AIF1 在急性髓系白血病中的表達及生物信息學分析

高婭婭，李妙雨，孫文瑞，賈雙雙，田 彪，肖婉婷，張春燕，馮 娟，高廣勛

（1.陜西中醫藥大學第二臨床醫學院，陜西 咸陽 712000；2.解放軍空軍軍醫大學西京醫院血液內科，陜西 西安 710000）

急 性 髓 系 白 血 病（acute myeloid leukemia ，AML） 可由基因突變、染色體易位或分子水平的變化引起，是一種生存具有高度異質性的疾病，預后不一。AML 是成年人中最常見的白血病，約占所有疾病的80%［1］。隨著診療技術的進展，AML 患者的生存較前有所改善，但老年人群的預后仍然較差［2］。新的生物標志物的發現可能有助于更好地理解AML 的分子基礎，并在AML 的診斷、療效預測、預后判斷中發揮重要作用，甚至為未來的靶向藥物開發和治療提供新的靶點。

同種異體移植炎癥因子-1（allograft inflammatory factor 1，AIF1）是一種 17 kDa 的鈣結合蛋白，由單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞產生，它的合成是由 INF-γ 誘 導 的［3］。AIF1 基 因 位 于 染 色 體 6p21.3上的主要組織相容性復合體 Ⅲ類區域。既往在多種不同的疾病中觀察到 AIF1 表達增加，包括子宮內膜異位癥，動脈粥樣硬化，類風濕性關節炎和纖維化［4，5］。既往研究報道AIF1 在神經系統退行性疾病和代謝紊亂（如代謝綜合征和糖尿病）中促進疾病發生發展的作用［5，6］，在糖尿病腎病中 AIF1 通過miR-34a/ATG4B 通路調節人腎小球內皮細胞的炎癥、氧化應激和自噬水平，通過體內體外實驗研究發現 AIF1 表達升高時，miR-34a、活性氧和炎癥因子水平明顯升高，而自噬相關蛋白下降，而 AIF1 基因下調效果相反［7］。也發現 AIF1 參與多種不同的腫瘤疾病中，包括乳腺癌，肝細胞癌，非小細胞肺癌等。在乳腺癌中，AIF1 通過激活 NF-κB/細胞周期蛋白 D1 通路促進乳腺癌增殖，促進腫瘤生長［8］。在肝細胞癌中 AIF1 表達升高與門靜脈腫瘤血栓形成顯著相關，沉默 AIF1 表達可抑制肝細胞癌細胞增殖和遷移［9］。在結直腸癌中 AIF1 通過激活 p38 MAPK 信號通路抑制結直腸癌細胞增殖和遷移，誘導細胞發生凋亡從而發揮抗腫瘤作用［10］。在非小細 胞 肺 癌 中，AIF1 通 過 激 活 p38 MAPK 和 JAK/STAT 信號通路來促進非小細胞肺癌細胞系的增殖、遷移、IL-6 分泌和 VEGF 分泌［11］。非小細胞肺癌中高 AIF1 表達還與轉移、較高的 TNM 分期和較差的生存率有關。在血液腫瘤中，課題組通過GEO 骨髓瘤數據集分析發現AIF1 在多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）中低表達，且與MM 進展、治療反應、ISS 分期及無進展生存期呈負相關。體外細胞水平驗證了過表達AIF1 后增加了骨髓瘤H929、U266 細胞的凋亡比例，降低了自噬水平，初步機制探索認為AIF1 可能是通過 PI3K/AKT 通路影響 MM 細胞自噬和凋亡，綜上表明 AIF1 可能在MM 發生發展中發揮著重要的作用。

本研究旨在通過數據庫挖掘分析確定AIF1 的表達量與AML 預后之間的關系：首先，獲得癌癥基因組圖譜（TCGA）和基因型-組織表達（GTEx）的初治AML 樣本RNA-seq 數據，分析核心基因AIF1的差異表達［12］。其次，通過GO、KEGG 對AIF1 進行功能富集和通路富集分析，選擇與AIF1 相關的顯著改變的基因和通路。最后， 應用GEO 數據庫的生存數據集進行Kaplan-Meier 生存曲線繪制、采用Cox 回歸和諾莫圖預測模型，分析AIF1 在AML中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 RNA-seq 數據和生物信息學分析

通 過UCSC Xena （https：//xenabrowser.net/datapages/）網站獲得癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫和基因型-組織表達（GTEx）數據庫的33 種腫瘤類型和正常組織的RNA-seq 數據及相關臨床數據［13］。從TCGA 數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/repository） 獲 取 初 治 AML 樣 本 的HTSeq-FPKM 和HTSeq-Count 數據進一步分析。本研究實施的所有程序均符合《赫爾辛基宣言》（2013 年修訂）。

1.2 人類蛋白質圖譜（HPA）數據庫分析

HPA（https：//www.proteinatlas.org/）數 據 庫包含蛋白組學、轉錄組學以及系統生物學數據，可以繪制組織、細胞、器官等圖譜，不僅收錄了腫瘤組織以及正常組織的蛋白表達情況，還可以繪制腫瘤患者的生存曲線［14］。本研究以“AIF1”為關鍵詞分析了AIF1 在各種細胞系如白血病細胞系、肺細胞系、乳腺細胞系和腦細胞系中的表達。

1.3 差異表達基因（DEGs）分析

使用R 軟件中的“limma”包對合并后的數據集進 行 差 異 基 因 分 析，以P＜0.05（P：校 正P）與|log2FC|＞1.5 為過濾條件篩選DEGs。通過分析不同AIF1 表達組之間的差異表達基因（低表達組：0%～50%； 高表達組：50%～100%），利用pheatmap 包繪制熱圖，并標注上調與下調最顯著的前10個DEGs。

1.4 富集分析

運 用R 軟 件 中“clusterProfiler”包，以P＜0.05為過濾條件，對DEGs 進行基因本體 （gene ontology，GO）、京都基因和基因組數據庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和 疾 病 本 體（disease on-tology，DO）富集分析。

1.5 蛋白質互作（PPI）網絡

利用Metascape （https：//metascape.org/gp/index.htm）進行通路和過程富集分析。使用STRING數據庫預測DEGs 的PPI 網絡。用Cytoscape（版本3.9.0）繪制PPI 網絡，并使用MCODE（版本1.6.1）識別PPI 網絡中最重要的模塊。根據PPI 的中心節點及聚類情況，篩選在顯著性富集結果中出現的基因為關鍵基因［15］。

1.6 預后模型生成和預測

使用RMSR 軟件（版本6.2.0）生成諾莫圖，繪制諾莫圖預測概率和觀測率。并通過1 000 個自舉樣本的校準曲線來驗證預測模型的準確性，當曲線與45°對角線吻合時，預測概率與實際結果頻率一致性較好。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

1.7 分離收集CD34+細胞

收集西京醫院血液科20 例初診AML 患者的骨髓標本，10 例健康受試者的骨髓標本。健康受試者均接受病毒感染和骨髓異常的篩查，這些受試者沒有使用過免疫調節藥物，也沒有已知的影響免疫系統的疾病。采用密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞，CD34+磁珠分選CD34+細胞。冷凍CD34+細胞用于后續實驗。

1.8 免疫印跡

根據上述方法收集患者骨髓樣本，并收集單個核細胞裂解物。使用RIPA 緩沖液低溫下提取蛋白樣品，并在4 ℃離心30 min 去除不溶物。電泳分離蛋白質后，PVDF 膜進行蛋白質轉移，室溫下牛奶封閉 1 h。在 4 ℃ 冰箱中與AIF1 一抗孵育過夜。次日用TBST 洗滌 PVDF 膜，并在室溫下與二抗孵育1 h。TBST 去除過量的抗體后使用發光試劑盒進行曝光。選擇 GAPDH 作為內參，通過 Image Lab分析蛋白表達量。

于君主而言，春秋時期的勾踐在自省中找到了治國之策；于國家而言，新中國在自省中找到了復興之路，繼而實現了強國之夢。可見從古至今，自省都在不同的階段和層面發揮著巨大的作用。

1.9 qRT-PCR

用TRIzol 法提取單個核細胞的總RNA。根據mRNA qPCR RT Master Mix 試 劑 盒 合 成cDNA，使 用SYBR?Green Realtime PCR Master Mix 進 行實時熒光定量PCR。以GAPDH 作為內參。AIF1的特異性引物如下：正向，5′-ACGTTCAGCTACCCTGACTTTCT-3′；反向，5′-CCTGTTGGCTTTTCCTTTTCTCT-3′。GAPDH 的特異性引 物 如 下：正 向，5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′；反向，5′- GGCTGTTGTCATACT TCTCATGG -3′。

1.10 統計學分析

所有的統計分析都基于R 軟件（版本：3.6.3）或者SPSS（版本：23.0）。

2 結果

2.1 AIF1 在泛癌和AML 中的表達

從 UCSC XENA （https：//xenabrowser.net/datapages/）下 載TCGA 數 據 庫 中 腫 瘤 和GTEx 數據庫中正常人的RNA-seq 數據。通過標準化分析，本研究發現AIF1 在25 種腫瘤中存在顯著表達差異（圖1A），在初治AML 患者樣本中表達高于正常組織（圖1B）。隨后，根據HPA 數據庫中RNA-Seq 數據分析AIF1 在初治AML 中的相對表達水平，可發現AIF1 mRNA 在AML 細 胞 系 如HMC-1、NB-4、HEL、THP-1 和U937 中的表達高于淋巴細胞系。同時，AIF1 mRNA 在其他如腦、胰腺、肺等的細胞系中幾乎不表達（圖1C）。

圖1 AIF1 在泛癌和AML 中的表達Fig 1 The expression of AIF1 in AML compared with normal samples

2.2 AIF1 高表達和低表達的AML 樣本的DEGs鑒定

分析高、低表達組間基因表達譜mRNA 中位表達量的差異，鑒定出具有統計學意義（|logFC| ＞1.5，P＜0.05） 的DEGs 共1 275 個，其中有444 個上調基因和831 個下調基因（圖2A）。AIF1 高表達組差異最顯著的前5 個DEGs 和低表達組差異最顯著的前5 個DEGs（圖2B）。

圖2 AIF1 高表達和低表達的AML 樣本的DEGs 鑒定Fig 2 Identification of DEGs in AML samples with high and low expression of AIF1

2.3 DEGs 功能富集分析

為探索AML 中AIF1 高表達和低表達之間的DEGs 的 功 能 意 義，本 研 究 使 用cluster profile 包 進行GO 分析和KEGG 通路富集分析（補充表1，圖3）。GO 分析結果顯示DEGs 與生物過程（BP）相關的功能包括白細胞遷移、細胞外結構組織和細胞外基質組織；與細胞成分（CC）相關的包括含膠原的細胞外基質、神經元胞體和質膜外側面；與分子功能（MF）相關的包括受體配體活性、細胞外基質結構成分、貨物受體活性。KEGG 分析發現DEGs 功能涉及神經活性配體-受體相互作用、細胞因子-細胞因子受體相互作用和金黃色葡萄球菌感染。

表1 TCGA 數據庫AML 樣本中AIF1 表達與臨床病理特征之間的關系［n（%）］Tab 1 Association between AIF1 expression and clinicopathologic features in AML samples from the TCGA database［n（%）］

圖3 TCGA-LAML 患者AIF1 高表達和低表達DEGs 的GO/KEGG 富集分析Fig 3 GO/KEGG enrichment analysis of DEGs between high and low AIF1 expression in TCGA-LAML patients

在AIF1 高表達和低表達的數據集之間進行GSEA 分析，以識別參與AML 的關鍵信號通路。在這些通路的數據庫MSigDB 中觀察到顯著的差異 （FDR＜0.25， 校正P＜0.05）（補充表2 和圖4）。在AIF1 高表達組中，AML 中的基因突變或融合基因 如CBFB-MYH11 融 合、NPM1 突 變 和MLL 融 合顯 著 富 集（校 正P＜0.05，FDR＜0.05）（圖4A～4C）。相反，在AIF1 低表達組中，AML 中預后較好的因子如PML-RARA 融合基因和AML1-ETO 融合基因表現出顯著富集（圖4D～4F）。AIF1 涉及NFκB、P53 和MAPK 通路參與AML 及其他腫瘤的發生（圖4G～4I）。

表2 logistic 回歸分析AML 臨床病理因素與AIF1 表達的關系Tab 2 The relationship between the clinicopathological factors of AML and AIF1 expression by using logistic analysis

圖4 富集圖來自基因集富集分析（GSEA）Fig 4 Enrichment plots from the gene set enrichment analysis （GSEA）

2.4 AML 的PPI 富集分析

通過STRING 構建AIF1 及其相關基因的共表達網絡，共篩選出1 275 個DEGs（| logFC | ＞1.5，P＜0.05）并導入PPI 網絡。利用Cytoscape-MCODE顯示PPI 網絡。最顯著的模塊MCODE 得分為20.267，包含31 個節點和608 條邊（圖5）。

圖5 AIF1 相關DEGs 的PPI 網絡Fig 5 The PPI network of AIF1-related DEGs

2.5 AIF1 表達與AML 臨床特征的關系

表1 是TCGA 中AML 患者的主要臨床特征。共納入151 例患者，其中男性83 例，女性68 例，平均年齡65.5 歲。其中，AIF1 在75 例（49.7%）AML 患者中低表達，其余76 例（49.3%）患者中高表達。相關性分析提示AIF1 高表達與細胞遺傳學風險、FAB 分型、NPM1 突變、白細胞（WBC）計數（×109/L）顯著正相關（P＜0.001）。此外，AIF1 表達與總生 存 期（overall survival ， OS）顯 著 相 關（P=0.009），高表達患者生存期則較短。

圖6 AIF1 表達與臨床特征之間的關系Fig 6 Association between AIF1 expression and clinical features

2.6 AIF1 高表達對不同臨床病理狀態AML 患者預后的影響

采用Kaplan-Meier 法分析AIF1 表達與AML患者預后的關系。如圖7A 所示，AIF1 高表達患者的預后明顯差于AIF1 低表達患者（OR=1.86（1.22-2.86）；P=0.004）。Kaplan-Meier 分析顯示，在 年 齡≤60 歲（P=0.035）、年 齡＞ 60 歲（P=0.041）、WBC 計數（≤20×109/L）（P＜ 0.001）、骨髓原始細胞 ≥ 20% （P= 0.04）、外周血原始細胞≤70% （P= 0.034）、IDH1 R132 突 變 陰 性（P=0.007） 、R140 突變陰性（P= 0.034） 、R172 突變陰性（P=0.014）的亞組中，AIF1 高表達與不良預后相關（圖7B～7I）。

圖7 AIF1 高表達與AML 患者較差的OS 相關Fig 7 High expression of AIF1 was associated with poor OS in AML patients

使用單因素Cox 回歸來評估OS 的預后影響因素，發現AIF1 高表達（P=0.004）、細胞遺傳學風險為差/中等（P＜0.001）、年齡＞60 歲（P＜0.001）均為OS 的預后不良因素（表3）。進一步行多因素Cox 回歸分析，僅AIF1 高表達（P=0.019）和年齡＞ 60 歲（P＜0.001）具有統計學意義，表明二者為OS 的獨立預后不良因素。

表3 單因素和多因素Cox 回歸分析影響AML 患者OS 的因素Tab 3 Univariate and multivariate Cox’s regression analysis of factors associated with OS in AML

2.7 AIF1 在AML 中的預后模型

為了更好地預測AML 患者的預后，基于Cox回歸分析，使用RMS R 包構建諾莫圖 （圖8A）。年齡、細胞遺傳學風險和AIF1 表達等3 個預后因素被納入到預測模型中。同時，利用校準圖評價預后模型的預測精度。構建帶有校準曲線的預后諾莫圖，預測個體1、3、5 年的OS （圖8B～D）。

圖8 AIF1 在AML 中的預后預測模型Fig 8 A prognostic predictive model of AIF1 in AML

2.8 數據驗證

基于GEPIA 數據庫分析，本研究發現與正常組相比，AIF1 mRNA 表達在AML 患者中顯著增加（P＜ 0.01，|Log2FC| ＞ 1）（圖9A）。進一步收集AML患者和健康受試者的骨髓樣本，分離CD34+細胞，用于qPCR 和Western blot （圖9B、C），顯示AIF1 在AML 中的表達水平升高。

圖9 數據驗證Fig 9 Data validation

3 討論

AIF1 是一種17 kDa 的胞質鈣結合炎癥反應支架蛋白，主要在免疫細胞中表達［16］。參與各種炎癥性疾病，如類風濕關節炎、結腸炎、自身免疫性疾病的 發 生 發 展［17，18］。有 研 究 表 明，AIF1 通 過 激 活NF-κB/cyclinD1 通 路 促 進 乳 腺 癌 增 殖，通 過p38 MAPK 信號通路上調TNF-α 促進乳腺癌細胞遷移。在胃癌中，AIF1 調節β-catenin 可作為保護性預后指標［19］。然而，目前對AIF1 在AML 中的表達和預后價值知之甚少。

本研究的核心結果是AIF1 在AML 中高表達，并與高細胞遺傳學風險和不良預后相關。GSEA 基因富集分析結果提示，AIF1 低表達與NPM1 突變、PML-RARa 融 合、AML-ETO 融 合 相 關，是 良 好 的預 后 因 素。相 反，AIF1 高 表 達 與NFκB、P53 和MAPK 通路相關，表明AIF1 是一個潛在的預后生物標志物［5］，而且與AML 的致癌通路相關，可能成為一個有前景的治療靶點。更重要的是，本研究發現在NPM1 突變的AML 中，AIF1 高表達預示預后不良。NPM1 突變發生于約30%的初診AML，這是迄今為止在AML 中，發現的最常見的基因異常之一。一般認為孤立的NPM1 突變對AML 有積極的預后作用［20，21］。但約30%～60%的NPM1 突變的AML 患者在5 年內復發，或許與AIF1 表達異質性相關，具體機制尚不明確有待進一步研究。此外，NFκB、p53 和MAPK 通路也被發現與AIF1 的高表達密切相關［22］。NF-κB 在AML 中持續激活，使白血病細胞逃避程序性細胞死亡機制，從而增加細胞增殖［22，23］。本研究發現AIF1 高表達與這些通路相關，可能導致其不良預后。

另外，值得注意的是AIF1 高表達與低生存率相關。多因素Cox 回歸分析顯示AIF1 高表達是除年齡（＞60 歲）外的另一個獨立不良預后因素。諾莫圖預測模型的建立進一步證實了AIF1 表達對預后的預測作用。因此，AIF1 可能是AML 患者新的不良預后因素。將AIF1、細胞遺傳學風險和年齡相結合，構建諾莫圖模型，獲得更準確的預后預測模型。校準圖顯示AIF1 相關諾莫圖的預測值與1 年、3 年、5 年OS 概率的實際觀測值一致性較好。據報道，高齡（＞60 歲）、高細胞遺傳學風險、高WBC 計數（＞20×109/L）、FLT3 突變陽性和NPM1 突變陰性是AML 不良預后的預測因素［24］。通過Cox 回歸分析和諾莫圖模型，發現AIF1 的預測能力可能優于細胞遺傳學風險、高WBC 計數、FLT3 突變狀態。從這個角度來看，本研究模型可能為個體AML 患者提供個性化評分。

綜上所述，本研究首次揭示了AIF1 在AML 中高表達，不僅是AML 預后不良的潛在生物標志物，且可能通過調節免疫細胞的腫瘤侵襲在 AIF1 微環境中發揮重要作用，提示AIF1 可作為調節抗腫瘤免疫應答的治療靶點。本研究也有一定局限性。首先，由于回溯性特征，研究可能導致選擇偏差，未來可進行前瞻性研究以驗證生物標志物在AML 個性化管理中的臨床應用。其次，未進一步證實AIF1在腫瘤中作用的相關通路。再次AIF1 治療腫瘤免疫的基礎機制和免疫特征的預后價值應進一步研究。

作者貢獻度說明：

高婭婭：數據分析及文章寫作；李妙雨，孫文瑞，賈雙雙， 田彪， 肖婉婷，張春燕，馮娟：給予修改意見；高廣勛：指導研究設計及文章寫作并提供項目基金支持。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。