一株羅非魚無乳鏈球菌Streptococcus agalactiae CS2108的全基因組測序及功能分析

摘 要 無乳鏈球菌是羅非魚的主要病原菌，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。實(shí)驗(yàn)室前期從羅非魚肝臟組織中分離到1株羅非魚無乳鏈球菌，命名為Sreptococcus agalactiae CS2108。深入研究羅非魚無乳鏈球菌S. agalactiae CS2108的致病機(jī)制，為有效防治無乳鏈球菌病提供理論支撐。采用Illumina Hiseq+PacBio的測序方法獲得S. agalactiae CS2108基因組完成圖，進(jìn)一步對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因組組裝、預(yù)測與功能注釋，并在相應(yīng)數(shù)據(jù)庫預(yù)測毒力因子和耐藥基因。S. agalactiae CS2108基因組包含1條染色體和1個(gè)質(zhì)粒，染色體大小為2 189 951 bp，質(zhì)粒大小為4 440 bp；序列已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號分別為CP123969、CP123970；含有8個(gè)基因組島，2個(gè)前噬菌體和6個(gè)CRISPR-Cas序列；得到248個(gè)毒力因子和141個(gè)耐藥基因。報(bào)道這株羅非魚無乳鏈球菌的全基因組序列，分析其基因功能，為后續(xù)羅非魚無乳鏈球病的防治提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 羅非魚；無乳鏈球菌；全基因組測序；基因組功能

中圖分類號：Q789 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.05.001

羅非魚主要分布在熱帶、亞熱帶地區(qū)，對環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，生長速度快，繁殖能力強(qiáng)，并且其肉味鮮美、肉質(zhì)細(xì)嫩、食用方法簡單、營養(yǎng)豐富，深受廣大養(yǎng)殖戶的青睞[1-2]。發(fā)展羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)對于增加農(nóng)民就業(yè)機(jī)會和收入、促進(jìn)國際貿(mào)易具有十分重要的意義[3-4]。

隨著羅非魚養(yǎng)殖模式向著高密度、集約化養(yǎng)殖發(fā)展，加上養(yǎng)殖水質(zhì)、環(huán)境及氣候的惡化，漁民防控意識的欠缺，導(dǎo)致各類病害常大面積暴發(fā)[5]。其中鏈球菌病是羅非魚健康養(yǎng)殖的最大威脅，最主要的病原菌是無乳鏈球菌（Sreptococcus agalactiae）。近年來，羅非魚無乳鏈球菌病在我國廣東、廣西和海南等地時(shí)有發(fā)生，具有暴發(fā)范圍廣、死亡率高的特點(diǎn)[6]。無乳鏈球菌大多呈球形，鏈狀排列，革蘭氏染色陽性，具有莢膜和鞭毛，無芽孢，適宜在溫度28～37 ℃、pH值7.4～7.6條件下生長。在腦心浸液瓊脂固體培養(yǎng)基上呈卵圓形，菌落表面光滑。目前，利用 Lance-field 法可以將其分成 Ia、Ib、Ⅱ～Ⅸ共10個(gè)血清型[7]。該病主要病理特征為眼球突出或渾濁發(fā)白[8]，眼眶充血，腹部膨大，肛門紅腫，少食或者絕食，游姿平衡失調(diào)，解剖病魚可見膽囊腫大，膽汁稀薄，色淺，腸內(nèi)充滿淡黃色液體，肝臟增大[9-10]。組織病理學(xué)表現(xiàn)為鰓充血，腎臟受損、腫大、白細(xì)胞浸潤，肝臟顆粒變性，腸道粘膜上皮變性、壞死、脫落、固有膜上炎性白細(xì)胞浸潤，眼睛脈絡(luò)膜和眶骨膜組織炎性壞死等[11]。

目前細(xì)菌性疾病的診斷方法主要有生理生化鑒定、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)技術(shù)[12]。分子生物學(xué)診斷技術(shù)中常用的方法有PCR技術(shù)、核酸分子雜交、多位點(diǎn)序列分型、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等。王均等基于羅非魚無乳鏈球菌的cfb和16S rRNA基因序列建立了快速檢測無乳鏈球菌的雙重PCR方法[13]；樊海平等根據(jù)羅非魚無乳鏈球菌16S rRNA基因和sip基因序列用于羅非魚無乳鏈球菌病的流行病學(xué)調(diào)查[14]，這些分子生物學(xué)診斷方法都離不開無乳鏈球菌的基因組信息。

截至目前，NCBI數(shù)據(jù)庫上有1 867個(gè)無乳鏈球菌基因組信息，這些無乳鏈球菌基因組序列中人源和魚源的比較多，部分是牛源、蛙源和犬源的。前期實(shí)驗(yàn)室從患病羅非魚中分離出1株無乳鏈球菌，命名為S. agalactiae CS2108，為深入了解該羅非魚無乳鏈球菌S. agalactiae CS2108的全基因組序列，分析該菌的基因組基本特征，為后續(xù)羅非魚無乳鏈球病的防治提供理論支撐。本研究采用Illumina Hiseq+PacBio的測序方式對S. agalactiae CS2108菌株進(jìn)行全基因組測序分析，并進(jìn)行組裝和注釋、毒力基因和耐藥基因的預(yù)測，分析和預(yù)測結(jié)果將為羅非魚無乳鏈球菌的預(yù)防和防治提供理論支持。

1" 材料與方法

1.1" 菌株培養(yǎng)與基因組DNA提取

無乳鏈球菌S. agalactiae CS2108分離于患病的羅非魚肝臟組織，保存于廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院。將S. agalactiae CS2108從甘油管接種到腦心浸液培養(yǎng)基（Brian Heart Infusion， BHI）固體培養(yǎng)基平板上，在37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。挑取單菌落并接種至250 mL的BHI液體培養(yǎng)基中，在溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速200 rpm的搖床中培養(yǎng)到對數(shù)期。然后在4 ℃、12 000 rpm條件下離心10 min，收集菌體，送至上海美吉生物醫(yī)療科技有限公司進(jìn)行全基因組測序。

1.2" 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

基于S. agalactiae CS2108的16S rRNA序列，通過與NCBI數(shù)據(jù)庫對比，選擇在種屬水平上最接近的20株菌的16S rRNA序列，通過MEGA 6.0軟件選擇鄰近（Neighbor-Joining）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3" 文庫構(gòu)建與測序

基因組測序使用Nanopore PromethION和Illumina NovaSeq 6000測序平臺進(jìn)行全基因組測序。Illumina測序數(shù)據(jù)被用來評估基因組的雜合度、重復(fù)度，評估基因組大小，以及是否存在質(zhì)粒及污染，輔助后續(xù)組裝策略的選擇。同時(shí)由于三代測序具有較高的測序錯(cuò)誤率，用二代測序數(shù)據(jù)對三代數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，保證組裝結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確度。

取不少于1 μg基因組DNA，利用Covaris進(jìn)行基因組DNA片段化，將DNA樣本剪切成約400 bp的片段，瓊脂糖凝膠鑒定片段大小、分布，富集300～500 bp范圍的基因組片段，使用NEXTflex?Rapid DNA-Seq試劑盒進(jìn)行文庫制備。具體步驟如下：連接A amp; B接頭；去除接頭自連片段；瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段篩選，保留一端是A接頭、一端是B接頭的片段；氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段；橋式PCR擴(kuò)增。

制備的文庫在Illumina Novaseq 6000儀器上進(jìn)行雙端測序（2×150 bp）。具體步驟如下：加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只摻入單種堿基；用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類；將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3′端粘性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸；統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號結(jié)果，獲知模板DNA片段的序列。Nanopore測序是一種納米孔測序技術(shù)。具體步驟如下：在測序前，雙鏈DNA末端需添加2個(gè)攜帶運(yùn)動(dòng)蛋白的接頭（引導(dǎo)接頭和發(fā)夾接頭）。當(dāng)測序開始，引導(dǎo)接頭（leader adapter）將雙鏈DNA片段引導(dǎo)至納米孔附近，引導(dǎo)運(yùn)動(dòng)蛋白將雙鏈DNA解螺旋成單鏈，使第一鏈（模板鏈）穿過納米孔。在模板鏈的末端，發(fā)夾運(yùn)動(dòng)蛋白再以類似的方式介導(dǎo)互補(bǔ)鏈通過納米孔，從而保證DNA的雙鏈測序。當(dāng)DNA鏈穿過納米孔時(shí)，傳感器以恒定的頻率測量離子電流變化，根據(jù)電流變化的頻譜，應(yīng)用模式識別算法得到堿基序列。

1.4" 基因組組裝、基因預(yù)測與注釋

利用Nanopore PromethION和Illumina NovaSeq6000平臺生成的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。所有分析均在上海美吉生物云（http：//cloud.majorbio.com）上進(jìn)行。具體程序如下：Illumina測序下機(jī)的原始數(shù)據(jù)（raw data）以Fast格式儲存，為了使后續(xù)的組裝更加準(zhǔn)確，使用軟件Fast v0.23.0對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量剪切。利用Unicycler v0.4.8[15]對質(zhì)控之后的Illumina數(shù)據(jù)和Nanopore數(shù)據(jù)進(jìn)行混合組裝，最后使用Pilon v1.22將Illumina短序列mapping到組裝好的基因組上進(jìn)行矯正。

利用Prodigal v2.6.3[16]對基因組中的編碼序列（CDS）進(jìn)行預(yù)測，質(zhì)粒基因采用GeneMarkS[17]軟件預(yù)測，tRNAscan-SE v2.0[18]進(jìn)行tRNA預(yù)測，Barrnap v0.9 （https：//github.com/tseemann/barrnap） 進(jìn)行rRNA預(yù)測。利用BLASTP、Diamond、HMMER等序列比對工具，從NR、Swiss-Prot、Pfam、GO、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫中對預(yù)測到的CDS進(jìn)行功能注釋。

1.5" 毒力和耐藥基因預(yù)測

將無乳鏈球菌S. agalactiae CS2108基因組信息比對毒力因子數(shù)據(jù)庫VFDB （Version： 2016.03， http：//www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm） 獲得毒力因子基因注釋概況并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；通過耐藥基因數(shù)據(jù)庫（CARD Version 1.1.3，DOI： 10.1128/AAC.00419-13）獲得每個(gè)基因組中包含的耐藥基因的信息。

2" 結(jié)果與分析

2.1" S. agalactiae CS2108的16S rRNA進(jìn)化樹分析

基于菌株S. agalactiae CS2108 16S rRNA基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中相似菌株序列比對結(jié)果顯示無乳鏈球菌菌株CS2108和GCF_000186445.1相似度最高（見圖1）。

2.2" 基因組組裝與注釋

原始測序數(shù)據(jù)結(jié)果表明，無乳鏈球菌S. agalactiae CS2108基因組包含1條染色體和1個(gè)質(zhì)粒，染色體大小為2 189 951 bp，GC含量為35.82%；質(zhì)粒大小為4 440 bp，GC含量為37.82 %?；蚪M共編碼2 110個(gè)基因，所有編碼基因總長度為1 922 967 bp，基因平均長度911.36 bp，占整個(gè)基因組總長度的96%，含有80個(gè)tRNA、21個(gè)rRNA （5S RNA、16S RNA和23S RNA各7個(gè)）；含有8個(gè)基因島，基因島基因總長度為163 023 bp，平均每個(gè)基因島長20 377.88 bp，8個(gè)基因島共有基因179個(gè)，平均每個(gè)基因島有22.38個(gè)基因。包含2個(gè)前噬菌體，一個(gè)位于622685～672418處，序列總長度為49 734 bp，包含47個(gè)基因，另一個(gè)位于2135280～2145186處，序列總長度為9 907 bp，包含17個(gè)基因。含有11個(gè)CRISPR-Cas，共含有重復(fù)序列107個(gè)，平均重復(fù)序列長度35.67 bp（見表1）。Circos基因組圈圖可以全面展示基因組的特征，從外到內(nèi)圓圈對應(yīng)的信息依次為基因組大小標(biāo)識、正鏈、負(fù)鏈上的基因信息、ncRNA、GC含量、GC-Skew。菌株S. agalactiae CS2108的基因組圈圖見圖2A（見封三），質(zhì)粒圈見圖2B（見封三），基因組序列登錄號分別為CP123969、CP123970。

2.3" 基因組功能分析

2.3.1" GO注釋結(jié)果

菌株S. agalactiae CS2108共有1 640個(gè)基因注釋到GO功能，占基因組的77.73%，結(jié)果如圖3（見封三），其中與生物過程相關(guān)的基因有843個(gè)，與細(xì)胞組成相關(guān)的基因有807個(gè)，與分子功能相關(guān)的基因有1 369個(gè)。在生物過程中，與轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)的基因排前2位（共109個(gè)），在細(xì)胞組分中，排前2位的基因是與質(zhì)膜和細(xì)胞質(zhì)成分相關(guān)的基因（共642個(gè)）；在分子功能方面，排前2位的基因是與ATP結(jié)合、DNA結(jié)合相關(guān)的基因（共440個(gè)）。

2.3.2" COG注釋結(jié)果

菌株S. agalactiae CS2108共有1 820個(gè)基因注釋到COG功能，占基因組的86.26%，結(jié)果如圖4（見封三），其中有462個(gè)未知功能的基因，功能已知的基因有173個(gè)與復(fù)制、重組和修復(fù)相關(guān)，有157個(gè)基因與碳水化合物運(yùn)輸和代謝相關(guān)，有148個(gè)基因與翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生相關(guān)，有138個(gè)基因與氨基酸運(yùn)輸和代謝相關(guān)，有115個(gè)基因與轉(zhuǎn)錄相關(guān)。

2.3.3" KEGG注釋結(jié)果

菌株S. agalactiae CS2108共有1 213個(gè)基因注釋到功能信息，占基因組的57.49%，結(jié)果如圖5（見封三），參與細(xì)胞過程的基因有72個(gè)，參與環(huán)境信息處理的基因有197個(gè)，參與遺傳信息處理的基因有157個(gè)，參與人類疾病的基因有68個(gè)，參與代謝的基因有959個(gè)，參與生物系統(tǒng)的基因有35個(gè)。在KEGG代謝通路中代謝相關(guān)的基因最多，在代謝途徑中排前三的分別是全局圖與概覽圖、碳水化合物代謝和氨基酸代謝。

2.3.4" 毒力因子預(yù)測

將菌株S. agalactiae CS2108的基因組與毒力因子數(shù)據(jù)庫（Virulence factors database， VFDB）進(jìn)行比對，得到毒力因子基因注釋的概況，結(jié)果表明有242個(gè)毒力因子基因得到注釋，分別是68個(gè)防御性毒力因子基因（Defensive virulence factors）（圖6-A）、48個(gè)非特異性毒力因子基因（Nonspecific virulence factor）（圖6-B）、88個(gè)攻擊性毒力因子基因（Offensive virulence factors）（圖6-C）和20個(gè)毒力相關(guān)的調(diào)控基因（圖6-D）。在防御性毒力因子基因中，最多的是抗吞噬基因有30個(gè)，其次是血清抗性相關(guān)的基因22個(gè)，脅迫蛋白相關(guān)的基因11個(gè)，最少的是補(bǔ)充蛋白酶基因1個(gè)；在非特異性毒力因子中，最多的是鐵離子吸收系統(tǒng)基因有42個(gè)，胞外酶和鎂離子吸收相關(guān)基因分別有3個(gè)；在防御性毒力因子基因中，最多的是毒素相關(guān)的基因有36個(gè)，粘附相關(guān)的基因有31個(gè)，分泌系統(tǒng)和侵染相關(guān)的基因分別是14個(gè)和7個(gè)；毒力相關(guān)的調(diào)控基因有20個(gè)。由上可知，影響毒力的因素是多類基因相互協(xié)調(diào)共同作用的結(jié)果。

2.3.5" 耐藥基因預(yù)測

將菌株S. agalactiae CS2108的基因組與綜合的抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫 （Comprehensive Antibiotic Resistance Database， CARD）進(jìn)行比對，獲得基因組中包含耐藥基因的信息。由表2可見，S. agalactiae CS2108的基因組中含有耐藥基因141個(gè)，排在前五的耐藥基因是46個(gè)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素基因（Macrolide antibiotic）、29個(gè)四環(huán)素抗生素基因（Tetracycline antibiotic）、25個(gè)氟喹諾酮類抗生素基因（Fluoroquinolone antibiotic）、17個(gè)鹽酸克林霉素基因（Lincosamide antibiotic）和16個(gè)糖肽抗生素基因（Glycopeptide antibiotic）。

3" 討論與結(jié)論

分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展及大量羅非魚無乳鏈球菌基因組序列的公布， 促進(jìn)了對無乳鏈球菌基因組特征、流行病學(xué)、病原學(xué)、檢測方法和防控措施等方面的研究，為有效預(yù)防和治理提供了理論依據(jù)。

無乳鏈球菌基因組平均大小在2.05 Mb左右，S. agalactiae CS2108的基因組大小為2.19 Mb，略大于平均值。染色體基因編碼2 104個(gè)蛋白質(zhì)，小的質(zhì)粒編碼6個(gè)蛋白質(zhì)。相較于其他病原微生物的基因組和編碼的蛋白質(zhì)數(shù)量都較少，其他基因序列的功能還需要進(jìn)一步研究?；蚪M島是有橫向起源跡象的一部分基因組，每個(gè)基因組島與多種生物功能相關(guān)、與共生或病原機(jī)理相關(guān)、與生物體的適應(yīng)性相關(guān)，S. agalactiae CS2108的基因組中含有8個(gè)基因組島，包含基因數(shù)量在10～63個(gè)不等，每個(gè)基因組島含有功能相似的基因；前噬菌體序列上往往存在一些功能基因（抗生素基因、毒力基因）增強(qiáng)細(xì)菌對環(huán)境的適應(yīng)性或使細(xì)菌成為致病菌，S. agalactiae CS2108中包含2個(gè)前噬菌體，使得成為溶源菌；CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種原核生物的免疫系統(tǒng)，用來抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵，比如噬菌體病毒和外源質(zhì)粒。它可以識別出外源DNA、沉默外源基因的表達(dá)，S. agalactiae CS2108中包含6個(gè)CRISPR/Cas，在抵抗外來病毒或者DNA入侵過程中起著重要作用。

有1 820個(gè)基因注釋到COG功能注釋中，其中約25%（462個(gè)）的基因功能是未知的，這表明在無乳鏈球菌-羅非魚互作中仍有較多的新基因功能有待深入研究；其他基因中與復(fù)制、重組、修復(fù)相關(guān)的占比最高，在宿主中病原菌要面臨宿主細(xì)胞的攻擊和吞噬，所以復(fù)雜的重組和修復(fù)系統(tǒng)非常重要；其次是與碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝相關(guān)的基因，因?yàn)樘妓衔锬転椴≡峁┨荚?，保證病原菌在宿主中能夠存活下來[19]。

通過比較基因組、蛋白質(zhì)組學(xué)和組織病理學(xué)等方法來研究強(qiáng)弱毒株的毒力差異，揭示了強(qiáng)毒株在羅非魚體內(nèi)的定植和組織損傷規(guī)律[19]。影響無乳鏈球菌毒力強(qiáng)度的基因包括莢膜多糖、表面蛋白、溶血素、CAMP因子、絲氨酸蛋白酶和透明質(zhì)酸等相關(guān)基因[20-21]，但對毒力基因缺乏深入的研究，我們基因組測序中發(fā)現(xiàn)了20個(gè)與毒力相關(guān)的基因。

抗生素是防治魚類疾病的主要手段，隨著抗生素使用量的增多產(chǎn)生了越來越多的耐藥性，抗生素的耐藥性成為十分嚴(yán)峻的問題，不同的無乳鏈球菌對抗生素的敏感性不同。張新艷等從廣東分離的無乳鏈球菌的耐藥性相對較弱，對氨芐西林等28種抗生素敏感，對復(fù)方新諾明等15種抗生素不敏感[22]；霍歡歡等發(fā)現(xiàn)海南分離到的無乳鏈球菌耐藥性很強(qiáng)，大部分菌株對氨基糖苷類和喹諾酮類耐藥[23]。了解無乳鏈球菌的耐藥規(guī)律，對于指導(dǎo)合理使用抗菌藥、防止多重耐藥菌株流行和擴(kuò)散、保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全具有重要意義。

無乳鏈球菌為了適應(yīng)不同環(huán)境下宿主體內(nèi)的生活環(huán)境，會朝著不同的方向變異，同時(shí)基因組也會發(fā)生相應(yīng)的變化。環(huán)境因素在無乳鏈球菌致病過程中有促進(jìn)作用，例如高溫、高亞硝酸鹽、高氨氮、低溶解氧及pH值等[24]。無乳鏈球菌通過躲避吞噬細(xì)胞的免疫防御，部分細(xì)菌被黏附吞噬后可在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活、生長和繁殖，隨巨噬細(xì)胞在體內(nèi)游走、侵染其他組織，還可透過血-腦屏障侵入腦組織，導(dǎo)致羅非魚呈現(xiàn)典型的臨床癥狀和組織病理學(xué)變化[25]。

病原、宿主與環(huán)境之間的平衡關(guān)系決定疾病發(fā)生與否，了解鏈球菌感染與傳播途徑，可以更深入地認(rèn)識羅非魚、鏈球菌和環(huán)境之間的關(guān)系[12]。羅非魚攝食了攜帶無乳鏈球菌的食物進(jìn)入胃腸組織后，以單個(gè)個(gè)體、成組或成鏈的形式附著在腸細(xì)胞的頂端邊緣，穿越上皮細(xì)胞，在胃腸道黏膜上富集和增殖，然后隨體液循環(huán)進(jìn)入各組織內(nèi)，最后突破血腦屏障，進(jìn)入腦部，導(dǎo)致腦膜炎，破壞羅非魚的腦神經(jīng)，進(jìn)而出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈圈的現(xiàn)象[25]。在實(shí)際的養(yǎng)殖環(huán)境下，高濃度的菌液環(huán)境難以實(shí)現(xiàn)，鏈球菌通過口腔進(jìn)入羅非魚的胃和腸道，可能是自然條件下感染羅非魚的主要傳播途徑。對S. agalactiae CS2108菌株進(jìn)行全基因組測序分析，將為羅非魚無乳鏈球菌的預(yù)防和防治提供理論支持。

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（責(zé)任編輯：易" 婧）

收稿日期：2023-09-03

基金項(xiàng)目：柳州市科學(xué)技術(shù)局科技攻關(guān)與新產(chǎn)品試制項(xiàng)目“基于養(yǎng)殖水體中痕量無乳鏈球菌檢測策略的羅非魚鏈球菌病防治新技術(shù)研究”（2020NACB0802）；廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳廣西農(nóng)業(yè)科技自籌經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目“淡水魚病害診治APP推廣應(yīng)用”（Z2022168）；廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳廣西農(nóng)業(yè)科技自籌經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目“稻蝦螺共生稻田生態(tài)養(yǎng)殖新模式創(chuàng)建與示范”（Z2022171）。

作者簡介：施金谷（1986—），碩士，工程師，研究方向?yàn)樗a(chǎn)病害檢測與防控。E-mail： 358478943@qq.com。

*為通信作者，E-mail： sizaiyong@163.com。