序技術識別nirS和nirK反硝化菌群，對喀斯特地區復合垂直流人工濕地基質理化性質及其反硝化菌多樣性特征進行研究，通過韋恩圖和冗余分析（RDA）揭示菌群多樣性與環境因子的關系，以期為復合垂直流人工濕地高效脫氮提供理論依據。

1? ?材料與方法

1.1? ?基質樣品采集

本研究中的復合垂直流人工濕地位于貴州喀斯特地區甕安縣建中鎮，其構成如下：農村生活污水流經預處理單元（格柵、厭氧池、生物接觸氧化池）后，按順序依次進入一級垂直流下行池（A池）、一級垂直流上行池（B池）、儲水渠、二級垂直流下行池（C池）、二級垂直流上行池（D池）、生物穩定塘（圖1）。2020年12月對復合垂直流人工濕地中4口池（即一級垂直流下行池、一級垂直流上行池、二級垂直流下行池、二級垂直流上行池）的基質進行樣品采集，每個池子采集3個平行樣，取其平均值。4口池中的基質原本由土壤、細砂、粗砂和礫石組成，但隨著污水的進入、泥沙的沉積和微生物的繁殖使活性污泥大量積累，故所采集的基質成分主要以活性污泥為主。將樣品放入便攜式冰柜冷藏運輸至實驗室，手動去除所有根部殘留物和砂石后，將樣品通過2 mm網篩。每個基質樣品分為2份：1份在-80℃下儲存用于Illumina MiSeq高通量測序；1份等待自然風干，采用《土壤農化分析》（鮑士旦，2008）的方法在室溫下分析基質理化性質，使用基質浸提液測定溶解氧（DO）。

1.2? ?微生物DNA 提取與 Illumina MiSeq 測序

采用 E.Z.N.A.soil DNA kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）提取基質微生物中的DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA進行檢測，并用 Nano Drop 2000（U.S.）測定DNA濃度，保存在-20℃冰箱待用。

采用Illumina MiSeq測序技術分析復合垂直流人工濕地反硝化菌種群組成與多樣性特征，將樣品送至上海美吉生物公司進行高通量測序。

1.3? ?統計分析

高通量測序完成后，使用fastp軟件對反硝化功能基因原始序列進行質控，去除低質量序列。處理得到的優質序列反硝化功能基因通過QIIME進行序列長度擴增，再將擴增后的序列數據通過SRA（Sequence Read Archive）數據庫進行比對。根據分類注釋結果對物種組成分類，去除豐度小于0.001的數值，在97%相似水平下歸類為操作分類單元（OTUs）。然后通過Mothur軟件對聚類分析結果進行解析，得到nirS和nirK型反硝化菌種群多樣性指數，進而進行物種組成和結構分析。采用Excel進行數據處理，并通過SPSS軟件中單因素方差分析（ANOVA）對基質養分進行解析，采用GraphPad Prism9.0軟件進行圖形繪制與分析，利用Canoco5軟件進行冗余分析（RDA）以揭示反硝化菌群落與基質理化性質之間的相關性。

2? ?結果與分析

2.1? ?基質理化性質

復合垂直流人工濕地4口池的基質理化性質存在顯著差異。基質浸提液DO隨著梯級（即一級垂直流下行池、一級垂直流上行池、二級垂直流下行池、二級垂直流上行池）呈先降低后升高的趨勢，變化范圍在26.54～34.08 mg/L，在一級垂直流上行池中DO最低，但均未出現厭氧現象（表1）。基質pH變化范圍在7.63～8.09，基本呈中性。下行池的基質電導率（EC）均比上行池要高，但在梯級之間沒有顯著差異。基質TP含量呈顯著下降趨勢，TN呈先降低后升高的趨勢。NO3--N和NH4+-N呈先升高后降低趨勢，且在二級垂直流下行池中達到峰值，氮素轉化的中間態在此池中大量積累。綜上所述，復合垂直流人工濕地在脫氮處理上效果顯著。

2.2? ?基質nirS和nirK型反硝化菌多樣性指數

從nirS和nirK型反硝化菌的豐富度與多樣性指數計算結果看，反硝化菌文庫覆蓋率均在99%以上， 表明得到的多樣性指數數據有效可靠（表2）。在各級人工濕地中，OTUs數目空間尺度上變化較明顯，總體呈下降趨勢（一級垂直流下行池>二級垂直流下行池>二級垂直流上行池 >一級垂直流上行池），且下行池高于上行池。隨著人工濕地梯級的變化，多樣性指數（Shannon指數和Simpson指數）變化趨勢與OTUs正好相反，而豐富度指數（Chao1指數和faith_pd指數）變化趨勢與OTUs結果基本一致。

2.3? ?基質nirS和nirK型反硝化菌群落組成

nirS和nirK 型反硝化菌群落門水平的組成見圖2，nirS 型群落共獲得5 門，nirK 型群落共獲得6 門。兩類菌群除未分類菌門（unclassified）外，主要為變形菌門（Proteobacteria），且各級濕地中nirS、nirK型反硝化菌種群結構具有相似性。本研究中，在nirS和nirK型中變形菌門占絕對優勢，平均占比分別為57.38%和41.78%，總體呈先上升后下降的趨勢，且二者上行池顯著高于下行池。

nirS和nirK型反硝化菌群落屬水平的組成和差異見圖3，nirS型反硝化菌主要歸為9個屬，除未分類菌屬（unclassified）外，主要包括紅細菌屬（Rhodobacter）和脫氯單胞菌屬（Dechloromonas）。在二級垂直流上行池中紅細菌屬占絕對優勢，一級垂直流下行池與其完全相反，占比最低，各級濕地中豐度變化較為明顯。一級垂直流上行池、二級垂直流下行池濕地中脫氯單胞菌屬占絕對優勢，于一級垂直流下行池、二級垂直流上行池濕地占比最低，呈先升高后降低趨勢。nirK型反硝化菌主要歸為14個屬，除未分類菌屬外，主要包括紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、氏菌屬（Bosea）等。紅假單胞菌屬在一級垂直流上行池濕地中占絕對優勢，于二級垂直流上行池濕地占比最低，且一級垂直流上行池濕地豐度較一級垂直流下行池、二級垂直流下行池濕地有顯著升高；慢生根瘤菌屬在一級垂直流下行池濕地中最占優勢，隨級數增加豐度逐漸降低；氏菌屬隨級數的增加也呈持續下降的趨勢。此外，各級上下行池中反硝化菌種群結構存在顯著差異。在各級濕地基質nirS和nirK型反硝化菌群中分別發現了硫桿菌屬（Thiobacillus）、產黃桿菌屬（Rhodanobacter）、厭氧繩菌屬（Anaerolinea）和Starkeya屬、紅細菌屬、假單胞菌屬（Pseudomonas）、中華根瘤菌屬（Sinorhizobium）、根瘤菌屬（Rhizobium）。然而，nirS、nirK型反硝化菌群未分類菌屬占比較高，可能具有反硝化功能，需進一步研究。

各級濕地中OTUs數目組成關系見圖4，在nirS、nirK型反硝化菌中，特有OTUs數最多的分別為一級垂直流下行池濕地和二級垂直流下行池濕地（55和63個），同時，nirS型中共有OTUs數（392個）明顯高于nirK型（245個），與表2復合垂直流人工濕地nirS和nirK型反硝化菌群OTUs數目趨勢一致。以上結果表明，各級濕地之間反硝化菌種群相似度較高，且nirS型反硝化菌種群豐度顯著高于nirK型。

2.4? ?基質反硝化菌與理化性質的關系

RDA分析表明，前兩主軸對復合垂直流人工濕地nirS和nirK型反硝化菌群落總變異系數的解釋率分別為56.53%、54.93%，第1個RDA維度對結構變化的解釋率分別為34.51%、34.75%，第2個的解釋率分別22.02%、20.18%（圖5）。從圖5可知DO、pH是驅動nirS型反硝化菌群演替的主要環境因子，其次是TP、TN、NO3--N和NH4+-N等。此外，脫氯單胞菌屬與TN、NO3--N、NH4+-N和pH呈正相關，與DO呈顯著負相關；TP是紅細菌屬的主要影響因子；磁螺菌屬與NO3--N和TP呈正相關，與DO和pH呈負相關。濕地基質中TP、TN、NH4+-N、DO、pH是驅動nirK型反硝化菌群演替的主要環境因子，其次是NO3--N、EC等。此外，氏菌屬和慢生根瘤菌屬與DO、TP呈顯著正相關，與pH、NH4+-N呈顯著負相關，且兩屬之間種群結構相似度較高；TN是紅假單胞菌屬主要影響因子，二者反硝化種群結構受pH、DO的顯著影響，其中nirS型關鍵菌屬多為嚴格厭氧型細菌群落，nirK型菌屬群落多為兼性厭氧型，二者對氧的敏感程度不同，且nirK型對有機物N、P的變化更為敏感，其中，nirK型反硝化菌豐度與pH雖存在顯著相關關系，但攜帶nirS的反硝化菌比攜帶nirK的反硝化菌對土壤pH更為敏感。

由圖6可知，nirS型反硝化菌群中磁螺菌屬與NO3--N呈正相關。nirK型反硝化菌群中， NH4+-N、NO3--N是根瘤菌屬的主要影響因子，且EC與根瘤菌屬呈顯著正相關。

3? ?討論

3.1? ?基質理化性質隨濕地梯級的變化

本研究表明，有機物進入濕地后，因前置硝化作用中微生物是好氧生物，消耗濕地中大量氧氣，進入厭氧反硝化過程后，水中溶氧慢慢恢復上升，從而導致DO隨濕地空間變化先下降后升高（王愛平等，2010）。反硝化菌對有機物轉化利用，使得TN、TP含量隨著人工濕地梯級呈顯著下降趨勢，有機氮在反硝化菌作用下轉化為氮素中間產物（趙斌等，2019），引起pH、NO3--N和NH4+-N含量升高，最后還原成N2釋放，并且釋放出H+，導致濕地各池基質pH先升高后降低。因水流作用方向不同，下行池中帶電離子更容易在基質層附著，導致其電導率EC均比上行池要高（賀鋒等，2005）。

3.2? ?基質nirS和nirK菌群的識別

根據高通量測序結果對OTU進行注釋，對基質nirS、nirK型反硝化菌門屬水平下細菌進行分析。從圖2、3中可知，nirS型反硝化菌鑒定為5門9屬，nirK型鑒定為6門14屬，變形菌門是nirS、nirK型反硝化菌群的共同優勢菌門。nirS型主要含紅細菌屬、脫氯單胞菌屬和磁螺菌屬等； nirK型主要含紅假單胞菌屬、慢生根瘤菌屬和氏菌屬等，二者優勢菌屬多屬于變形菌門。紅假單胞菌屬（楊文煥等，2020）、紅細菌屬（楊浩等，2017）是典型的反硝化脫氮細菌，其余菌屬占比雖然不高，對反硝化脫氮也發揮著不可替代的作用（Hou et al，2018），但其驅動機制需進一步分析。

韋恩圖（圖4）可以非常直觀地看出各級濕地中OTUs數目組成的相似性和獨特性情況，本研究表明nirS型反硝化菌共有OTUs數目（392個）顯著高于nirK型的數目（245個），與反硝化菌群OTUs數目（表2）趨勢一致，證明其nirS的豐度顯著高于nirK型反硝化菌，并且張敏等（2015）在對人工濕地反硝化菌群功能基因豐度研究中，從多角度證明其nirS的豐度顯著高于nirK型，從側面表明濕地中反硝化菌群主要以nirS型群落為主。且在nirS、nirK型反硝化菌中，特有OTUs占有比重最高的分別為一級垂直流下行池濕地和二級垂直流下行池濕地，占有率高達41.6%和41.7%，顯著高于其他幾級濕地，這可能是因為復合垂直流人工濕地梯級變化對菌屬的篩選作用，使得一級下行池和二級下行池中特有OTUs占比顯著高于其他幾級濕地。

3.3? ?基質理化性質對反硝化菌的影響

反硝化菌群演替的驅動因子主要包括pH、DO、氮類營養鹽（NH4+-N和NO3--N）等（周石磊，2017）。張成龍等（2019）發現pH是變形菌門變化的首要驅動因子，本研究也證明了此現象，隨pH的增加，nirS、nirK變形菌門的優勢作用增強（表1、圖2），其中RDA也顯示了pH對脫氯單胞菌屬和紅假單胞菌屬、慢生根瘤菌屬、氏菌屬的重要影響（圖5），同樣的現象在明紅霞等（2020）的研究中得到證實，但該文也指出，nirK型反硝化菌還存在于更廣泛的細菌分類中，包括以放線菌門、厚壁菌門等為主的類群。環境中也可能存在著更高豐度的反硝化菌和更豐富的群落多樣性。

DO主要通過3個方面影響反硝化菌的脫氮：（1）和硝酸鹽競爭電子；（2）抑制反硝化過程酶的合成；（3）抑制硝酸鹽的還原（Hu et al，2021）。本研究在RDA分析中證實了DO與紅細菌屬呈現高的相關性（圖5-a）；且RDA分析也顯示人工濕地TN主要來源于NO3--N和NH4+-N，其為反硝化菌屬代謝生長提供了氮類營養鹽，如nirS中脫氯單胞菌屬隨濕地空間變化呈升高趨勢，其與NH4+-N變化趨勢一致（表1），呈現正相關（圖5-a）；nirK中紅假單胞菌屬、慢生根瘤菌屬和氏菌屬，隨濕地空間變化呈降低趨勢，其與NH4+-N、NO3--N變化趨勢（表1）相反，呈負相關（圖5-b）。以上結果與釗珍芳（2019）、陳澤斌等（2021）、梁偉光等（2022）對反硝化菌群結構的研究結果相一致。鮑林林等（2016）研究發現北運河沉積物中NO3--N是反硝化群落演替的主要影響因子；Zhou等（2019）通過對反硝化菌群影響因素的研究，發現DO和NO3--N是脫氮細菌組成的重要影響因素。氧通過為反硝化菌群提供更高效的電子受體而抑制反硝化活性，但隨硝化過程DO的大量消耗，達到反硝化菌群最適繁殖條件，其豐度顯著上升，隨NH4+-N、NO3--N的進入，反硝化菌群落從應激到穩定狀態，快速響應氮素變化，從而達到動態平衡。

綜上，復合垂直流各級人工濕地反硝化菌群有明顯差異，菌群演替特征與pH、DO和氮類營養鹽等因素緊密相關。本研究僅討論了已識別功能菌屬與環境因子的重要關系，尚有諸多未分類菌屬功能有待研究，進一步研究可能為解析復合垂直流人工濕地氮素變化和豐富nirS、nirK型反硝化研究提供重要思路。

4? ?結論

（1）復合垂直流人工濕地基質理化性質中，DO總體在26.54～34.08 mg/L，未出現厭氧現象，pH在7.63～8.09，濕地基質基本呈中性，轉化過程中間態NO3--N和NH4+-N在二級垂直流下行池中大量積累，TN的含量最終呈明顯降低趨勢。nirS型反硝化菌群豐度明顯高于nirK型，且各自在不同級人工濕地中反硝化菌群相似度較高。

（2）通過高通量測序，nirS型鑒定為5門9屬，nirK型鑒定為6門14屬，變形菌門是nirS、nirK型反硝化菌群的共同優勢菌門。nirS型主要含紅細菌屬和脫氯單胞菌屬等，菌群多樣性及豐度呈時空變化，即隨濕地級數升高，豐度呈升高趨勢，且下行池顯著高于上行池；nirK型主要含紅假單胞菌屬、慢生根瘤菌屬和氏菌屬等，與nirS型菌群變化趨勢完全相反，菌群多樣性及豐度的時空變化隨級數升高，豐度呈降低趨勢。二者優勢菌屬都多隸屬于變形菌門。

（3）對于nirS型，DO、pH是反硝化菌群結構和多樣性塑造的主要驅動因子，反硝化菌群多樣性和脫氯單胞菌屬的空間變化主要受DO影響，紅細菌屬空間變化主要受TP影響；對于nirK型，TP、TN、NH4+-N、DO、pH是反硝化菌屬結構和多樣性塑造的主要驅動因子，氏菌屬的空間變化主要受DO、TP影響，紅假單胞菌屬空間變化主要受TN影響，其中nirS型關鍵菌屬多為嚴格厭氧型細菌群落，nirK型菌屬群落多為兼性厭氧型，對有機物N、P的變化更為敏感，且攜帶nirS型的反硝化菌比攜帶nirK型的反硝化菌對土壤pH更為敏感。

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（責任編輯? ?熊美華）

收稿日期：2022-02-01? ? ? 修回日期：2023-08-31

基金項目：2024年貴州省基礎研究（自然科學）計劃項目（黔科合基礎-ZK[2024]一般490）；國家自然科學基金（31560107）。

作者簡介：趙偉，1999年生，男，碩士研究生，研究方向為環境工程。E-mail：1621570682@qq.com

通信作者：朱四喜，男，教授。E-mail：zhusixi2011@163.com