骨髓增生異常性腫瘤相關基因突變及治療展望

伍學強 惠卉

2022 年WHO 更新了髓系腫瘤的分類，引入骨髓增生異常性腫瘤（Myelodysplastic neoplasms，MDS）名稱，來取代骨髓增生異常綜合征（Myelodysplastic syndromes，MDS），強調和明確了此類疾病的腫瘤屬性，即MDS 是以病態造血為主要特征的克隆性造血細胞腫瘤。WHO 通過整合MDS 細胞譜系、顯性臨床特征和顯性生物學特征，將MDS分為具有明確遺傳學異常和具有明確形態學異常的兩類，并強調了分子遺傳學在MDS 疾病定義中的重要性。通過納入細胞遺傳學、分子遺傳學等信息，使MDS 類別特征更加清晰。具有明確遺傳學異常的MDS 包括：MDS 伴低原始細胞和孤立性5q-（MDS-5q）、MDS 伴低原始細胞和SF3B1 突變（MDS-SF3B1）、MDS 伴TP53 雙等位基因失活（MDS-biTP53）[2]。隨著研究的深入，大量的數據表明MDS 的發生、發展與細胞分子遺傳學異常存在著越來越密切的關系[3]。基于此，我們對與MDS 發生、發展過程中相關的基因突變做一梳理，以探討相關突變基因在MDS 的發病過程中可能的作用，同時對這一作用的認識可能為MDS 的治療研究提供理論依據。

1 MDS 發病機制

原發性MDS 主要與基因突變、染色體異常等因素相關，MDS 的發生、發展為單細胞克隆性轉化的過程[4]。研究表明，MDS 常見的基因突變可分為以下主要幾類：轉錄調節因子（RUNX1、CEBPA、GATA2）、剪接子基因（SF3B1、SRSF2、U2AF1、EZH2）、表觀遺傳修飾因子（TET2、DNMT3A、ASXL1）和細胞信號基因（NRAS、KRAS、FLT3）。轉錄是基因表達的第一階段，轉錄因子與特定DNA 序列結合，調控基因的表達。轉錄調節因子（如RUNX1）廣泛表達于造血干細胞表面，突變可導致轉錄因子不能與DNA 結合或轉錄激活能力下降，進而導致MDS 病態細胞產生 和MDS 的發 生[5]。RNA 剪 接（RNA splicing）是轉錄后修飾的第一步，該過程將DNA 模板鏈轉錄出的pre-mRNA 中的內含子剪切除去，并將外顯子有序連接，最終加工成成熟的mRNA。如SF3B1、SRSF2、U2AF1、EZH2 等剪接子基因發生突變，錯誤識別內含子的分支剪接位點，導致關鍵造血調節因子的反復錯誤剪接。

此外，表觀遺傳學在MDS 的發生中也發揮重要作用。表觀遺傳學指不涉及DNA 序列改變的基因表達調控方式，主要從DNA/RNA 甲基化、組蛋白修飾、非編碼 RNA 調控和染色質三維結構重構四個層面調控基因表達。許多在MDS 中發現的高頻突變基因都與表觀遺傳狀態的調節有關，如TET家族、DNA 甲基轉移酶DNMT3A、組蛋白功能修飾基因ASXL1 均參與DNA 甲基化過程。研究者將MDS、AML-M2a 和正常人骨髓標本分離單個核細胞（MNC）并提取DNA，MDS、AML-M2a 組DNA 的平均吸光度值與對照組相比明顯不同，提示存在核酸堿基的過度甲基化[6]。啟動子區基因可因過度甲基化而失活，影響細胞的正常分化、衰老和凋亡，促使腫瘤細胞的克隆性擴增。DNA 去甲基化藥物地西他濱等通過抑制DNA 甲基轉移酶，重新激活過度甲基化的基因，抑制腫瘤細胞的克隆性擴增從而達到治療MDS 及AML 的目的[7]。

由于出現上述多重突變，導致患者造血干細胞基因組單個或多個突變，使造血干細胞增殖能力提高，形成異常克隆細胞，逐漸取代正常克隆細胞。異常克隆細胞在骨髓中分化、成熟障礙，出現病態造血，導致了MDS 的形成。

2 MDS 基因突變

2.1 表觀遺傳修飾因子

2.1.1 TET2 TET2 突變在血液系統惡性腫瘤中發生的頻率較高，約20%～30%的MDS 伴有TET2 突變[8]。TET2 突變調控與甲基化過程密切相關。DNA 甲基化是一個可逆的過程[9，10]，其最主要的作用為調控基因的表達，可以介導染色體失活[9]。通過將5-mC氧化生成5-hmC，干/祖細胞中TET 家族可以調控DNA 中的5-hmC 生成。5-hmC 是去甲基化過程的第一步。已有研究證實TET2 突變的MDS 患者克隆性造血干細胞DNA 中5-hmC 含量顯著降低[11]，其他一些研究也表明，低5-hmC 水平與MDS 患者較短生存期有關[12]。已知TET2 突變與DNA 異常甲基化、MDS 進展為AML 的風險增加有關[13]。同時研究者發現TET2 突變往往伴隨著其他基因突變，可能影響MDS 患者的預后[14，15]。Feng 等[16]的研究表明TET2 突變伴其他突變的患者比孤立的TET2 突變患者的預后更差。

有研究表明，TET2 突變的 MDS 患者及進展為AML 的患者對阿扎胞苷治療的反應更好[17]。Yun等[18]的進一步研究表明，TET2 突變和高miR-22表達可以作為預測去甲基化藥物（Hypomethylating agent，HMA）治療MDS 患者療效的生物標志物。

2.1.2 ASXL1 表觀遺傳調節基因ASXL1 是組蛋白功能修飾基因，主要發生移碼突變。ASXL1 在MDS患者中的突變率約為20%[19]。實驗室研究證明，在小鼠中敲除ASXL1 基因，可使小鼠出現血細胞異常增生、三系血細胞減少或發育異常[20]，在人造血干細胞中敲除ASXL1 基因會破壞細胞的分化功能[21，22]。一項Meta 分析表明，MDS 發生ASXL1 突變轉化為AML 的可能性較大，ASXL1 突變是MDS和AML 患者預后的獨立不良影響因素[23]。同時與TET2 突變相似，研究證明該突變可作為HMA 治療反應的標記物[24]。

2.1.3 DNMT3A 研究者已在多種腫瘤中發現DNMT3A 的異常表達，其中包括MDS。DNMT3A突變在MDS 患者中的發生率約為10%，并且DNMT3A 突變與MDS 中較短的OS 相關。1%～2%的人類基因組是CpG 島（CpG island），其主要位于基因的啟動子（promotor）和外顯子區域，是富含CpG 二核苷酸的一些區域，CpG 島甲基化程度與轉錄活性成反比。DNMT 是一種DNA 甲基轉移酶，對于建立和維持CpG 島甲基化至關重要。在人體細胞中具有甲基轉移酶活性的主要是DNMT1、DNMT3A 和DNMT3B，其中DNMT3A 在DNA 合成早期發揮甲基化作用。研究證實DNMT3A 突變是MDS 與AML 的獨立不良預后因素。突變可以降低OS，且會加快MDS 向AML 轉化[25]。

另外與DNMT3A 突變共存的突變也可能對MDS 患者預后產生影響，之前已有報道IDH1/2 突變和DNMT3A 突變通常共存[26～28]，一項小鼠模型的研究表明，這兩種突變可使H3K9 超甲基化，對MDS 向白血病轉化具有協同作用，并表明DNMT3A 和IDH2缺失的患者可能對組蛋白脫乙酰酶抑制劑的靶向治療反應更佳[29]。Cedena 等[30]研究證實，在MDS 患者中甲基化相關基因（TET2、DNMT3A、IDH1、IDH2）突變的發生與HMA 的更好療效密切相關。

2.2 剪接子基因突變RNA 剪接是真核生物的一個基本過程，它是由5 個核微小核糖核蛋白顆粒（Small nuclear ribonucleoprotein particles，snRNP）和其他結合蛋白相互作用形成的剪接機制完成的[31]，促進mRNA 高效剪接，在維持細胞穩態中發揮關鍵作用[32]。Biancon 等[33，34]發現剪接子基因（SF3B1、SF3B2 和U2AF1）突變的細胞無義介導的mRNA降解（Nonsense-mediated mRNA decay，NMD）減弱，MDS 的DNA 復制障礙、DNA 損傷和染色體不穩定性增加可能與此有關。

2.2.1 SF3B1 SF3B1 基因編碼的轉錄產物是剪接子snRNP 的重要組成成分，參與識別內含子的分支剪接位點，在 RNA 剪接過程中發揮重要作用。已知SF3B1 引起的RNA 異常剪接與MDS、慢性淋巴細胞白血病（Chronic lymphocytic leukemia，CLL）等多種惡性血液病密切相關，在MDS 患者中的發生率約為25%[35，36]。研究證實DNMT3A 突變與SF3B1突變密切相關，但是SF3B1 突變是MDS 患者的一個良好的預后因素，在低風險MDS 中出現概率更高[37]。在骨髓原始細胞小于5%的MDS 中，SF3B1突變與較高的白細胞計數和血小板計數密切相關。數據表明，伴有SF3B1 突變的MDS 患者對促紅細胞生成素（Erythropoiesis-stimulating agents，ESAs）的反應更好[38]。

2.2.2 SRSF2 SRSF2 突變在MDS 的發病機制中的作用尚未完全明確，目前研究者發現 SRSF2 突變改變了正常序列相關性RNA 的結合活性，從而改變對特定外顯子剪接增強子（ESE）基序上位點的識別，驅動關鍵造血調節因子的反復錯誤剪接[39，40]。一項使用SRSF2 小鼠模型的研究證實，SRSF2 突變可損害細胞分化和促進細胞凋亡，導致外周血細胞減少和細胞形態發育不良[41]。另一項研究在體內水平利用生物信息學技術檢測出突變型SRSF2 與蛋白編碼基因的3'-UTR 區域有更高親和力，該區域與mRNA 的穩定成熟及NMD 的轉錄調控和防御機制有關，這可能是SRSF2 突變使NMD 減弱的原因。同時異常剪接會產生錯誤成熟mRNA 產物，該產物被輸送到胞漿通過NMD 被降解，或者轉錄翻譯成錯誤的功能蛋白，可以從另一角度解釋該類突變帶來的致病可能性[42]，證實SRSF2 在維持基因組穩定性和調節細胞增殖方面起著關鍵作用。既往研究報道，SRSF2、TET2 及TP53 突變是預后較差的影響因素，特別是SRSF2 突變，可加速MDS 向AML的轉化[43]。生物信息學分析顯示[44]，SRSF2 突變可影響與其結合的基因組數，證實其不僅僅直接通過影響自身下游靶點致病，而且可能影響整體RNA剪切復合物的穩態，從而導致廣泛的mRNA 異常剪切發生，導致基因組不穩定，這可能是MDS 易于向AML 轉化的原因。

2.2.3 U2AF1 U2AF1 剪接子基因的獲得性突變在造血系統惡性腫瘤中較常見，約11%的MDS 病例中存在U2AF1 突變[44]。U2AF1 基因所編碼的U2AF1 蛋白在剪接過程中可識別并結合5'剪接位點。U2AF1 基因異常會導致U2AF1 蛋白的結構和功能發生改變，進而影響5'剪接位點的識別、mRNA 的剪接，介導與腫瘤發生及發展相關的DNA損傷反應、表觀遺傳調控失常和細胞凋亡等過程。U2AF1 突變主要通過上調IRAK4-L、FOXO3a 的表達介導免疫途徑激活和炎性反應發生；通過誘導R環的積累、降低NMD 的活性調控轉錄與翻譯途徑，通過使H2AFY1.1 亞型減少，進而促使患者造血功能失調、B 淋巴細胞減少[45]。

U2AF1 突變已被證實與MDS 的不良預后顯著相關，其在MDS/AML 中發生頻率較高，且往往在腫瘤發生早期出現，在體內正常細胞包括正常造血細胞中通常不存在，因此U2AF1 成為目前基因治療靶點的研究熱點。研究者通過使T 細胞表達轉基因受體，引導它們來識別特定的目標抗原。突變的U2AF1 蛋白質產物被加工成短肽，形成肽-HLA復合物，呈現于細胞表面。這些肽-HLA 復合物可以作為抗原被經過轉基因的T 細胞靶向識別。Biernacki 等[46]發現U2AF1Q157R/A*33 作為MDS/sAML的一種新抗原，是TCR-T 細胞治療的一個很有前途的精準治療靶點。

2.3 RUNX1RUNX1 是轉錄核心結合因子基因，編碼異二聚體轉錄因子的α 亞基，約14%的MDS患者可發生 RUNX1 突變。RUNX1 突變分為體細胞突變及胚系突變，胚系突變與家族性血小板疾病和AML 的發生發展密切相關。Simon 等人的試驗中，AML 隊列中高達30%的RUNX1 突變是胚系突變[47]。RUNX1 突變導致RUNX1 轉錄因子不能與DNA 結合或RUNX1 轉錄激活能力下降，引起血細胞生成減少及發育不良。其一，RUNX1 突變可破壞MDM2/p53 軸，導致HIF-1α 蛋白積累，引起血細胞生成減少及發育不良。其二，RUNX1 可能通過增加p53 乙酰化從而增加p53 的轉錄活性，而RUNX1 突變則會減弱p53 介導的細胞凋亡及DNA修復。其三，RUNX1 突變可能通過使細胞因子激活mTOR 通路的反應減弱，導致翻譯缺陷無法糾正[5]。

目前已經證實RUNX1 與MDS 較差的預后相關。RUNX1 的主要共存突變基因有U2AF1、TET2、ASXL1、EZH2、SRSF2。Zhen 等[48]研究證實RUNXI 和U2AF1 突變在新的小鼠模型中共同促進白血病的發展。然而RUNXI 突變對MDS 患者HMA 療效的影響尚有爭議。目前研究者傾向于RUNXI 突變的患者HMA 治療效果較差。Wu 等[49]發現RUNX1、ASXL1 聯合突變的MDS 患者對HMA的反應率較低，且已有研究發現RUNX1 突變在高危MDS 中與HMA 獲得性耐藥相關[50]。目前針對RUNX1 的靶向治療研究仍處于體外試驗中，對于突變型RUNX1 AML 移植小鼠，使用BET 蛋白抑制劑（BETi）或降解劑（BET-PROTAC）抑制RUNX1 及其靶點，可誘導其AML 細胞凋亡并提高其存活率[51]。

2.4 TP53 基因突變TP53 位于人類染色體17p13，作為一種抑癌基因目前其突變或缺失是MDS/AML的不良預后指標非常明確。但是聯合異常可能會對預后產生影響，Chan 等[52]的研究證實TP53 突變del（5q）MDS 患者的生存期與 TP53 野生型患者相當，這可能與del（5q）的MDS 患者預后良好有關。

歐洲淋巴瘤網絡（European Lymphoma Network，ELN）指南納入了TP53 定量，同時引入了TP53 等位基因狀態（Monoallelic or biallelic mutation）這一概念。2022 年第五版WHO 血液淋巴腫瘤分類將MDS 伴雙等位基因（bi-allelic）TP53 作為一種新的亞型進行了更新，2022 年發表在Blood上的一篇文章將其定義為符合以下三個條件之一的TP53 突變：①TP53 基因上發生2 個或以上突變；②TP53 基因上發生1 個突變伴17p 異常；③無17p 異常，但TP53基因上發生一個變異等位基因頻率（variant allele frequency，VAF）＞55%的突變[53]。bi-TP53 患者通常具有復雜核型、且預后差[54]。有研究證實，bi-TP53患者較單等位基因突變（monoallelic mutations，ma-TP53）和野生型（wild type，wt-TP53）TP53 患者的OS顯著降低（P=0.033）[55]。NCCN 指南建議bi-TP53 患者參與臨床實驗[56]。在Ascertain 試驗（ASTX727-02）中，bi-TP53 突變MDS 受試者接受口服地西他濱-西達尿苷（Cedazuridine）治療可延長生存期[57]。

3 MDS 的治療策略與展望

雖然異基因造血干細胞移植仍是目前治愈MDS 的唯一方式，但是對于無法耐受及條件受限的中高危MDS 患者來說，HMA 及其聯合治療仍是最為有效的治療方法。然而僅有30%～40%的患者對HMA 治療產生反應[58]。HMA 治療失敗的患者后續治療選擇較少，病情進展迅速。對此，研究人員基于基因突變及其靶點尋求體外及藥物試驗中的可能有效的藥物，以期為該類患者尋求更多的治療選擇。

3.1 維奈托克（Venetoclax）維奈托克是美國FDA批準的首個BCL-2 抑制劑，主要用于治療復發/難治性CLL、AML 和MDS。BCL-2 是一種能抑制細胞凋亡的蛋白，MDS 患者體內的BCL-2 蛋白會阻止腫瘤細胞的凋亡，而BCL-2 抑制劑能使BCL-2蛋白失去活性，從而促使腫瘤細胞死亡。相較于其他BCL-2 抑制劑（如Navitoclax），維奈托克對BCL-2 具有更強的選擇性[59]。

維奈托克已在多種血液惡性腫瘤中顯示出一定的治療效果[60]。維奈托克治療可能會降低MDS或AML 細胞的凋亡閾值[61，62]，從而改善對HMA 的反應，在對HMA 治療耐藥的細胞中也可以改善治療反應。最近發表的數據顯示，維奈托克和阿扎胞苷聯合治療可能通過破壞代謝機制[63]來根除腫瘤干細胞。體外實驗表明HMA 可以促進維奈托克誘導細胞凋亡[64]，從作用機制上看維奈托克和HMA 可以共同誘導線粒體凋亡通路，擾亂三羧酸循環（檸檬酸循環），破壞能量代謝，從而發揮協同作用[65]。臨床試驗證實維奈托克與HMA聯合可提高包括HMA 治療失敗在內的MDS 患者的治療反應率[66]。然而最近的美國血液學會（American Society for Hematology，ASH）、歐洲血液學年會（European Hematology Association，EHA）及Abbvie M15-531 試驗的臨床數據顯示聯合治療會增加對造血功能的毒性，增加中性粒細胞減少導致的發熱，由此提示聯合應用需注意控制劑量及監測血常規[67，68]。

3.2 SX-682SX-682 是一種口服的CXCR1/2 抑制劑。在體外CXCR2 抑制劑可減少AML 細胞系和原發性MDS/AML 患者樣本細胞的增殖，在動物模型體內可以破壞AML 細胞生長[69]。在MDS 和AML中，CXCR1/2 信號通路參與免疫抑制性髓系抑制細胞（Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）的募集和促進白血病干細胞（Leukemia stem cells，LSCs）的自分泌增加。Schinke 等[70]的研究證實，抑制CXCR2會導致原發性AML/MDS 患者細胞的活力和克隆能力下降，同時會降低AML/MDS 患者CD34+/CD38-致病性造血干細胞（Hematopoietic stem cells，HSCs）的生存能力，但對健康對照HSCs 沒有影響。

中性粒細胞屬非特異性免疫細胞，其表面可表達CXCR1 和 CXCR2。IL-8 是CXCR1/2 共同配體，通過結合CXCR1/2 激活下游信號通路，參與腫瘤細胞增殖。CXCR2 還參與中性粒細胞從骨髓中溢出的過程[71]，因此中性粒細胞計數（absolute neutrophil count，ANC）可作為SX-682 抑制CXCR1/2 的 藥效學標志物。一項I 期試驗（HL142389、NCT042-45397）[72]在17 例輸血依賴型且既往HMA 治療失敗的MDS 患者中應用SX-682 單藥治療，骨髓MDSCs 和LSCs 減少，且耐受性良好，未觀察到患者因不良事件停止治療。

3.3 PevonedistatPevonedistat（也稱為MLN4924）是2009 年研發的一種靶向NEDD8 激活酶（NEDD8 activating enzyme，NAE）的抑制劑，在臨床前研究中Pevonedistat 對NAE 的抑制會阻斷特定蛋白的修飾，從而擾亂細胞周期進程和細胞存活，導致腫瘤細胞死亡，顯示出非常有效的抗腫瘤活性。孫毅等[73]發現Pevonedistat 可以在多種腫瘤細胞中誘導免疫檢查點蛋白PD-L1 的表達，其機制主要是通過MEK/JNK 信號激活轉錄因子AP-1，進而促進PD-L1 在轉錄水平表達上調，形成腫瘤相關的免疫抑制環境。通過抗PD-L1 單抗或MEK 抑制劑可以有效阻斷Pevonedistat 的免疫抑制作用，發揮協同抗腫瘤效果。

據一項Ⅱ期試驗報道，推薦劑量Pevonedistat聯合阿扎胞苷的毒性表現為ALT/AST 短暫升高[74]。于2020 年Pevonedistat 獲得FDA 突破性療法認定，FDA 批準其用于治療高危骨髓增生異常綜合征（HR-MDS）患者[75]。臨床前研究顯示，Pevonedistat與阿扎胞苷、Venetoclax 具有協同作用。一項Ⅱ期隨機試驗（NCT02610777）證實阿扎胞苷、Venetoclax和Pevonedistat 的三聯用藥在新診斷的繼發性AML老年患者和HMA 失敗后的MDS 或慢性粒單核細胞白血病（Chronic myelomonocytic leukemia，CMML）患者中有效，CR 率有顯著改善[76]。在Ⅲ期試驗（NCT03268954）[77]中對于那些持續治療超過3 個周期的HR-MDS 患者，聯合治療改善OS 的趨勢較為突出。但是目前仍缺乏針對HR-MDS 患者的同質性人群的臨床試驗。對于HMA 治療失敗后的MDS 而言，治療選擇較少，Pevonedistat 的出現及臨床應用為患者提供了新的治療選擇。

3.4 RigosertibRigosertib（ON-01910）是一種小分子細胞周期抑制劑，可誘導腫瘤細胞周期阻滯從而阻止腫瘤細胞生長。MDS 中通常有RAS 途徑的激活，可觸發下游致癌信號[78，79]。Rigosertib 可與所有RAS 效應蛋白[80]中包含的關鍵調控域結合，阻止效應分子與RAS 的相互作用，從而阻斷RAS 信號的傳遞，阻止RAS 激活。

在目前的臨床試驗中，研究者們認為 Rigosertib是HMA 治療失敗的晚期MDS 一種有效治療方法。一項針對進展為AML 的患者的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗證實，Rigosertib 可改善患者造血功能，提高生存率，且相對安全、耐受性良好，3 級或4 級副作用較少，很少發生血液毒性[81]。最近完成的隨機Ⅲ期臨床試驗（ONTIME 試驗）[82]比較了靜脈注射Rigosertib 與最佳支持治療用于HMA 治療失敗后MDS 患者的療效，證實7 號單體和8 號三體患者的生存率顯著提高，特別是HMA 治療后9 個月內出現進展的患者以及IPSS-R 高危人群可從Rigosertib 治療中獲益。目前對于HR-MDS 患者來說，Rigosertib 僅對一小部分符合特定條件的患者有效，且最終結果不符合設定的試驗終點（需具有明顯生存優勢）。但是由于其作用機制與已批準的去甲基化及免疫調節藥物完全不同，隨著臨床試驗的進展，Rigosertib有望成為特定MDS 亞群新的治療選擇。

4 結語

對于無法耐受異基因造血干細胞移植，或條件受限的中高危MDS 患者來說，HMA 治療無疑仍是目前最為有效的治療方法。但是僅有部分MDS 患者對HMA 治療有反應[58]，已有大量研究證實MDS對HMA 的治療反應與部分基因突變相關[21～24]。在高頻基因突變中，除SF3B1 突變是一個良好的預后因素外，ASXL1、U2AF1、SRSF2、EZH2 和RUNX1等突變的HR-MDS 轉化為AML 的可能性較高，目前，HMA 失敗后的MDS 治療是我們研究的熱點。隨著對MDS 發病機制的進一步了解，預計針對新的靶點的臨床藥物試驗及研究數據將不斷出現，并轉化為更精準、更個性化的MDS 患者的治療選擇。