茶樹(shù)葉提取物復(fù)配殼聚糖對(duì)蘋果采后病害抗性影響

姚悅 余庭庭 張瑞 包會(huì)英 周會(huì)玲

摘 要 為探究茶樹(shù)葉提取物與殼聚糖復(fù)配處理對(duì)蘋果采后主要病害的影響，首先通過(guò)離體試驗(yàn)篩選具有最佳抑菌效果的復(fù)配組合，以‘短枝富士蘋果為材料，采用復(fù)配組合浸泡果實(shí)10 s，24 h后接種擴(kuò)展青霉（Penicilliosis.expansum）或灰葡萄孢（Botrytis.cinerea）的方法，研究了抗病相關(guān)生理指標(biāo)。結(jié)果表明：20%茶樹(shù)葉提取物與1.5%殼聚糖等比復(fù)配抑菌效果最佳;與對(duì)照組和殼聚糖處理組相比，茶樹(shù)葉復(fù)配殼聚糖處理組蘋果青霉病和灰霉病病斑顯著降低（P＜0.05）；幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活力提高，苯丙氨酸解氨酶和肉桂酸-4-羥化酶活性升高，總酚、類黃酮和木質(zhì)素累積（P＜0.05）。可見(jiàn)，茶樹(shù)葉復(fù)配殼聚糖可通過(guò)誘導(dǎo)蘋果病程相關(guān)蛋白和苯丙烷代謝途徑中關(guān)鍵酶響應(yīng)，促進(jìn)抗性次生代謝物質(zhì)積累，抑制病斑直徑，減緩病害發(fā)生。

關(guān)鍵詞 蘋果；茶樹(shù)葉；殼聚糖；青霉病；灰霉病

蘋果（Malus domestica）屬于薔薇科（Rosoideae）蘋果亞科（Maloideae）蘋果屬（Malus）植物，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含礦物質(zhì)和維生素［1］。在采后貯藏過(guò)程中，蘋果會(huì)發(fā)生一系列生理變化，硬度下降，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解等；長(zhǎng)期貯藏的蘋果不僅品質(zhì)快速下降，而且由于微生物作用將導(dǎo)致腐爛損失加重，嚴(yán)重影響商品價(jià)值，大幅降低經(jīng)濟(jì)效益［2］。病原菌侵染是引起蘋果采后貯運(yùn)中腐爛損失的主要原因，部分病原菌如擴(kuò)展青霉、灰葡萄孢等，具有較高生存能力，在低溫貯藏期間仍會(huì)感染果實(shí)，加大了蘋果采后貯藏期間的防治難度［3］。目前，防治侵染性病害多依賴化學(xué)殺菌劑，雖然其防治操作便捷，短時(shí)間內(nèi)效果明顯，但廣泛使用化學(xué)試劑已經(jīng)造成了愈加嚴(yán)峻的食品安全與環(huán)境污染等問(wèn)題；并且由于病原菌的遺傳靈活性和高進(jìn)化潛力，化學(xué)殺菌劑作用往往受到抗藥性病原菌株削弱，需要通過(guò)加大藥劑使用量和施用次數(shù)才能達(dá)到預(yù)期防治效果［4］。再者，多數(shù)情況下生物拮抗菌防治不具有廣譜的抑菌效果，對(duì)于感病情況較為復(fù)雜的采后病害綜合防治效果較弱［5］。然而，與化學(xué)藥劑和生物防治相比，植物源抑菌的優(yōu)勢(shì)在于來(lái)源豐富、食用安全、環(huán)境友好，且多重組分使其具有廣譜、多靶點(diǎn)的抑菌效應(yīng)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已有多篇植物源成分對(duì)果蔬保鮮的相關(guān)報(bào)道，表明其具有降低果蔬采前和采后病害的發(fā)生率的功效。Augustin等［6］研究發(fā)現(xiàn)大蒜、生姜和螺旋藻的提取物涂抹對(duì)芒果減緩失重率和硬度降低，延長(zhǎng)其貨架期，推遲葉綠素分解和果實(shí)成熟有明顯效果。Givi等［7］研究表明，75%和100%的石榴皮提取物通過(guò)增加果皮總酚和類黃酮含量，提高苯丙氨酸解氨酶活性，降低溫州蜜柑的侵染率和病斑直徑。天然物質(zhì)茶樹(shù)葉含有許多功效成分如茶蛋白、茶多酚、茶多糖、咖啡堿、茶葉皂甙、B氨基丁酸、茶氨酸、茶色素等［8］，尤其是茶多酚具有高效的抑菌作用，清除自由基，發(fā)揮抗氧化作用等功效［9］。茶多酚中的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯能夠促肽聚糖降解，阻礙病原菌細(xì)胞壁形成；還有研究認(rèn)為茶多酚可與活性氧化物反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)氧化氫，從而發(fā)揮抑菌效果［10-11］。雖然茶多酚抑菌作用研究很多，但目前關(guān)于利用老、舊茶樹(shù)葉提取物抗病作用的研究較少。為了探究茶樹(shù)葉提取物對(duì)蘋果采后抗病性，本試驗(yàn)利用成膜性和抑菌作用良好的殼聚糖［12］與茶樹(shù)葉提取物復(fù)配，分析可降解真菌細(xì)胞壁主要成分的病程相關(guān)蛋白與苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵酶活性趨勢(shì)，以及直接抑菌物質(zhì)含量變化，討論復(fù)配組合防治采后病害效用，以期為茶樹(shù)葉提取物在果實(shí)保鮮方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)，為蘋果采后病害防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

茶樹(shù)葉于5月底采自西北農(nóng)林科技大學(xué)茶葉綜合實(shí)驗(yàn)站‘陜茶一號(hào)，要求無(wú)明顯病蟲(chóng)害。短枝富士蘋果（Malus domestica ‘Fuji）采自西北農(nóng)林科技大學(xué)千陽(yáng)蘋果試驗(yàn)站，要求大小均勻，成熟度、著色基本一致，且無(wú)病蟲(chóng)害和機(jī)械損傷。

擴(kuò)張青霉（Penicilliosis.expansum）和灰葡萄孢（Botrytis.cinerea）分離于感染青霉病和灰霉病的蘋果果實(shí)純化所得。兩菌株分別接種于PDA培養(yǎng)基，25 ℃恒溫避光培養(yǎng)7 d，以體積分?jǐn)?shù)為0.05% Tween-80的無(wú)菌水稀釋為105 mL-1的病原菌孢子懸浮液以備用。

茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%），上海源葉生物公司；幾丁質(zhì)、苯丙氨酸、抗壞血酸、苯甲基磺酰氟化物（phenylmethyl sulfurylfluoride，PMSF）、昆布多糖、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT），美國(guó)Sigma公司；殼聚糖（98%脫乙酰度殼聚糖）、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、乙二胺四乙酸二鈉、β-巰基乙醇、3，5-二硝基水楊酸、Tris-HCl、甲醇、丙三醇、TritoX-100、鹽酸、磷酸、無(wú)水醋酸鈉、冰醋酸、鹽酸羥胺、亮抑酶肽，陜西中楊生物公司。

1.2 儀器設(shè)備

超高效液相色譜儀（HPLC），美國(guó)安捷倫科技有限公司；BX51正置熒光顯微鏡+X71倒置熒光顯微鏡，日本奧林巴斯株式會(huì)社；I3X型多標(biāo)記微孔板檢測(cè)系統(tǒng)，美國(guó)Molecular Devices；A11型液氮研磨儀，德國(guó)IKA公司；JXN-26高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶樹(shù)葉提取物制備 試驗(yàn)樣品茶樹(shù)葉參考楊莉莉［13］水提法。取10 g茶樹(shù)葉浸于200 mL乙醇水溶液（體積分?jǐn)?shù)50%）中，溫水浴55 ℃浸提2 h，再借助旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾使乙醇充分揮發(fā)，再以純水定容至100 mL。

1.3.2 茶樹(shù)葉提取物成分及濃度分析 采用HPLC法測(cè)定茶樹(shù)葉提取物成分與濃度。色譜條件為：色譜柱C18，流動(dòng)相由10%甲酸（A）和乙腈（B）組成，梯度洗脫，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10? μL，柱溫30 ℃，參考波長(zhǎng)280 nm［14］。

稱取茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品20 mg于50 mL的小燒杯中，少量10%甲酸溶解，定容于25 mL容量瓶，作為茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。逐級(jí)稀釋一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.45 μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)行HPLC分析。分別移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，10%甲酸定容，重復(fù)3次。以積分峰面積為橫坐標(biāo)，茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別含有料液比20%、15%、10%、5%的茶樹(shù)葉提取物或體積分?jǐn)?shù)2%、1.5%、1%、0.5%的殼聚糖的PDA培養(yǎng)基上，接種20 μL 105 mL-1擴(kuò)展青霉或灰葡萄孢孢子懸浮液，于培養(yǎng)箱（25 ℃、避光）培養(yǎng)7 d，記錄菌落直徑。每組合3次重復(fù)，根據(jù)抑菌率判斷兩種物質(zhì)的作用效果。

抑菌率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%

1.3.4 復(fù)配組合篩選 采用離體試驗(yàn)篩選茶樹(shù)葉提取物與殼聚糖優(yōu)勢(shì)復(fù)配組合，試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。于培養(yǎng)皿中加入5 mL復(fù)配劑（提取? 物∶殼聚糖=1∶1），后倒入20 mL PDA培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中注入20 μL? 105mL-1擴(kuò)展青霉或灰葡萄孢孢子懸浮液，于培養(yǎng)箱（25? ℃、避光）培養(yǎng)? 7 d，記錄菌落直徑，每組合3次重復(fù)，根據(jù)抑菌率篩選優(yōu)勢(shì)復(fù)配組合。再以優(yōu)勢(shì)復(fù)配劑組合浸泡果實(shí)10 s，取出后自然風(fēng)干，對(duì)照組采用清水相同處理，室溫放置60 d，統(tǒng)計(jì)腐爛率。每組合3次重復(fù)，每次重復(fù)30個(gè)果，根據(jù)腐爛率篩選最優(yōu)復(fù)配組合。

腐爛率=腐爛果數(shù)/總果數(shù)×100%

1.3.5 復(fù)配劑抗病性試驗(yàn) 蘋果果實(shí)先經(jīng)75%酒精表面消毒后分為復(fù)配組、殼聚糖組和對(duì)照組，復(fù)配組為離體試驗(yàn)篩選的最佳組合，殼聚糖組為1.5%殼聚糖溶液，對(duì)照組為清水。每個(gè)處理組含60個(gè)果實(shí)，分別浸泡10 s取出自然晾干，24 h后，在果實(shí)赤道部位陰陽(yáng)兩面分別接種5? μL菌懸液，用塑料薄膜覆蓋置于溫度25 ℃、相對(duì)濕度90%室內(nèi)。每組處理固定30個(gè)果，用于每日測(cè)量病斑直徑情況，另30個(gè)果實(shí)每天取病斑周圍1～2 cm內(nèi)健康果肉組織，用液氮迅速冷凍后磨成粉末狀，于-80 ℃保存，后續(xù)測(cè)定抗性代謝酶活力及次生代謝物質(zhì)含量。每組處理重復(fù)3次。

1.3.6 測(cè)定指標(biāo)與方法 幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHI）和β-1，3-葡聚糖酶（β-1，3-glucanase，GLU）活力測(cè)定，參照王大蔣等［15］的方法測(cè)定，略做修改。

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine amonialyase，PAL）活力測(cè)定，參照曹建康等［16］的方法測(cè)定，略做修改。

肉桂酸-4-羥化酶（trans-cinnamic acid-4-hydroxylase，C4H）活力測(cè)定，參照Liu等［17］的方法測(cè)定，略做修改。

總酚和類黃酮含量測(cè)定，參照Toor等 ［18］的方法測(cè)定總酚和類黃酮含量，并以每克果肉在280 nm和325 nm波長(zhǎng)處的OD值分別表示總酚和類黃酮含量，略作調(diào)整。

木質(zhì)素含量測(cè)定，參照周會(huì)玲等［19］的方法測(cè)定木質(zhì)素含量，并以每克果肉在280 nm波長(zhǎng)處的OD值表示木質(zhì)素含量，略作調(diào)整。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用MS Office Excel 2019軟件整理數(shù)據(jù)并繪圖，采用SPSS 23.0軟件的LSD法和ANOVA鄧肯氏多重差異法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)葉提取物成分及濃度確定

通過(guò)HPLC數(shù)據(jù)分析知茶樹(shù)葉提取物和茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品在相同的保留時(shí)間出峰，得茶樹(shù)葉提取物得主要成分為茶多酚。其次，以不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的積分峰面積為橫坐標(biāo)，茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析提取物中的茶多酚濃度（圖1）。

茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品擬合方程為y=1.32×10-5x+0.035 2，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1，說(shuō)明茶多酚質(zhì)量濃度為0.040～0.280 mg/mL，峰面積與質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系，可按標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析。移取茶樹(shù)葉提取物10 μL，采用“1.3.2”節(jié)中液相色譜條件分析，重復(fù)3次，得積分峰面積平均值為1.63×104，代入擬合方程，可得茶樹(shù)葉提取物中茶多酚含量為0.250 mg/mL。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖2為茶樹(shù)葉提取物和殼聚糖在不同濃度下的抑菌效果，兩者在各自濃度梯度下的抑菌率均表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05）。由下圖可知，茶樹(shù)葉提取物料液比為20%、15%和10%時(shí)抑菌率遠(yuǎn)高于殼聚糖，5%提取物和0.5%殼聚糖的抑菌率相似。

2.3 不同復(fù)配組合抑菌效果比較

依照“1.3.3”節(jié)中試驗(yàn)組合，通過(guò)抑菌率比較不同組合對(duì)擴(kuò)展青霉和灰葡萄孢的離體抑制作用。圖3為不同組別在離體條件下抑菌率，無(wú)論接種P.expansum還是B.cinerea，組合1、組合2、組合3和組合5的抑菌率顯著優(yōu)于其他組合（P<0.05）。隨茶樹(shù)葉提取物與殼聚糖濃度降低，病原菌的生長(zhǎng)抑制率呈下降趨勢(shì)。其中組合1、組合2、組合5對(duì)兩種病原菌的生長(zhǎng)抑制率均達(dá)到100%，具有良好的抑菌效果，故組合1、組合2和組合5為離體抑菌中的優(yōu)勢(shì)組合，并且結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可認(rèn)為每個(gè)組合中茶樹(shù)葉提取物的抑菌作用高于殼聚糖。

將組合1、組合2與組合5分別處理果實(shí)? 10 s，篩選最佳復(fù)配劑。從圖4可看出，貯藏60 d后對(duì)照腐爛率61.08%，3個(gè)組合分別是? 32.65%、18.98%、37.29%。與CK組相比，3種組合均能顯著降低腐爛率，其中組合2表現(xiàn)出極顯著差異（P<0.01），即組合2為最優(yōu)復(fù)配組合。在3個(gè)組合配比中，組合2（20%茶樹(shù)葉提取物和1.5%殼聚糖）的提取物濃度高，但殼聚糖濃度較低依舊具有良好的抑菌作用，這種表現(xiàn)與Wang等［20］研究相符，較高的殼聚糖濃度會(huì)抑制果實(shí)正常呼吸作用，可能是組合1與組合5導(dǎo)致果實(shí)腐爛率略高的原因。殼聚糖水溶液會(huì)在果實(shí)表面形成一層半透性膜，構(gòu)成一個(gè)低氧、高二氧化碳的微環(huán)境，若其濃度過(guò)高，可能會(huì)造成果實(shí)無(wú)氧呼吸與酒精發(fā)酵，導(dǎo)致果實(shí)腐爛率升高。

2.4 復(fù)配劑對(duì)果實(shí)病斑直徑的影響

如圖5-A所示，接種P.expansum后2 d內(nèi)病斑直徑未出現(xiàn)明顯變化，于3 d各組別開(kāi)始出現(xiàn)明顯差異且隨時(shí)間差異愈顯（P< 0.05）；殼聚糖處理組和CK組間雖存在差異，但二者保持著近似的病斑直徑增速，分別為3.38 mm/d和? 4.17 mm/d，而復(fù)配劑處理組的病斑直徑增速? 1.49 mm/d可以說(shuō)十分平緩。如圖5-B所示，接種B.cinerea后各組別間病斑直徑與圖5-A相差無(wú)幾，只是B.cinerea生長(zhǎng)速率較慢，復(fù)配劑處理組、殼聚糖處理組和CK組同樣表現(xiàn)明顯差異? （P<0.05），病斑直徑增速分別為1.12 mm/d、? 1.61 mm/d和1.91 mm/d。圖6為蘋果青霉病和灰霉病發(fā)病外觀照片。綜上，復(fù)配劑處理具有顯著抑制青霉病與灰霉病病斑生長(zhǎng)，從而減緩蘋果采后病害的發(fā)生。

2.5 復(fù)配劑對(duì)果實(shí)CHI和GLU活力的影響

CHI和GLU即是植物體內(nèi)兩類重要的病程相關(guān)蛋白（PR蛋白）。CHI與GLU協(xié)同作用可降解多種真菌細(xì)胞壁的主要成分，抑制真菌生長(zhǎng)。依圖7可知，無(wú)論是接種P.expansum 還是B.cinerea，CHI活性均呈現(xiàn)出先升后降的總體趨勢(shì)。接種P.expansum 后（圖7-A），3個(gè)組合處理后CHI活性先迅速升高，于1 d時(shí)便顯示差異（P<0.05）；并均于2 d達(dá)到活性峰值呈極顯著差異（P<0.01），相較CK組，此刻復(fù)配劑處理組CHI活性最高55.79 U/（min·g），殼聚糖處理組CHI活性較高46.36 U/（min·g）。接種B.cinerea后（圖7-B），3個(gè)處理組在2 d開(kāi)始表現(xiàn)出差異持續(xù)至4 d；并于3 d達(dá)到活性峰值，相較CK組，此刻復(fù)配劑處理組CHI活性高28.15%（P<0.01），殼聚糖處理組CHI活性高13.07%（P<0.05）。在7 d內(nèi)，復(fù)配劑處理組CHI活性整體顯著高于CK組，略高于殼聚糖處理組。

依圖8可知，接種兩種病原菌后，3個(gè)組別處理后GLU活性均呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)，并且在7 d內(nèi)，復(fù)配劑處理組GLU活性整體顯著高于CK組（P<0.05），高于殼聚糖處理組。接種P.expansum 后（圖8-A），3個(gè)組別均于3 d達(dá)到GLU活性峰值，相較CK組，復(fù)配劑處理GLU活性超? 7.47%（P<0.05），可高達(dá)0.296 U/（min·g），殼聚糖處理GLU活性可達(dá)0.286 U/（min·g）。接種B.cinerea后（圖8-B），3個(gè)組別處理后均于3 d達(dá)到活性峰值，相較CK組，復(fù)配劑處理GLU活性優(yōu)于9.97%（P<0.01），殼聚糖處理GLU活性超過(guò)5.10%（P<0.05）。綜上所述，復(fù)配劑處理可顯著提升果實(shí)CHI和GLU活性，增強(qiáng)抗性，抑制病原菌活性。

2.6 復(fù)配劑對(duì)果實(shí)PAL和C4H活力的影響

作為苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶，PAL與C4H活性與植物抵御逆境脅迫、抵抗病原菌侵染能力密切相關(guān)，是佐證植物抗性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)之一。如圖9所示，在7 d內(nèi)無(wú)論是接種P.expansum 還是B.cinerea均會(huì)使得PAL活性呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)，區(qū)別在于PAL活性增速快慢以及其峰值高低。接種P.expansum （圖9-A），3個(gè)組別處理后均在4 d到達(dá)活性峰值，復(fù)配劑處理組活性分別顯著優(yōu)于CK組7.20%和殼聚糖處理組3.68% （P<0.05），故復(fù)配劑處理組PAL活性增速最快，在試驗(yàn)后期3組處理也保持著相似速度減弱PAL活性。接種B.cinerea（圖9-B），復(fù)配劑處理組迅速升高后平緩下降，殼聚糖處理組快速增加快速降低，CK組則維持平緩上升趨勢(shì)并于7 d和復(fù)配劑處理組產(chǎn)生交匯。3個(gè)組別處理均在4 d到達(dá)PAL活性峰值，復(fù)配劑處理組活性極顯著高于CK組9.64%，顯著高于殼聚糖處理組3.72%；在5? d復(fù)配劑處理組活性仍保持顯著區(qū)別于后另兩組。

如圖10所示，受到病原菌侵染后，果實(shí)的C4H活性均表現(xiàn)出先降低再上升后下降趨勢(shì)。接種P.expansum （圖10-A），在7 d內(nèi)復(fù)配劑處理組和殼聚糖處理組C4H活性皆極顯著高于CK組（P<0.01），但兩者間未表現(xiàn)出明顯差異。接種B.cinerea后（圖10-B），復(fù)配劑處理組C4H活性始終顯著高于CK組（P<0.05），接種后大部分時(shí)間C4H活性高于殼聚糖組；相較于CK組在1 d和6 d表現(xiàn)出的活性峰值，復(fù)配劑處理組優(yōu)于5.60%和7.55%，殼聚糖處理組超過(guò)2.93%與4.62%；復(fù)配劑處理組最低值，相較于同時(shí)段CK組與殼聚糖處理組分別優(yōu)于5.15%與? 3.45%。綜上，復(fù)配劑處理推動(dòng)PAL和C4H活性，對(duì)果實(shí)采后病害的抗性發(fā)揮促進(jìn)作用。

2.7 復(fù)配劑對(duì)果實(shí)類總酚、黃酮、木質(zhì)素含量的影響

植物體內(nèi)總酚和類黃酮為直接抵御外敵病原菌的守衛(wèi)，木質(zhì)素則是鞏固城防細(xì)胞壁的重要抗性系統(tǒng)成員。如圖11所示，在7 d內(nèi)3個(gè)組別處理后總酚含量呈現(xiàn)出先快速升高后平緩降低趨勢(shì)。接種病原菌初期，各處理組總酚含量并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯差異，而是伴隨病原菌進(jìn)一步侵染加重，于接種4 d達(dá)各處理組總酚含量峰值。在4 d時(shí)，接種P.expansum （圖11-A），復(fù)配劑處理組總酚含量極顯著超出CK組6.71%（P

如圖12所示，接種P.expansum或B.cinerea病原菌后，復(fù)配劑處理組表征為迅速升高，于2 d時(shí)達(dá)類黃酮含量峰值，2 d后其含量緩慢減少；殼聚糖處理組表征為類黃酮含量緩慢提高4 d時(shí)達(dá)峰值，其后呈現(xiàn)平緩減少；CK處理組表征為類黃酮含量7 d內(nèi)始終呈緩慢增速，未表現(xiàn)出明顯峰值。在2 d，復(fù)配劑處理組較CK處理組極顯著高于32.00%，較殼聚糖處理組顯著高于? 24.39%。復(fù)配劑處理組峰值相較于殼聚糖處理組峰值略高于2.61%，但后者相較于前者延遲? 48 h出現(xiàn)。復(fù)配劑處理組相較于CK組總酚與類黃酮含量有顯著提高，相較于殼聚糖處理組總酚和類黃酮含量峰值呈現(xiàn)增高態(tài)勢(shì)，即證實(shí)復(fù)配劑處理可推動(dòng)總酚與類黃酮含量提高，進(jìn)而提高果實(shí)抵御病原菌侵染進(jìn)攻。

如圖13所示，在7 d內(nèi)復(fù)配劑處理組的木質(zhì)素含量均優(yōu)于殼聚糖處理組與CK組。接種? P.expansum 或B.cinerea后，復(fù)配劑處理組和殼聚糖處理組呈現(xiàn)緩慢升高后平穩(wěn)減少趨勢(shì)；CK處理組則表現(xiàn)為始終平穩(wěn)緩慢增加的態(tài)勢(shì)。接種P.expansum （圖13-A），復(fù)配劑處理組木質(zhì)素含量于4 d實(shí)現(xiàn)峰值，極顯著優(yōu)于CK組? 103.80%，高于殼聚糖處理組16.67%；接種B.cinerea（圖13-B），復(fù)配劑處理組木質(zhì)素含量于4 d實(shí)現(xiàn)峰值，極顯著優(yōu)于CK組58.10%，高于殼聚糖處理組14.56%。可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)復(fù)配劑處理，果實(shí)更加容易產(chǎn)生并累積木質(zhì)素，提高自身木質(zhì)素含量，鞏固細(xì)胞壁穩(wěn)定，增加對(duì)病原菌侵染的抵抗能力。

3 討論與結(jié)論

老、舊茶樹(shù)葉的再利用是獲取茶多酚經(jīng)濟(jì)便捷的有效途徑，茶樹(shù)葉提取物復(fù)配殼聚糖兼具良好的抑菌保鮮作用與成膜效果。趙艷琳等［21］研究表明，茶葉提取物的抑菌效果明顯，并且在放置一月內(nèi)的抑菌效果穩(wěn)定；路志芳等［22］研究表明，1.0%殼聚糖涂膜對(duì)黃瓜失重率、維生素C含量、葉綠素含量、可溶性糖含量的降低減緩；陶永元等［23］研究表明，茶多酚復(fù)合殼聚糖可實(shí)現(xiàn)櫻桃果實(shí)抑制呼吸強(qiáng)度，減緩Vc、可滴定酸、可溶性糖等物質(zhì)的消耗速率。本試驗(yàn)研究表明，20%料液比的茶樹(shù)葉含茶多酚0.025 mg/mL，復(fù)配1.5%殼聚糖處理抑制病斑直徑擴(kuò)展，減輕蘋果采后病害發(fā)生，且在接種3 d后開(kāi)始出現(xiàn)顯著差異。這可能是由于接種前期復(fù)配劑需一定時(shí)間逐步侵蝕病原菌，3 d后方有明顯效用，因此在接種后3 d，復(fù)配劑處理組病斑直徑顯著低于與另外兩處理組（P<0.05）；而且，于5 d復(fù)配劑已充分抑制病原菌活性，表現(xiàn)為病斑直徑擴(kuò)增趨于平穩(wěn)與極顯著差異（P<0.01）。

作為植物體內(nèi)兩類重要的PR蛋白，CHI和GLU主要負(fù)責(zé)降解病原菌細(xì)胞壁的工作［24］。Schlumbaum等［25］研究發(fā)現(xiàn)，由植物提純所得CHI可在體外抑制Trichoderm viride菌絲的生長(zhǎng)。當(dāng)植物受到病原菌侵染，表皮細(xì)胞受到威脅時(shí)，細(xì)胞中的CHI和GLU接收響應(yīng)，活性升高［26］。在研究中，茶樹(shù)葉復(fù)配殼聚糖處理組的CHI和GLU迅速響應(yīng)，且在7 d內(nèi)其活性均高于另兩組處理，有效提高果實(shí)對(duì)采后病原菌的抵抗力。此與袁仲玉等［27］、周曉婉等［28］采取蘆薈粗提物、1-甲基環(huán)丙烯增強(qiáng)蘋果抗性結(jié)果一致。

對(duì)于合成植物次生物質(zhì)的苯丙烷代謝途徑，PAL是其中第一位催化酚類物質(zhì)生成的酶，C4H是其中重要分支酶之一［29］。二者催化酚類的前體物質(zhì)合成，其活性更是與植物抵御逆境脅迫、抵抗病原菌侵染能力密切相關(guān)，是佐證植物抗性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)之一。在研究中，茶樹(shù)葉復(fù)配殼聚糖處理組PAL和C4H的活性始終優(yōu)于另兩組，在相同時(shí)間內(nèi)擁有更高的活性水平，加快抵抗病原菌物的次生代謝物質(zhì)生成，從而提高蘋果的抗病性。

身為植物苯丙烷代謝途徑產(chǎn)物，總酚和類黃酮是直接抵御外敵病原菌的守衛(wèi)，木質(zhì)素則是鞏固城防細(xì)胞壁的重要抗性系統(tǒng)成員［30］。Deng等［31］和Li等［32］研究發(fā)現(xiàn)，苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵酶能夠提高次生代謝物質(zhì)含量，以此實(shí)現(xiàn)植物抗性提高。在研究中，茶樹(shù)葉復(fù)配殼聚糖處理組總酚、類黃酮和木質(zhì)素含量?jī)?yōu)于另兩組。此與Terry等［33］研究結(jié)果相同。在PAL和C4H保持較高活性增速和水平時(shí)，總酚和類黃酮也同樣維持在同處理組的較高含量上。

綜上所述，20%料液比的茶樹(shù)葉含茶多酚? 0.025? mg/mL，復(fù)配1.5%殼聚糖處理能夠明顯提高病程相關(guān)蛋白CHI和GLU活性，同時(shí)可增強(qiáng)苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵酶PAL和C4H活力，推動(dòng)次生代謝物質(zhì)總酚、類黃酮和木質(zhì)素生成累積，以此實(shí)現(xiàn)提高蘋果在采后貯藏過(guò)程中對(duì)病原菌的抵抗力，抑制采后貯藏常見(jiàn)病害的發(fā)生，有效改善蘋果貯藏品質(zhì)。老、舊茶樹(shù)葉復(fù)配殼聚糖為蘋果采后病害防治提供新思路，也為茶樹(shù)葉再利用探尋出新途徑。

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Effect of Combining Tea Tree Leaf Extract with Chitosan on Postharvest Disease Resistance in Apples

YAO Yue，YU? Tingting，ZHANG Rui，BAO Huiying and? ZHOU Huiling

（College of Horticulture，Northwest A&F University，Yangling? Shaanxi 712100，China）

Abstract To explore the effects of? combining tea tree leaf extract with chitosan on the major postharvest diseases in apples，the combination with the best antibacterial effect was firstly selected through in vitro experiments，then the ‘Fuji apple was chosen as the experimental material.The fruits were soaked in the combination for 10s and induced for 24? h before inoculation with P.expansum and B.cinerea. Following the inoculation，the relevant disease resistance indicators were determined through regular sampling.Disease resistance indicators were assessed 24 hours after inoculation with P.expansum and B.cinerea? using regular samples..The results showed that 20% tea tree leaf extract and?? 1.5%? chitosan were the most effective antibacterial combination.Compared to the control and chitosan-treated groups，the tea tree leaves compounded with chitosan significantly inhibited the expansion of apple P.expansum and B.cinerea spots（P<0.05）.This formulation increased the activity of chitinase and β-1，3-glucanase，induced the response of key enzymes in the metabolic pathway of phenylpropane，significantly enhanced the activity of phenylalanine deaminase and cinnamate-4-hydroxylase，and promoted the accumulation of total phenols，flavonoids and lignin production of resistant secondary metabolites in apple fruit（P<0.05）.In conclusion，combination of tea tree leaves with chitosan promotes the accumulation of resistant secondary metabolites，suppress spot diameter and retards disease development by inducing key enzyme responses in the apple disease process-related protein and phenylpropane metabolic pathways.

Key words Apples; Teatree leaves; Chitosan; Penicilliosis; Gray mold

Received ?2022-10-29??? Returned 2022-12-01

Foundation item The? Natural Science Foundation of Shaanxi Privince （No.2021JZ-15）; the Key Project for Apple （No.2020zdzx03-05-01）.

First author YAO Yue，female，master student.Research area：postharvest physiology and storage preservation for horticultural products.E-mail：731265158@qq.com

Corresponding?? author ZHOU Huiling，female，associate professor，master supervisor.Research area：postharvest physiology and storage preservation horticultural product.E-mail：zhouhuiling@nwsuaf.edu.cn

（責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUO Baishou）