青海一例犢牛腹瀉大腸桿菌分離鑒定與藥敏試驗討論

為探究青海省犢牛腹瀉的優質治療方案，本次試驗依據當地牛養殖場內的犢牛腹瀉發病案例，收集患病犢牛新鮮糞便為病料，采取實驗室細菌分離法將病料中的大腸桿菌分離出，并明確大腸桿菌的致病性。同時采取紙片擴散法對提取出的大腸桿菌實施藥敏試驗，篩選出對大腸桿菌表現敏感的藥物。研究結果表明：在本次病例中共分離出大腸桿菌致病菌株15種，且不同的菌株對藥物的敏感性不同。其中對恩諾沙星、頭孢噻呋鈉敏感率較高，分別為87%、80%，對鏈霉素、阿莫西林、四環素耐藥性較高，為67%。因此，建議該養殖戶在實施犢牛腹瀉治療時，可使用恩諾沙星及頭孢噻呋鈉交替輪換治療，并對發病嚴重的犢牛群體加以輔助藥劑治療，減少犢牛腹瀉治療的盲目性，以提升治療效果。

一、青海省犢牛腹瀉發生現狀

青海省作為養殖大省，牛羊養殖為當地牧民的重要經濟來源。在牛養殖期間，犢牛腹瀉屬于一種較為常見的傳染性疾病，致病因較為復雜，通常包含環境因素、飼料因素、自身免疫因素等。犢牛在出生之后，由于其自身的消化道系統發育不完善，對致病原的抗性差，當養殖環境不良、營養供應不足、初乳不足或無法吃上初乳的情況下，均會導致犢牛的腸胃消化功能異常，較易受各種致病原的侵染，出現腹瀉病癥。通過對青海省的犢牛腹瀉的發生與流行特征調查，青海省犢牛腹瀉發生率逐年提升，且發病后持續周期長，藥物治療效果不佳，并且犢牛腹瀉病癥在經過治療后，無法達到痊愈的效果，常表現出周期性、頑固性的傳播與流行。為更好的防治青海省犢牛腹瀉疾病，降低其對犢牛養殖的影響，需加強對致病原的研究與調查，并采取致病原分離鑒定、藥敏試驗，分析出最佳的藥物治療方案，以期能夠在犢牛腹瀉發病之初，短時間內控制出病情的惡化與傳播，減輕其對牛養殖產業的不良影響。

二、犢牛腹瀉大腸桿菌病原分離鑒定與藥敏試驗

1、試驗材料與方法

（1）病情分析

在青海省格爾木市的一個肉牛養殖場內，共有牛104頭，其中犢牛21頭。近半年，該養殖場內的犢牛群出現斷斷續續的腹瀉癥狀，不同日齡的犢牛其表現出的臨床癥狀具有一定的差異性，以日齡越小的犢牛發病癥狀更為嚴重。在發現犢牛感病后，養殖戶將患病犢牛單獨隔離給藥治療，使用藥劑為青霉素、鏈霉素，兩者交換使用，在初期具有較好的治療效果，但是一直未能徹底治愈。在治療期間，一旦對患病犢牛用藥停止，腹瀉病情就會反復，并且加重，犢牛單次發病周期普遍在1～2周。技術人員對腹瀉犢牛的新鮮糞便進行收集，共收集12只犢牛排泄物，并將其送至當地獸醫實驗室進行病原學、藥敏試驗研究。

（2）試驗方法

①大腸桿菌分離鑒定

分別將所收集的12頭犢牛新鮮糞便進行病原學鑒定，采取革蘭氏染色的方式對病料進行涂片染色鏡檢觀察。將所收集的犢牛新鮮糞便樣品分別采取常規瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、伊紅美藍瓊脂平板接種試驗，接種后將各種培養平板分別置于恒溫37℃的培養箱內48h，培養結束后觀察培養平板中的細菌生長情況、外觀狀態。將從犢牛糞便樣品中分離得到的疑似菌落接種至肉湯培養基中，并觀察肉湯培養基內的變化，持續18h。

②生化鑒定

將從犢牛糞便樣品中分離得到的菌株純培養物分別接種至生化鑒定管中，并將其置于恒溫37℃的培養箱內22h，持續觀察各個生化管中的變化。

③致病性試驗

選擇6只小白鼠實施致病性試驗，采取隨機分組，將其分別分為試驗組、對照組，每株有3只小白鼠。試驗組內的小白鼠單只腹腔內注射本次試驗中分離得到的菌株純培養物0.2mL；對照組小白鼠單只腹腔內注射無菌生理鹽水0.2mL，單次注射。注射后，持續觀察兩組小白鼠的生存狀態，從而分析該分離菌的致病性。

④藥敏試驗

采取紙片擴散法（K-B法），使用10種抗菌類藥物對本次試驗中所分離出的大腸桿菌執行藥敏試驗。藥敏試驗方法如下：使用實驗室滅菌接種環從肉湯培養基中挑選出幾個純培養的大腸桿菌單菌落，并將其轉移至裝有無菌生理鹽水的試管中，將菌懸液的濃度調整至0.5麥氏比濁單位。使用無菌的棉拭子蘸取菌懸液，涂抹接種至MH瓊脂表面。使用實驗室霉菌鑷子取出不同抗菌類藥劑的藥敏紙片，均勻貼放在WH瓊脂表面，并輕壓紙片，使其接觸密切。單個MH瓊脂平板上貼藥敏紙片5張，完成后將其置于37℃的恒溫箱內培養觀察18h后，取出MH瓊脂平板測量各藥敏紙片的抑菌圈直徑范圍，并判定大腸桿菌對不同抗菌藥劑的敏感情況。參與本次藥敏試驗的藥劑有阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻呋鈉、氟苯尼考、四環素、慶大霉素、阿米卡星、鏈霉素、環丙沙星、恩諾沙星，判定標準以大腸桿菌ATCC25922為準。

紙片藥物含量：阿莫西林20μg/片、氨芐西林10μg/片、頭孢噻呋鈉30μg/片、氟苯尼考30μg/片、四環素30μg/片、慶大霉素10μg/片、阿米卡星30μg/片、鏈霉素10μg/片、環丙沙星5μg/片、恩諾沙星10μg/片。

藥敏抑菌圈直徑判定標準；

阿莫西林：耐藥（R）≤13mm、中介（I）14mm～17mm、敏感（S）≥18mm

氨芐西林：耐藥（R）≤13mm、中介（I）14mm～16mm、敏感（S）≥17mm

頭孢噻呋鈉：耐藥（R）≤17mm、中介（I）18mm～20mm、敏感（S）≥21mm

氟苯尼考：耐藥（R）≤13mm、中介（I）14mm～17mm、敏感（S）≥18mm

四環素：耐藥（R）≤11mm、中介（I）12mm～14mm、敏感（S）≥15mm

慶大霉素：耐藥（R）≤12mm、中介（I）13mm～14mm、敏感（S）≥15mm

阿米卡星：耐藥（R）≤14mm、中介（I）15mm～16mm、敏感（S）≥17mm

鏈霉素：耐藥（R）≤11mm、中介（I）12mm～14mm、敏感（S）≥15mm

丙環沙星：耐藥（R）≤15mm、中介（I）16mm～20mm、敏感（S）≥21mm

恩諾沙星：耐藥（R）≤16mm、中介（I）17mm～22mm、敏感（S）≥23mm

2、結果與分析

（1）病原分離鑒定結果

對本次收集的患病犢牛新鮮糞便在常規營養瓊脂平板上培養出中等、大型、圓形、中央較高、邊緣較平整、潮濕平滑、灰色病原菌，直徑為2～3mm，顏色半透明；在血液瓊脂平板上培養出長勢良好、菌落大小中等的菌落；在麥康凱瓊脂平板上培養出大小中等、顏色粉紅致病菌，且菌落邊緣整齊，表現為水珠狀；在伊紅美藍瓊脂平板上培養出黑色、金屬光澤的菌落群。

將上述分離得到的致病菌注入至常規肉湯培養基中，觀察可見肉湯出現渾濁，且生成部分細小白色沉淀物。將培養平板內的致病菌經革蘭氏染色后鏡檢觀察，可見致病菌為中等大小的短棒狀桿菌，菌體兩端為鈍圓形，多為單獨或成對出現，無芽孢，有包膜，兩級性染色表現較為顯著。觀察該病原分離鑒定結果，各臨床特征符合大腸桿菌典型菌落特征，因此可判定該養殖場犢牛腹瀉致病菌為大腸桿菌。

（2）生化鑒定結果

在本次試驗中，共分離得到大腸桿菌不同菌株15株，通過生物化學鑒定結果表明，在本次試驗中所提取出的大腸桿菌能夠實現對葡萄糖、麥芽糖及乳糖的發酵，且在發酵的過程中，會產生酸及氣體。在此15株大腸桿菌菌株中，部分不會對蔗糖進行發酵，且分離獲取的大腸桿菌菌株也不會生成硫化氫、分解尿素、利用檸檬酸鹽。在對大腸桿菌菌株實施硝酸還原試驗期間，可見其硝酸還原試驗結果為陽性，吲哚、甲基紅陽性，VP試驗陰性。分析以上本次試驗的生物化學鑒別結果，可以判定該犢牛腹瀉病例中分離出的菌株為大腸桿菌。

（3）動物致病性試驗

將本次試驗分離獲取的菌株培養物接種至試驗組小白鼠的體內，發現試驗組的小白鼠均在完成接種后的24h內出現死亡，而對照組內的3只接種生理鹽水的小白鼠并未出現死亡。試驗組小白鼠在死亡前，臨床表現為精神狀態沉郁、毛發凌亂無光澤、尾部和腹部發紺、取食廢絕、四肢僵硬，最終致死。對試驗組致死小白鼠尸體進行剖檢觀察，可見此3只試驗組小白鼠的肺臟組織有顯著病變，分布多個出血點；肝臟、脾臟均有不同程度炎癥表現，并且在病變位置有多個點狀出血點，特別是小白鼠的肝周炎癥表現，極為顯著。采集小白鼠的病灶樣品實施革蘭氏染色鏡檢觀察，可以發現有中等大小革蘭氏染色陰性的短棒桿菌。對比從試驗組死亡小白鼠體內臟器組織上分離得到的病原特征，與患病犢牛糞便樣品中分離得到的病原基本一致，因此，可以判定從患病犢牛糞便樣品內分離得到的大腸桿菌具有致病性。

（4）藥敏試驗結果分析

觀察表1本次試驗中大腸桿菌的藥敏試驗結果數據，可以發現，15個大腸桿菌菌株中，對恩諾沙星敏感株數最多，為13株，敏感率為87%；其次為頭孢噻呋鈉，敏感菌株數為12株，敏感率為80%；再次分別為氟苯尼考、環丙沙星，敏感菌株數均為10株，敏感率同為67%。對比耐藥率，以阿莫西林、四環素、鏈霉素，耐藥菌株數同為10株，耐藥率為67%。

三、討論分析

1、治療措施

從本次犢牛腹瀉大腸桿菌的分離鑒定與藥敏試驗研究結果可以發現，本次調查共在12頭腹瀉犢牛糞便中篩選出致病大腸桿菌15株，不同大腸桿菌菌株血清學有一定的差異性。且隨著該株型存在時間的延長，部分菌株會對養殖場日常所使用的抗菌藥物產生抗性，影響抗菌藥物使用的治療與控制效果。例如，在該養殖場內，養殖戶在犢牛腹瀉后，長期使用鏈霉素、青霉素進行交替用藥控制犢牛腹瀉。而在本次藥敏試驗中，大腸桿菌菌株對鏈霉素表現出敏感率為0%、耐藥率為67%，證實持續使用該藥劑對該養殖場內犢牛腹瀉已經無較好治療效果。

因此，當犢牛出現腹瀉病癥后，在實施臨床藥物治療前，為保障治療效果，應當先對致病原實施血清學鑒定，并開展相關的藥敏試驗，選擇高敏感性藥物進行針對性治療。除此之外，在使用藥物治療前，應當注重輪換交替用藥，不可長期使用同一種抗菌藥劑持續給藥治療，同時切忌三種以上的抗菌藥劑聯合使用。在確定該犢牛腹瀉是由大腸桿菌感染后引發的病癥后，可結合藥敏試驗結果，選擇適宜的藥劑對該養殖場內的患病犢牛群體進行治療給藥。結合本次藥敏試驗的結果，可以發現以頭孢噻呋鈉及恩諾沙星藥敏率最高，因此在治療時，可采取該兩種藥劑的輪換交替使用。采取肌注治療，頭孢噻呋鈉使用量為0.1mL/kg·bw、恩諾沙星使用量為0.2mL/kg·bw，每天給藥2次，連續使用3d即可。在使用抗菌藥物治療犢牛腹瀉的同時，可使用復方黃芪多糖注射液進行輔助治療，以提升犢牛的抗病性，依照0.1mL/kg·bw進行肌注治療，每天給藥1次，連續使用5d。對于感病嚴重，出現酸中毒的犢牛群體，可使用5%葡萄糖生理鹽水注射液500mL、12.5%維生素C 10mL、5%碳酸氫鈉注射液100mL靜脈注射治療，每天使用1次，連續使用3d具有顯著療效。

在采取此藥方治療管理7d左右，患病犢牛基本恢復正常生長。對于部分治療痊愈后，生長發育停滯、增肥率差的犢牛，采取淘汰處理，避免影響整體養殖效果。

2、預防管理措施

在基層牛養殖場內，由于養殖戶自身對疫病的認識與防范力度不強，不重視牛群健康管理，使得犢牛腹瀉的發病率增加。同時，養殖戶在發現犢牛出現腹瀉后，長期使用單一藥劑治療，促使致病原的耐藥性提升，從而增加了大腸桿菌的侵染與繁殖，為該病的傳播與蔓延打造了適宜的環境條件。因此，養殖戶在開展牛群養殖期間，為避免致病原對牛群健康影響，應當加強實驗室病原分離鑒定與藥敏試驗管理意識，做到早發現、早治療，減少該病對養殖經濟造成的不良影響。

除此之外，在犢牛養殖期間，為避免犢牛腹瀉的發生與危害，養殖戶還應當加強對犢牛的日常護理管理。日常加強對犢牛活動區域的衛生消毒，確保犢牛生活環境的潔凈、衛生性。母牛在分娩期間，做好軀體、乳頭、外陰等部位的全面消毒，可使用1%新潔爾滅溶液。犢牛在出生后及時斷臍、取食充足初乳，提升免疫力水平。斷奶犢牛喂養期間，注重飼料、飼草的潔凈性，切勿喂養變質、被病菌污染的飼草、飼料，減少感病概率。同時，加強對牛舍溫濕度的調控，將其控制在犢牛適宜的環境水平，加強通風，減少牛舍內的有毒氣體含量。及時清理牛舍內犢牛排泄物、污染物，沖洗地面，牛舍保持干燥、潔凈，減少牛舍內致病原基數。只有確保犢牛日常養護的科學性，提升犢牛機體抗病性、免疫能力，才能夠保障犢牛腹瀉的發生率及發生嚴重程度降低，維護犢牛良好生產性能。

綜上所述，犢牛腹瀉疾病在牛養殖期間屬于一種較為常見的疾病，犢牛患病后表現出臨床病癥時間長、藥物應用治療效果較差的特征。犢牛在長期腹瀉后，會出現體液的流失、酸中毒、體內電解質紊亂，嚴重造成犢牛死亡，影響牛養殖經濟效益。并且，犢牛腹瀉疾病具有傳染性，一旦發病，將會蔓延感染其他健康犢牛，影響重大。為有效防控該疾病，養殖戶應當加強對于犢牛群體的日常管理，確保犢牛生活環境適宜性。除此之外，當犢牛出現腹瀉且難以治愈時，養殖戶應當通過獸醫實驗室的病原分離鑒定及藥敏試驗研究，選擇對大腸桿菌致病菌株高敏感類的藥物，科學合理用藥，提升治療效果，降低菌株對藥劑的抗性，將犢牛腹瀉的發生與危害降至最低，保障犢牛養殖健康與經濟效益。

（作者單位：816000青海省格爾木市唐古拉山鎮獸醫站）