埃索美拉唑聯合EGFR 抑制劑AG1478 對胃癌細胞增殖、凋亡和自噬的影響

孫滿滿，趙 涵，巴 楠，袁 源，李 文，李飛艷，張自森

（1.鄭州大學第五附屬醫院放射治療科，河南 鄭州 450052；2.鄭州大學第二附屬醫院重癥醫學科，河南 鄭州 450052；3.鄭州大學第五附屬醫院腫瘤內科，河南 鄭州 450052）

胃癌是常見的癌癥之一，在全球范圍內發病率居第五位，死亡率居第四位［1］。化療是晚期胃癌的主要手段，然而，胃癌化療進展有限，難以在提高生存方面取得進一步突破［2］。胃癌靶向治療近年來取得積極進展，曲妥珠單抗聯合化療成為HER-2 陽性胃癌標準用藥方案［3］。由于曲妥珠單抗在應用中的耐藥性，以及大多數胃癌為HER-2 陰性表達，胃癌個體化治療迫切需要探索新的策略。

EGFR 表達與胃癌發生及預后密切相關，EGFR 過表達胃癌的個體化治療已開始受到臨床關注和探索［4］。EGFR 介導的細胞凋亡與自噬是潛在的抗癌靶點［5］，共靶向EGFR 和自噬可抑制卵巢癌細胞生長［6］。AG1478 是一種具有抗癌活性的EGFR酪氨酸激酶抑制劑，聯合多種藥物均顯示出協同效應［7，8］。埃索美拉唑在多種惡性腫瘤細胞中呈現細胞毒性，影響細胞增殖、遷移、凋亡、自噬、藥物敏感性和逆轉耐藥［9］。本課題組近期研究發現，埃索美拉唑通過PI3K/AKT/FOXO3a 信號通路下調EGFR 表達抑制胃癌細胞增殖、侵襲、遷移，誘導細胞自噬與凋亡［10］。這表明EGFR 是埃索美拉唑調控靶點之一，這也為探索EGFR 高表達胃癌個體化治療策略提供了基礎和有益方向。

本研究發現埃索美拉唑和EGFR 抑制劑AG1478 抑制了胃癌細胞增殖、遷移，誘導了凋亡及自噬，兩者聯合具有協同作用，這可能與下調EGFR表達和抑制AKT 信號機制有關。埃索美拉唑和EGFR 抑制劑聯合可能代表了EGFR 高表達胃癌個體化應用的潛在策略。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑設備

人胃癌AGS 和SGC-7901 細胞株均購自中科院上海細胞庫。抗EGFR（ab52894）抗體購自英國abcam 公司、抗P-AKT（T40068）抗體購自上海艾比瑪特有限公司，抗AKT（#4685）、LC3B（#3868）、PI3K（#3011）抗體購自美國Cell Signaling Technology 公 司， cleaved-PARP（13371-1-AP）、P53（10442-1-AP） 抗 體 和 羊 抗 兔 HRP 抗 體（SA00001-2）購自武漢三鷹技術有限公司。埃索美拉唑（esomeprazole，ESO）購自阿斯利康制藥有限公司，AG1478 購自美國MedChemExpress 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 AGS 細胞采用F12K 完全培養基培養，SGC-7901 細胞采用1640 完全培養基培養，將細胞置于37℃、5%CO2的培養箱中進行培養，1 d～2 d 換液，當細胞密度長至80%～90%時進行傳代。

1.2.2 細胞活力檢測 將細胞以5 000 個/孔的密度接種于96 孔板中，用不同濃度的ESO 和AG1478處理，分別培養細胞6、12、24、48 h 后，加入CCK-8試劑，繼續培養2 h 后，用酶標儀檢測細胞在450 nm波長處的吸光度（OD）值。

1.2.3 EdU 法檢測細胞增殖 取對數生長期細胞（5×104個/mL）接 種 于35 mm 培 養 皿 中，分 別 用ESO、AG1478、埃索美拉唑與AG1478 聯合處理細胞24 h 后，固定、洗滌、促透和染色，在共聚焦顯微鏡下拍照。

1.2.4 細胞免疫熒光法 用ESO 和AG1478 分別及聯合處理在35 mm 培養皿中生長的細胞24 h。脫 水固 定30 min，PBS 清 洗3 次，BSA 室溫 封 閉60 min 后，加入一抗置于4 ℃冰箱過夜，PBS 洗滌，加入二抗孵育1 h。加入DAPI，室溫避光孵育10 min，PBS 浸洗2 次后置于共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.5 細胞遷移實驗 將細胞以每孔4×104個細胞接種于Transwell 小室的上室，加入不含胎牛血清、含不同藥物的200 μL 培養液，在下室中加入600 μL完全培養液，置于培養箱中繼續培養24 h，多聚甲醛室溫固定20 min，結晶紫染色15 min，于倒置顯微鏡下拍照，計算每個視野的細胞數。

1.2.6 細胞凋亡實驗 將5 ×104個細胞接種于60 mm 培養皿中，細胞貼壁后，用ESO 和AG1478 分別及聯合作用于胃癌細胞，24 h 后將各組細胞收集于離心管中，在每管中加入400 μL Binding Buffer、5 μL AnnexinV-FITC，常溫避光孵育15 min。上機檢測前5 min，避光加入5 μL PI，用流式細胞儀檢測并記錄。

1.2.7 細胞劃痕實驗 將細胞以5×104/mL 的濃度接種于六孔板中，置于培養箱中過夜。用10 μL 滅菌槍頭沿直尺標記每個孔的中心，并在顯微鏡下拍攝劃痕處多個點的照片，記錄面積S1。用ESO 和AG1478 分別及聯合處理細胞24 h 后，取與0 h 相同的固定點，再次拍照，記錄面積S2。劃痕寬度用image pro Plus6.0 軟件測量，劃痕愈合率=（S1-S2）/S1×100%。

1.2.8 Western blot 法檢測目的蛋白 在根據實驗條件用不同藥物處理細胞24 h 后，提取各組細胞蛋白。制備SDS-PAGE 凝膠，加入蛋白樣品，進行電泳和轉膜。將轉好的PVDF 膜封閉1 h 后，用一抗在4 ℃冰箱中孵育過夜，二抗在室溫下孵育1 h，最后用ECL 化學發光試劑盒顯影整張膜，用Chemi Capture 軟件導出實驗條帶圖像，用ImageJ 軟件分析目標條帶的灰度值。

1.3 統計學方法

所有實驗重復3 次，結果用SPSS21.0 統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩種細胞24 h 和48 h 的IC50對比采用兩獨立樣本t檢驗；兩種細胞4 組的遷移率、劃痕愈合率、增殖率、凋亡率、自噬情況及各組蛋白表達水平均采用2×2 析因設計的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 ESO 和AG1478 對胃癌細胞活力及AG1478對EGFR 蛋白表達的影響

結 果 見 圖1、2 及 表1。ESO 和AG1478 以 濃 度和時間依賴的方式抑制胃癌細胞AGS 和SGC-7901細胞的活力（圖1A、B 及圖2A）。Western blotting結果（圖2B）顯示，隨著AG1478 濃度的升高，AGS和SGC-7901 細胞的EGFR 蛋白表達均降低，表明AG1478 能 夠 降 低EGFR 表 達。

表1 AG1478和ESO作用于細胞24 h與48 hIC50的比較（n=3）Tab 1 Comparison of 24 h versus 48 h IC50 of AG1478 and ESO action on cells（n=3）

圖1 ESO 對胃癌細胞活力的影響Fig 1 Effect of ESO on the viability of gastric cancer cells

圖2 AG1478 對胃癌細胞活力和EGFR 蛋白表達的影響Fig 2 Effect of AG1478 on cell viability and EGFR protein expression in gastric cancer cells

2.2 ESO 聯合AG1478 對胃癌細胞增殖的影響

根據表1 可知AG1478 和ESO 單獨作用胃癌細胞24 h 和48 h 后 的IC50值，分 別 采 用 濃 度 為10 μmol/L（AGS 細胞）和20 μmol/L（SGC-7901 細胞）的AG1478 與80 mg/L 的ESO 單獨及聯合處理胃癌細胞24 h（后續實驗也采用此藥物濃度）。ESO和AG1478 均能降低胃癌AGS 和SGC-7091 細胞的增殖率，且兩者聯合具有協同作用（P＜0.05），見表2；ESO 及AG1478 均能降低AGS 細胞和SGC-7901細胞中C-myc 和EGFR 蛋白的表達，且兩者聯合對下調C-myc 蛋白的表達具有協同作用（P＜0.05），見圖3、表3。

表2 各組細胞增殖率的比較（n=3）Tab 2 Comparison of cell proliferation rate in each group（n=3）

圖3 不同組別兩種細胞中EGFR 和C-myc 蛋白的表達Fig 3 Expression of EGFR and C-myc proteins in different groups of both cells

2.3 ESO 聯合AG1478 對胃癌細胞遷移的影響

結果見圖4 及表4。不難發現ESO 和AG1478能夠抑制胃癌AGS 和SGC-7901 細胞的遷移，兩者聯合效果具有協同作用（P＜0.05）。

表4 各組細胞遷移細胞數及劃痕愈合率的比較（n=3）Tab 4 Comparison of the number of migrating cells and the rate of scratch healing in each group（n=3）

圖4 ESO 聯合AG1478 對胃癌細胞遷移的影響Fig 4 Effect of ESO combined with AG1478 on migration of gastric cancer cells

2.4 ESO 聯合AG1478 對胃癌細胞凋亡的影響

ESO 和AG1478 都能促進AGS 和SGC-7901細胞的凋亡，兩者聯合對胃癌細胞凋亡具有協同作用（P＜0.05），見圖5 及表5。同時Western blot 結果顯 示（表6），ESO 和AG1478 能 夠 促 進 凋 亡 蛋 白cleaved-PARP 和P53 的 表 達。

表5 各組細胞流式細胞儀檢測凋亡率的比較（n=3）Tab 5 Comparison of apoptosis rate detected by flow cytometry in each group of cells（n=3）

表6 兩種細胞各組cleaved-PARP 和P53 蛋白表達的比較（n=3）Tab 6 Comparison of cleaved-PARP and P53 protein expression in each group of the two cell types（n=3）

圖5 ESO 聯合AG1478 對胃癌細胞凋亡的影響Fig 5 Effect of ESO combined with AG1478 on apoptosis of gastric cancer cells

2.5 ESO 聯合AG1478 對胃癌細胞自噬的影響

結果見圖6 及表7。ESO 和AG1478 均能誘導胃癌AGS 和SGC-7901 細胞自噬，且在AGS 細胞中兩者聯合對LC3B 蛋白表達下調具有協同作用（P＜0.05）。

表7 各組細胞LC3B 蛋白表達量的比較（n=3）Tab 7 Comparison of LC3B protein expression in cells of each group（n=3）

圖6 ESO 聯合AG1478 對胃癌細胞自噬的影響Fig 6 Effect of ESO combined with AG1478 on autophagyin gastric cancer cells

圖7 不同組別兩種細胞中PI3K、AKT和P-AKT蛋白的表達Fig 7 Expression of PI3K、AKT and P-AKT proteins in different groups of both cells

2.6 ESO 聯 合AG1478 對PI3K/AKT 信 號 通 路 蛋白表達的影響

ESO 和AG1478 分別及聯合處理后，兩組細胞中PI3K、AKT 及P-AKT 蛋白表達量均下降，且兩者聯合對促進P-AKT 蛋白表達下降具有協同作用（P＜0.05）結果見表8、9。

表8 AGS細胞中各組PI3K、AKT和P-AKT蛋白表達量的比較（n=3）Tab 8 Comparison of PI3K、AKT and P-AKT protein expression in each group in AGS cells（n=3）

表9 SGC-7901 細胞中各組PI3K、AKT 和P-AKT 蛋白表達量的比較（n=3）Tab 9 Comparison of PI3K、AKT and P-AKT protein expression in each group in SGC-7901 cells（n=3）

3 討論

過去認為，質子泵抑制劑通過作用于H+/K+-ATP 酶改變微環境酸性發揮抗腫瘤作用［11］。近年來研究發現，PPIs 的抗癌機制具有多樣性，更像一種新型化學制劑［12］。埃索美拉唑在預防癌癥轉移、增強化療藥物抗癌效應方面均顯示了重要作用［13，14］。本研究也再次表明，埃索美拉唑抑制胃癌細胞增殖、遷移，誘導其自噬及凋亡，其機制可能與抑制PI3K/AKT 信號通路和EGFR 表達有關，與前期研究一致［10］。

EGFR 酪氨酸激酶抑制劑在EGFR 突變的肺癌治療中取得巨大成功，然而，卻不能帶來胃癌患者獲益。有研究通過對不同胃食管腺癌患者隊列的分析發現，EGFR 擴增導致攻擊性行為和不良預后，EGFR 抑制劑在EGFR 拷貝數增加的患者中是有活性的，聯合其他藥物可提升敏感性［15］。既往研究顯示，AG1478 可增強不同細胞毒性藥物的敏感性［16，17］。本研究中，AG1478 作用后，胃癌細胞的活力下降呈濃度依賴性， EGFR 蛋白的表達也隨AG1478 濃度增加而降低，并且，AG1478 聯合埃索美拉唑協同抑制胃癌細胞增殖并誘導細胞凋亡，與AG1478 在其他腫瘤細胞中的凋亡誘導作用一致［18］。

EGFR 介導的細胞自噬在腫瘤形成和治療耐藥中的重要機制，是抗腫瘤治療的潛在靶點［5，19］。本研究發現埃索美拉唑與AG1478 單獨作用于胃癌細胞時，LC3B 的表達均增加，兩者聯合協同誘導胃癌細胞自噬，這與兩者協同誘導凋亡的現象一致。自噬與凋亡存在交叉對話，機制復雜［20］，本研究中這種自噬和凋亡水平同時上調的機制和聯系尚需探索。

PI3K/AKT 信號通路是EGFR 激活細胞內下游信號級聯反應的重要途徑，在介導抗腫瘤藥物調節自噬和凋亡中發揮關鍵作用［21］。本研究中觀察到，AG1478 聯合埃索美拉唑作用時，兩種細胞內P-AKT 蛋白的表達相較于單獨使用AG1478 和埃索美拉唑時下降的更為明顯。因此推測埃索美拉唑聯合EGFR 抑制劑AG1478，可能通過協同下調EGFR 表達繼而抑制PI3K/AKT 信號通路發揮抗腫瘤效應。

綜上所述，埃索美拉唑通過抑制AKT 信號增強EGFR 抑制劑AG1478 對胃癌細胞的增殖、遷移的作用，并誘導胃癌細胞凋亡、自噬，兩藥聯合具有協同作用，可能是一種抗胃癌新策略。

作者貢獻度說明：

孫滿滿、趙涵：主要負責實驗操作、數據分析及論文撰寫；巴楠、張自森：實驗設計指導與論文修改；袁源、李文、李飛艷：協助實驗操作。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。