姜黃素通過調(diào)節(jié)SIRT3/FOXO3a 通路改善糖尿病心肌病的機(jī)制研究

李 星，鐘 毅，陳 雪

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川 瀘州 646000）

糖尿病患病率是全球增長最快的疾病之一［1］，糖尿病相關(guān)的心血管并發(fā)癥是其高死亡率的重要原 因，糖 尿 病 心 肌 病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病心血管并發(fā)癥中的一種獨(dú)立疾病，以心肌纖維化、心臟舒張功能障礙、心室重塑為特點(diǎn)［2］。在過去的幾十年中，糖尿病性心肌病相關(guān)研究呈指數(shù)級增長，但其發(fā)病機(jī)制仍不清楚。

氧化應(yīng)激是糖尿病心肌病的重要發(fā)病機(jī)制之一，高 血 糖 和 糖 化 終 產(chǎn) 物（advanced glycation end products，AGE）會刺激細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species， ROS）的產(chǎn)生，增強(qiáng)氧化應(yīng)激，因此抑制氧化應(yīng)激是預(yù)防和治療DCM 的重要策略［3］。SIRT3（silence information regulator 3， SIRT3）屬于sirtuins 家族，是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide， NAD+）依賴性蛋白質(zhì)去乙酰酶［4］。心肌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)SIRT3 通過去乙酰化并激活叉頭轉(zhuǎn)錄因子O3a（forkhead box O3a-dependent，F(xiàn)OXO3a），減少ROS 的生成，抑制氧化應(yīng)激［5］。姜黃素作為一種多作用靶點(diǎn)的酚類化合物，擁有良好的抗炎及抗氧化應(yīng)激作用，可改善糖尿病心肌病變［6］。目前對于姜黃素在糖尿病心肌病的保護(hù)作用與SIRT3/FOXO3a 信號通路之間的關(guān)系尚不明確。基于此，本研究通過糖尿病心肌病小鼠動物模型，探究姜黃素對糖尿病心肌病小鼠保護(hù)作用及SIRT3/FOXO3a 信號通路的影響，為姜黃素臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

20 只健康雄性C57 BL/6 小鼠，SPF 級，6～8 周齡，約18 g/只，均購于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，SCXK（川）2018-17，飼養(yǎng)條件符合實(shí)驗(yàn)動物管理與使用指南，所有操作遵循西南醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范，實(shí)驗(yàn)期間小鼠可自由取食和飲水，本次實(shí)驗(yàn)已通過西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理審理（批準(zhǔn)文號：swmu2023022），姜黃素購于上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)公司（458-37-7|M17074-100G），小鼠普通飼料購于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，高糖高脂飼料購于小黍有泰（北京）生物科技有限公司（XSYT-ED-074），鏈脲佐菌素（sreptozocin，STZ）購于北京索萊寶科技有限公司（S8050-100mg），tunel試劑盒購自武漢塞維爾公司（G1504）丙二醛（MDA）測定試劑盒（A003-1）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX ）測試盒（A005-1）超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（A001-3）、活性氧（ROS）測定試劑盒（E004-1）購自南京建成，BAX 抗體（#2772）、SIRT3 抗體（#5490）購自美國CST 公司，F(xiàn)OXO3a抗體購自武漢三鷹生物科技公司；Bcl-2 抗體（ab196495）購自英國Abcam，Cleaved caspase-3 抗體購自美國Affinity Biosciences 公司；cDNA 合成試劑 盒（EQ031）、PCR 反 應(yīng) 試 劑 盒（EQ001）購 自ELK Biotechnology。

1.2 方法

1.2.1 動物造模及分組 20 只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)取15 只小鼠為造模組，予以高糖高脂飲食，再隨機(jī)取5 只小鼠為空白組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；一個(gè)月后將造模組小鼠連續(xù)5 d，禁食不禁水12 h 后腹腔注射STZ 溶液（60 mg/kg），分別于造模結(jié)束后第7 日，第10 日，第14 日測量尾靜脈隨機(jī)血糖，均高于16.7 mmol/L，出現(xiàn)多飲、多食、多尿、體重下降為造模成功。空白組同樣禁食不禁飲后腹腔注射等容量的生理鹽水；造模組小鼠隨機(jī)等量分為糖尿病DCM 組、低劑量姜黃素組（LC組），高劑量姜黃素組（HC 組），姜黃素高、低劑量組分別灌胃姜黃素溶液（將姜黃素按照200 mg/kg，100 mg/kg 兩種劑量與生理鹽水分別配伍成 1mL溶液）。連續(xù)灌胃12 周，每天一次；DCM 組灌胃等量生理鹽水。

1.2.2 蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin，HE）小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，處死，生理鹽水灌流后取心臟，取適量小鼠心肌組織，固定包埋后制成厚度約為4 μm 的切片，行常規(guī) HE 染色；蘇木精染液使細(xì)胞核著藍(lán)紫色；伊紅使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。

1.2.3 蛋白印跡（Western-blot，WB） 用RIPA 總蛋白裂解液將研磨后的組織塊中總蛋白提取后，用BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定上清液中蛋白濃度，每組按20 μg 蛋白溶液體積上樣，SDS-PAGE 電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜，將轉(zhuǎn)好的膜加入封閉液室溫封閉1 h，加入BAX 抗體（1∶2 000）、SIRT3（1∶2 000）、FOXO3a（1∶500）、Bcl-2（1∶1 000）、Cleaved caspase-3 抗 體（1∶500），4 ℃孵 育 過 夜，TBST 洗滌3 次，加入二抗，于室溫孵育30 min；孵育后洗膜、曝光、顯影。AlphaEaseFC 軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.2.4 熒光定量PCR 從小鼠心肌組織中提取總RNA，并合成cDNA。PCR 反應(yīng)程序如下：在 95 ℃預(yù)變性30 s 激活酶后，進(jìn)行40 次PCR 循環(huán)（95 ℃條件下變性 10 s，58 ℃條件下退火30 s，72 ℃條件下延伸30 s），各引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.2.5 TUNEL 染色 根據(jù)TUNEL 試劑盒說明書的步驟將將小鼠心臟組織的石蠟切片進(jìn)行染色及片，檢測各組小鼠心臟的組織切片中的細(xì)胞凋亡情況；顯微鏡下以隨機(jī)5 個(gè)視野中陽性細(xì)胞百分率計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 心臟超聲檢測 用吸入乙醚麻醉小鼠，前胸脫毛后固定在操作臺上，超聲心動儀檢測小鼠心功能，記錄超聲心動圖參數(shù)：左心室舒張階段末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），舒張期左室后壁厚度（LVPWd），每個(gè)測量值，取3 個(gè)心動周期的測量平均值。

1.2.7 心肌組織中GSH-PX 、SOD 活力及MDA 含量檢測 取心肌組織塊，漂洗、剪碎后，研磨為組織勻漿后，分別按照試劑盒要求檢測GSH-PX、SOD活力及MDA 含量。

1.2.8 心肌組織ROS 水平檢測 將心肌組織放入PBS 溶液中漂洗、剪碎、再次漂洗，加入酶消化液中消化后過濾、離心，取沉淀再次PBS 洗2 次后按照試劑盒要求，利用DCFH-DA 檢測細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。經(jīng)檢驗(yàn)，所有計(jì)量資料符合正態(tài)分布，用（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析比較，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組的心臟結(jié)構(gòu)及功能指標(biāo)

將各組小鼠干預(yù)12 周后，將小鼠麻醉后行心臟彩超檢測其心臟結(jié)構(gòu)情況及功能指標(biāo)如表2 所示：與Con 組相比，DCM 組舒張期左室后壁厚度（LVPMd）、舒 張 期 左 室 容 積（LVIDd）明 顯 增 大（P＜0.05），射血分?jǐn)?shù)（EF）明顯減小（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而姜黃素組與模型組相比LVPMd、EF、LVIDd 均明顯改善（P＜0.05），且HC 組較LC組改善更明顯（P＜0.05）。

表2 各組小鼠心臟彩超數(shù)據(jù)（n=5，±s）Tab 2 Cardiac ultrasound data of mice in each group（n=5，±s）

表2 各組小鼠心臟彩超數(shù)據(jù)（n=5，±s）Tab 2 Cardiac ultrasound data of mice in each group（n=5，±s）

注：與Con 組比較,aP＜0.05；與DCM 組比較；bP＜0.05；與LD組相比，cP＜0.05。

LVIDd（mm）3.72±0.20 3.55±0.06a 3.53±0.15b 3.81±1.43c 12.306組別Con 組DCM 組LC 組HC 組F LVPMd（mm）0.58±0.04 0.75±0.02a 0.66±0.04b 0.65±0.08c 11.818 EF（%）65.67±1.52 57.7±3.9a 63.11±1.34b 64.58±1.13c 4.548

2.2 各組TUNEL 染色細(xì)胞凋亡情況

如圖一及表3所示，Con組中僅有少量細(xì)胞凋亡，與Con組相比，而DCM 組小鼠心肌細(xì)胞凋亡明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而與DCM 組相比，LC組、HC組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組小鼠心肌細(xì)胞TUNEL 染色細(xì)胞凋亡情況（n=3，±s）Tab 3 Apoptosis of TUNEL-stained mice cardiomyocytes in each group（n=3，±s）

表3 各組小鼠心肌細(xì)胞TUNEL 染色細(xì)胞凋亡情況（n=3，±s）Tab 3 Apoptosis of TUNEL-stained mice cardiomyocytes in each group（n=3，±s）

注：與Con 組比較,aP＜0.05；與DCM 組比較，bP＜0.05；與LD組相比，cP＜0.05。

細(xì)胞凋亡率（%）1.13±0.19 73.42±12.8a 47.7±8.87b 27.26±5.35c 41.62組別Con 組DCM 組LC 組HC 組F

2.3 各組心肌組織病理形態(tài)表現(xiàn)

如圖2 所示，光鏡下觀察小鼠心肌，相較于Con組，DCM 組心肌細(xì)胞間質(zhì)水腫，細(xì)胞核排列紊亂，心肌纖維斷裂明顯，可見核固縮，而LC 組及HC 組相較于DCM 組，心肌病理變化有所改善。

圖1 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況（×400）Fig 1 Apoptosis of cardiomyocytes in mice of four groups（×400）

2.4 各組的氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平

如圖3 所示，與空白組相比，模型組中的GSHpx、SOD 活力降低，MDA 含量及ROS 水平升高（P＜0.05）：與模型組相比，LC 組、HC 組中的GSHpx、SOD 活 力 顯 著 升 高，MDA 含 量 及ROS 水 平 顯著降低，且具有劑量相關(guān)性（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平Fig 3 Levels of oxidative stress markers in cardiomyocytes of mice in the each group

2.5 各 組 的SIRT3、FOXO3a、Bcl2、Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)情況

如圖4 所示，與空白組相比，模型組SIRT3、FOXO3a、Bcl2 蛋白表達(dá)減少，Bax、Cleaved caspase-3 的表達(dá)增加（P＜0.05）；與模型組相比，LC 組和HC 組 的SIRT3、FOXO3a、Bcl2 的 表 達(dá) 增 加，Bax、Cleaved caspase-3 表達(dá)減少，且具有劑量相關(guān)性（P＜0.05）。

圖4 各組小鼠心肌細(xì)胞中SIRT3、FOXO3a、Bcl2、Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)情況Fig 4 Expression of SIRT3， FOXO3a， Bcl2， Bax， and Cleaved caspase-3 protein in cardiomyocytes of mice in each group

2.6 各 組 的SIRT3、FOXO3a 基 因mRNA 表 達(dá)情況

如圖5 所示，與空白組相比，模型組小鼠心肌中的SIRT3、FOXO3a的表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，LC 組、HC 組小 鼠 心 肌 的SIRT3、FOXO3a的 表 達(dá) 增 加（P＜0.05），且隨姜黃素劑量增加，SIRT3、FOXO3a表達(dá)逐漸增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 各組小鼠心肌細(xì)胞中SIRT3、FOXO3a 基因mRNA 表達(dá)情況Fig 5 Expression of mRNA in SIRT3 and FOXO3a genes in cardiomyocytes of mice in each group

3 討論

糖尿病是威脅人類健康與生命最常見的疾病之一，且發(fā)病率逐年增加［7］。糖尿病心肌病是糖尿病的心血管并發(fā)癥中的一種獨(dú)立疾病，氧化應(yīng)激反應(yīng)是糖尿病心肌病發(fā)病的重要機(jī)制之一。高糖高脂環(huán)境下，過量的ROS 產(chǎn)生會導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)、心臟肥大和纖維化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡和心功 能障礙［8］。SIRT3/FOXO3a 通路是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的重要通路［9］，SIRT3/FOXO3a 通路可通過抑制NADPH 氧化酶、減少ROS 的過量產(chǎn)生、改善線粒體功能，抑制氧化應(yīng)激［10］。在本次研究中，我們使用高糖高脂飲食結(jié)合STZ 干預(yù)的方式建立糖尿病心肌病模型，通過予以小鼠高、低兩種姜黃素劑量的干預(yù)方式，去評估姜黃素對于糖尿病心肌病小鼠的心肌結(jié)構(gòu)與功能、凋亡、氧化應(yīng)激及SIRT3/FOXO3a 通路的影響，并探討可能的作用機(jī)制。

姜黃素是作為一種古老的傳統(tǒng)藥物，因其良好的抗凋亡、抗氧化應(yīng)激、抗衰老、副作用小等特質(zhì)被研究人員廣泛關(guān)注。大量研究表明姜黃素對DCM心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用［11］。在本次研究中，DCM組小鼠心臟彩超結(jié)果：LVPMd、LVIDd 明顯增大，EF 值明顯降低，提示模型組小鼠出現(xiàn)心肌收縮與舒張功能減退，心肌肥厚。HE 染色提示：DCM 中小鼠的心肌纖維排列紊亂、疏松，心肌細(xì)胞肥大，病理結(jié)果符合DCM 病理改變。而經(jīng)姜黃素高、低劑量組處理后心臟結(jié)構(gòu)與功能，心肌損傷情況均有明顯改善。TUNEL 染色結(jié)果也提示，姜黃素可有效減少DCM 小鼠心肌細(xì)胞的凋亡。這與Ren 等［12］的研究結(jié)果一致。

SIRT3 是一種NAD+依賴性去乙酰化酶，主要在線粒體中表達(dá)，研究表明，SIRT3 表達(dá)增加可能與人類長壽相關(guān)［13］。SIRT3 基因敲除的小鼠心肌細(xì)胞的線粒體中ATP 合成減少并出現(xiàn)心肌肥厚、纖維化及收縮功能減退［14］，另外，既往已有大量研究表明SIRT3 可抑制氧化應(yīng)激，減輕炎癥反應(yīng) ，保護(hù)心肌細(xì)胞，減輕心肌肥厚，改善心力衰竭［15-17］。Wang 等［18］的 研 究 中CD38 基 因 敲 除 的 小 鼠 可 通 過激活SIRT3/FOXO3 介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激途徑，保護(hù)心臟免受高脂飲食誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。另外，也有研究表明脂肪因子Omentin1 可上調(diào)SIRT3/FOXO3a信號通路，激活線粒體自噬，從而改善心肌梗死誘導(dǎo)的心力衰竭和心肌損傷［19］。因此，本研究對姜黃素的DCM 小鼠心肌保護(hù)機(jī)制與SIRT3/FOXO3 信號通路是否有關(guān)進(jìn)行探討，本次研究表明：在DCM小鼠心肌組織中，SIRT3、FOXO3a基因表達(dá)情況明顯降低，凋亡相關(guān)蛋白：Bax、Cleaved caspase-3 表達(dá)增多，SIRT3、FOXO3a、Bcl2 蛋白表達(dá)減少，GSHpx、SOD 活力降低，MDA 含量及ROS 水平升高，提示糖尿病心肌病小鼠SIRT3/FOXO3a 通路表達(dá)受抑，心肌細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞凋亡。既往已有研究表明SIRT3/FOXO3a 信號通路受抑可能在糖尿病心肌病的發(fā)展中起重要作用［20］。而經(jīng)姜黃素干預(yù)后可逆轉(zhuǎn)上述指標(biāo)，增加SIRT3、FOXO3a的表達(dá)，提高GSH-px、SOD 水平，降低MDA 含量及ROS 水平，抑制氧化應(yīng)激，保護(hù)心肌細(xì)胞，且呈劑量相關(guān)性。由此可見，姜黃素的心肌保護(hù)作用可能與提高SIRT3/FOXO3a 通路表達(dá)，從而抑制氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，姜黃素可有效減輕DCM 小鼠的心肌肥厚，改善心臟結(jié)構(gòu)及功能，減少心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與激活SIRT3/FOXO3a 通路，抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激有關(guān)。

作者貢獻(xiàn)度說明：

李星：參與課題設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)、相關(guān)指標(biāo)檢測及論文寫作；鐘毅：參與課題設(shè)計(jì)及文章審校；陳雪：參與文章修改。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。