一株野生地生亞側耳的分離鑒定及其生物學特性

韓振 何建清 葛彥宏 劉海鑫 徐東 張格杰

摘 要 從西藏農牧學院校園采集到一株野生亞側耳（編號為HGHZ02），為了使該菌種得到更好的開發和利用，對其進行了鑒定和生物學特性研究。通過形態學和ITS序列聚類分析，鑒定菌株HGHZ02與勺狀亞側耳（Hohenbuehelia petaloides）的相似度達到100%，但通過形態學鑒定與地生亞側耳形態特征最相似，因此將菌株HGHZ02鑒定為地生亞側耳（Hohenbuehelia geogenia）。菌株HGHZ02菌絲最適生長碳源為麥芽糖，最適生長氮源為麥芽浸粉，最適溫度為25? ℃，最適pH為pH 7.0，最適無機鹽為磷酸氫二鉀。正交試驗結果表明，菌株HGHZ02最佳生長因子組合為麥芽糖 25.0 g/L、麥芽浸粉 3.0 g/L、pH 7.0 和溫度 26? ℃。

關鍵詞 地生亞側耳；分離；鑒定；生物學特性

亞側耳屬（Hohenbuehelia）屬于擔子菌門（Basidiomycota），傘菌綱（Agaricomycetes），傘菌目（Agaricales），側耳科（Pleurotaceae）［1］。該屬分布于中國、蘇聯、日本、歐洲及北美等地區［2］，在中國多省有分布，主要單生或小群體生于針葉或闊葉樹死木上，稀生于草地或灌叢中［3］。目前，全球共記錄亞側耳屬有130多個，在中國報道的有12種，即亞側耳（Hohenbuehelia serotina）、黑亞側耳（H.nigra）、灰白亞側耳（H.grisea）、橙囊亞側耳（H.aurantiocystis）、勺形亞側耳（H.petaloides）、巨囊亞側耳（H.ingentimetuloidea）、漸狹亞側耳（H.angustata）、腎形亞側耳（H.reniformis）、橄欖綠色亞側耳（H.olivacea）、暗藍亞側耳（H.atrocaerulea）、地生亞側耳（H.geogenia）和小亞側耳（H.fluxilis） ［4］。

研究表明，亞側耳屬具有抗腫瘤［5-6］、抗輻射［7］、抗疲勞［8］和衰老［9］等功效，具有豐富的營養成分。據報道，小亞側耳（H.fluxilis）、勺狀亞側耳（H.petaloides）和腎形亞側耳（H.reniformis）具有食用價值［10］。研究表明，亞側耳屬的無性型菌絲都具有捕食線蟲的作用［11-15］，它們通過線蟲被帶有膠粘細胞的菌絲俘獲，菌絲侵入體內，將蟲體消化或者分生孢子遇到線蟲膨脹就會產生粘性，隨后粘住線蟲表皮［14］。亞側耳屬真菌種類較多，但馴化栽培成功的較少，已馴化成功的有亞側耳（H.serotina）、勺形亞側耳（H.petaloides）和腎形亞側耳（H.reniformis），亞側耳（H.serotina）已實現商業化栽培。雖然亞側耳屬真菌具有較大的潛在經濟價值，但由于亞側耳屬的野生資源量分布較少，產量低，采摘難，制約著對亞側耳屬的進一步研究。目前，關于地生亞側耳的基礎生物學研究還未見報道，為了更科學地對地生亞側耳進行開發利用，同時也為地生亞側耳的物種保護提供基礎性資料，筆者從西藏農牧學院校園草坪上采集到1株地生亞側耳子實體，采用組織分離法獲得其菌絲體，通過形態特征和ITS序列聚類分析對其進行鑒定，單因素和正交試驗探討了不同營養因子對該菌株菌絲生長影響，以期為該菌種的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株子實體采自西藏農牧學院校園草坪（緯度 94°34′，經度 29°67′，海拔 3 100? m），現保存于西藏農牧學院大型真菌標?? 本館。

1.1.2 供試培養基 母種分離培養基采用PDA 培養基［16］：馬鈴薯塊200 g（去皮切片煮汁），葡萄糖 20 g，瓊脂粉20 g，水1 000? mL，pH 6.5。

碳源、氮源測定培養基采用馬鈴薯綜合培養基［16］：馬鈴薯塊 200 g（去皮切片煮汁），蛋白胨? 2 g，磷酸二氫鉀 1 g、 磷酸氫二鉀0.5 g、硫酸鎂?? 0.5 g、瓊脂粉20 g，水1 000 mL，pH自然。

無機鹽基礎培養基：馬鈴薯塊 200 g（去皮切片煮汁），葡萄糖 20 g，酵母膏2 g，瓊脂粉20 g， VB1 100 mg，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種分離 采用組織分離法［17-18］進行菌種分離，在超凈工作臺內將采集到的2株地生亞側耳子實體用75%的酒精將表面進行消毒，將子實體撕開，用解剖刀取柄蓋交界處黃豆粒大小的組織置于PDA平板上，25? ℃恒溫培養箱中進行暗培養，菌絲多次進行轉接，得到3組純培養物，將其中一個編號為HGHZ02作試驗菌株。

1.2.2 形態學鑒定

對采集到的新鮮標本用解剖刀縱切子實體觀察其菇蓋形狀和顏色、菌肉顏色和質地，菌褶形狀和著生情況，菌柄著生方式和質地、中實或中空等特征；采用徒手切片的方法，在光學和掃描電鏡下觀察其分生孢子和擔孢子各80個，菌褶等形態特征，參照《中國大型菌物資源圖鑒》［19］進行傳統的形態學鑒定。

1.2.3 分子生物學鑒定 將分離純化的菌株HGHZ02、HGHZ03、HGHZ04進行DNA的提取，利用 ITS1（ 5′-TCCGTAGGTGAACCTGC- GG-3′）和 ITS4（ 5′-TCCTCCGCTTATTGATA-TGC-3′）通用引物進行 PCR 擴增測序鑒定［20］，三者序列一致將測序結果獲得的ITS序列在NCBI （National Center for Biotechnology Information）數據庫中進行Blast比對分析。自測序列和 GenBank 下載的相關序列用MEGA-11 進行系統發育分析并構建進化樹 ［21］。

1.2.4 菌絲體生物學特性研究 不同碳源對菌絲生長的影響：以無碳源馬鈴薯綜合培養基? （“1.1.2”節）為空白對照，分別設置7種碳源（葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木糖、淀粉）作為處理組，濃度均為20 g/L。用直徑為8 mm打孔器從菌種培養基同一半徑處打孔取菌塊，菌面朝下接種在7種培養基上，25?? ℃培養，當有一個處理菌絲長滿時，停止試驗，十字交叉法測量菌絲生長直徑，每處理 5個重復。菌絲生長速度? （mm/d）=（最后一次測量菌落直徑-第1次測量菌落直徑）/培養時間。

不同氮源對菌絲生長的影響：以無氮源馬鈴薯綜合培養基（“1.1.2”節）為空白對照，分別設置7種氮源（蛋白胨、酵母浸粉、尿素、 硝酸鈉、硫酸銨、牛肉膏、酵母膏）作為處理組，濃度均為? 20 g/L。其他操作同碳源影響試驗。

溫度試驗：設置5個溫度梯度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35? ℃），其他操作同碳源影響試驗。

不同pH對菌絲生長的影響：設置5個pH梯度（6、7、8、9、10），其他操作同碳源影響試驗。

不同無機鹽對菌絲生長的影響：以無機鹽基礎培養基不添加無機鹽為空白對照，設置分別加入硫酸鎂（MgSO4）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4），作為不同無機鹽處理，其他操作同碳源影響試驗。

1.2.5 正交試驗 選擇最佳碳源、氮源、溫度和pH進行L9（34） 4因子3水平正交試驗（表1）。

1.2.6 數據處理 采用SPSS 22.0軟件對所得數據進行整理和方差分析。菌絲日均生長速率以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定

2.1.1 子實體形態特征 野生擔子果群生或近叢生于草地上，子實體中等大小，菌蓋直徑3～10 cm，初期勺狀，后期花瓣狀，初期淡肉桂色，后期淡肉桂色至淺黃褐色；邊緣光滑、波浪狀，中下部具白色至灰白色細小絨毛。菌肉白色，有蘑菇香味。菌褶白色，稠密、不等長，延生，窄。菌柄長? 2～4 cm，直徑0.7～2.0 cm，與菌蓋同色，實心，具白色至灰白色細小絨毛（圖1-A、1-B）。囊狀體多（13.9～22.5）μm×（48.8～76.5）? μm，梭形，近紡錘形（圖1-F）。擔孢子（5.18～6.05） μm×? （3.36～4.05） μm，光滑、無色，橢圓形，非淀粉質（圖1-G）。孢子印為白色。與其親緣關系最近的勺狀亞側耳（H.petalodes）相比，菌株HGHZ02的子實體較大，菌蓋和菌柄顏色更深，菌肉有蘑菇香味，孢子較小，生長環境為群生生于草坪上。

2.1.2 菌株營養菌絲的形態特征 在PDA平板中培養的菌落呈白色，絮狀，氣生菌絲多且致密（圖1-C）。但菌絲生長緩慢，菌絲體5 d開始擴展，兩個星期向周圍延伸1 cm。分生孢子（3.5～5.8） μm×（5.4～12.1）? μm，橢圓形（圖1-E）。在光學顯微鏡下，菌絲細胞壁較薄，有隔膜，無色透明，均一，分枝均勻，菌絲直徑2.7～4.2 μm。鎖狀聯合明顯（圖1-D）。

2.2 分子生物學鑒定

對菌株HGHZ02菌絲體經PCR擴增及測序分析表明，菌株HGHZ02 ITS序列長度為669 bp。GenBank登錄號為OP692717。將其ITS序列進行Blast序列對比，采用MEGA-11構建系統發育進化樹，菌株HGHZ02所有建樹亞側耳屬的菌株相似性均高，其中與勺狀亞側耳（H.petalodes）相似度達到100%，并獲得100%的支持率（圖2）。但從形態學特征方面看，菌株HGHZ02與勺狀亞側耳（H.petalodes）存在明顯的差異，與地生亞側耳的形態學特征最相似［19］，因此，結合形態學和分子生物學特征，將菌株HGHZ02鑒定為側耳科，亞側耳屬，地生亞側耳（H.geogenia）。該種為西藏新紀錄種。

2.3 菌絲體生物學特性

2.3.1 不同碳源對菌株HGHZ02菌絲生長速率的影響 由表2和圖3可見，菌株HGHZ02在供試7種碳源中均能生長，菌絲生長速率最快的是麥芽糖和葡萄糖，菌絲生長速率分別為2.57 mm/d和2.30 mm/d，菌絲生長速率顯著大于其他碳源（P＞0.05），且菌絲菌絲濃密均勻、長勢旺盛，氣生菌絲發達，其次是乳糖和果糖，菌絲生長速率分別為1.87 mm/d和1.83 mm/d，菌絲生長速率較差的是木糖、淀粉和蔗糖，菌絲生長速率分別為1.53 mm/d、1.60 mm/d 和1.57 mm/d。對菌絲生長速度、長勢及數據的方差分析表明，菌株HGHZ02菌絲生長最適宜的碳源為麥芽糖。

2.3.2 不同氮源對菌株HGHZ02菌絲生長速率的影響 由表3和圖4可見，菌株HGHZ02在供試7種氮源中均能生長，有機氮源較無機氮源對菌絲生長更有利，其中以麥芽浸粉為氮源時菌絲生長速率最快，菌絲生長速率達2.47 mm/d，其次為酵母膏和蛋白胨，菌絲生長速率分別達1.97 mm/d和1.83 mm/d，硫酸銨、硝酸鈉和尿素作為氮源時，菌絲生長慢，長勢弱，菌絲生長速率分別為1.67 mm/d、1.53 mm/d和0.53 mm/d。對菌絲生長速度、長勢及數據的方差分析表明，菌株HGHZ02菌絲生長最適宜的氮源是麥芽浸粉。

2.3.3 不同溫度對菌株HGHZ02菌絲生長速率的影響 由表4和圖5可見，除在35? ℃條件下菌株HGHZ02菌絲不能生長，在其他溫度條件下菌絲均可生長。其中以25? ℃時菌絲生長速率最快，菌絲生長速率達2.30 mm/d，其次為20? ℃和? 15? ℃，菌絲生長速率分別達1.57 mm/d和1.50 mm/d，30? ℃時，菌絲生長慢，長勢弱，菌絲生長速率為? 1.20 mm/d。對菌絲生長速度、長勢及數據的方差分析表明，25? ℃更適宜菌株HGHZ02菌絲的生長。

2.3.4 不同pH對菌株HGHZ02菌絲生長速率的影響 由表5和圖6可見，菌株HGHZ02在5個不同的pH梯度下均能生長。其中以pH 10.0時菌絲生長速率最快，菌絲生長速率達3.77 mm/d，其次為pH 7.0和pH 9.0，菌絲生長速率分別達2.93 mm/d和2.77 mm/d，在pH 6.0和pH 8.0時，菌絲生長慢，長勢弱，菌絲生長速率分別為2.47 mm/d和2.30 mm/d。綜合考慮培養基內菌絲和氣生菌絲生長情況，pH 7.0更適宜菌株HGHZ02菌絲的生長。

2.3.5 不同無機鹽對菌株HGHZ02菌絲生長速率的影響 由表6和圖7可見，菌株HGHZ02在供試3種無機鹽中均能生長，其中以磷酸氫二鉀（K2HPO4）為無機鹽時菌絲生長速率最快，菌絲生長速率達3.50 mm/d，其次為磷酸二氫鉀（KH2PO4）和硫酸鎂（MgSO4）時，菌絲生長速率分別達3.47? 和3.33 mm/d。對菌絲生長速度、長勢及數據的方差分析表明，選取K2HPO4作為無機鹽更有利于菌株HGHZ02菌絲的生長。

2.3.6 正交試驗 根據以上6個單因子試驗結果，挑選影響較大的碳源、氮源、pH和溫度這4個因子3水平正交試驗（表7，圖8）。碳源、氮源、pH和溫度這4個因子的極差R分別是0.38、? 0.20、0.33和0.45， 4因素對菌株HGHZ02菌絲生長的影響依次表現為溫度＞碳源＞pH＞氮源。其中，碳源均值依次為X2=X3>X1，氮源均值依次為X3>X1>X2，pH均值依次為X2>X3>X1，溫度均值依次為X3>X2>X1，綜合考慮得到最佳組合為A2B3C2D3，即麥芽糖25.0 g/L、麥芽浸粉3.0 g/L、pH 7.0和溫度26? ℃，此時菌絲生長速度最快，效果顯著。

3 結論與討論

結合形態學和ITS序列分析，將菌株HGHZ02鑒定為地生亞側耳（H.geogenia）。單因素試驗結果表明：菌株HGHZ02菌絲生長最適碳源為麥芽糖，最適氮源為麥芽浸粉，最適溫度為25? ℃，最適pH 7.0，最適無機鹽為K2HPO4，最適生長因子為玉米粉。正交試驗結果表明：菌株HGHZ02最佳因子組合為麥芽糖 25.0 g/L、麥芽浸粉 3.0 g/L、pH 7.0 和溫度 26? ℃。

分子生物學鑒定結果表明，菌株HGHZ02與勺狀亞側耳（H.petalodes）相似度達到100%，并獲得100%的支持率，但形態學鑒定結果表明，菌株HGHZ02與勺狀亞側耳（H.petalodes）在形態特征方面存在明顯的差異，菌株HGHZ02與更符合地生亞側耳（H.geogenia）的形態特征。生物學特性試驗結果表明，地生亞側耳菌株（HGHZ02）在不同供試碳源條件下生長適應性較好，并且以麥芽糖和葡萄糖條件下菌絲生長最好，差異不顯著，這與竹文坤等［15］勺狀亞側耳菌株生物學特性研究結果一致。在氮源方面，以蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、酵母膏為氮源添加的培養基中地生亞側耳菌絲生長較好，而以尿素、硝酸鈉和硫酸銨為氮源時生長較差，說明地生亞側耳菌株對有機氮源的利用率明顯高于無機氮源，這可能是由于有機氮含有更多營養元素，如微量元素、維生素等，可以促進菌絲生長［22］。溫度單因素篩選試驗顯示，地生亞側耳固體培養最適溫度為25? ℃，中低溫條件更適合地生亞側耳菌絲的生長。在該試驗中，地生亞側耳菌絲體表現出具有較廣泛的酸堿環境適應性，pH的變化對于地生亞側耳菌絲體的生長影響不大，這與前人的研究結果具有一致性［13］。在無機鹽方面，地生亞側耳在磷酸氫二鉀為無機鹽條件下菌絲體生長迅速，這可能是由于地生亞側耳對于鉀營養的要求偏高，或鉀可以促進菌絲的生長。

雖然擔子菌類產生無性孢子的種類和現象比較少，但少數傘菌也被證明可以通過無性孢子進行無性繁殖［23］。在本研究中，觀察到地生亞側耳雙核菌絲產生的分生孢子，并且菌絲的培養時間與分生孢子的產生量呈正相關，這豐富了地生亞側耳生活史的內容。

本研究對地生亞側耳菌株HGHZ02進行了生物學特性的研究，其營養成分、馴化栽培、藥理功效和生防藥劑利用方面有待進一步研究，本試驗對后續地生亞側耳的開發研究和可持續利用提供了可能。

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Isolation，Identification and Biological Characteristics Analysis of a Wild Hohenbuehelia geogenia

HAN Zhen，HE Jianqing，GE Yanhong，LIU Haixin，XU Dong and ZHANG Gejie

（College of Plant Science，Tibet Agricultural and Animal Husbandry University，Linzhi?? Xizang 860000，China）

Abstract A wild mushroom，identified as HGHZ02 was collected on the campus of Tibet Agricultural and Animal Husbandry in Linzhi，Tibet.In order to fully develop and utilize the strain，its biological characterization was identified.The results showed that? strain HGHZ02? exhibited 100% similarity to the Hohenbuehelia petaloides through morphology and ITS sequence clustering analysis.The morphological characteristics were found to be most similar to those of Hohenbuehelia geogenia.Therefore，strain HGHZ02 was identified as the Hohenbuehelia geogenia.The biological characteristics showed that maltose was the most suitable carbon source for mycelium growth ，malt extractpowder was the most suitable nitrogen sourc，the optimum temperature was 25? ℃，the optimum pH was 10.0，and the optimum inorganic salt was K2HPO4.Orthogonal experiments showed that the best combination of growth factors for strain HGHZ02 includes? maltose at 25.0 g/L，malt extract powder at 3.0 g/L，pH at 7.0，and a temperature of 26? ℃.

Key words Hohenbuehelia geogenia; Isolation; Morphology; Biological properties

Received ?2022-11-09??? Returned 2023-02-04

Foundation item Key Science and Technology Project of Tibet Autonomous Region （No.XZ202001ZY0019N）；Graduate Student Innovation Program of Tibet Agricultural and Animal Husbandry College （No.YJS2022-49，No.YJS2022-45）.

First author HAN Zhen，female，master student.Research area：wild rare food and medicinal mushrooms.E-mail：1713858673@qq.com

Corresponding?? author HE? Jianqing，female，master supervisor.Research area：development and utilization of microbial resources.E-mail：hejianqingxz@163.com

（責任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUO Baishou）