鐵死亡在炎癥微環境中抑制牙周膜干細胞增殖及成骨分化的作用

徐小倩 孫衛國 朱瑩

[摘要]目的：研究鐵死亡在炎癥微環境中抑制牙周膜干細胞（Periodontal ligament stem cells，PDLSCs）增殖及成骨分化的作用。方法：培養PDLSCs，將不含藥物培養基處理的細胞作為對照組，炎癥組用含有10 μg/L TNF-α的培養基處理，鐵死亡激動劑組用含有10 μg/L TNF-α及10 μmol/L Erastin的培養基處理，鐵死亡抑制劑組用含有10 μg/L TNF-α及1 μmol/L Ferrostatin-1的培養基處理。檢測各組細胞增殖活力、轉鐵蛋白受體1（Transferrin receptor 1，TfR1）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPx4）的表達水平及成骨誘導分化后的鈣結節數量、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活力、成骨標志基因Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨鈣素（Osteocalcin，OCN）、骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）的表達水平。結果：炎癥組TfR1表達水平高于對照組、GPx4表達水平低于對照組（P＜0.05）。炎癥組處理第3、5、7 d時的增殖活力，成骨誘導第21 d時的鈣結節OD540水平，成骨誘導第7 d時的Runx2、OCN、OPN表達水平均低于對照組（P＜0.05）；鐵死亡激動劑組的上述指標低于炎癥組、鐵死亡抑制劑組的上述指標高于炎癥組（P＜0.05）。結論：炎癥微環境下鐵死亡的激活抑制PDLSCs的增殖及成骨分化。

[關鍵詞]牙周膜干細胞；炎癥微環境；鐵死亡；增殖；成骨分化

[中圖分類號]R781? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2024）05-0001-05

Role Ferroptosis in the Inhibition of Proliferation and Osteogenic Differentiation of Periodontal Membrane Stem Cell under Inflammatory Microenvironment

XU Xiaoqian， SUN Weiguo， ZHU Ying

（ Department of Stomatology， the First Hospital of Anhui University of Science&Technology? Huainan First People's Hospital， Huainan 232001， Anhui ，China ）

Abstract： Objective? To study the role and mechanism of ferroptosis in the inhibition of proliferation and osteogenic differentiation of periodontal membrane stem cells （PDLSCs） under inflammatory microenvironment. Methods? PDLSCs were cultured， cells treated with drug free medium served as control group， inflammation group was treated with medium containing 10 μg/L TNF-α， ferroptosis agonist group was treated with medium containing 10 μg/L TNF-α and 10 μmol/L erastin， and ferroptosis inhibitor group was treated with medium containing 10 μg/L TNF-α and 1 μmol/L ferrostatin-1. The expression levels of cell proliferation viability， transferrin receptor 1 （TfR1）， glutathione peroxidase （GPx4）， the number of calcium nodules， the alkaline phosphatase （ALP） viability， the expression levels of Runt-related transcription factor 2 （Runx 2）， osteocalcin （OCN）， and osteopontin （OPN） after osteogenic induction were measured. Results? TfR 1 expression level of the inflammation group was higher than the control group， GPx4 expression level was lower the control group （P＜0.05）.The proliferative activity of the inflammatory group at the 3rd， 5th and 7th day， the level of calcium nodules OD540 at the 21st day of osteogenesis induction， and the expression levels of Runx2， OCN and OPN at the 7th day of osteogenesis induction were lower than those of the control group （P＜0.05）. The above indexes in the iron death agonist group were lower than those in the inflammation group， and those in the iron death inhibitor group were higher than those in the inflammation group （P＜0.05）. Conclusion? The activation of ferroptosis in the inflammatory microenvironment suppresses PDLSCs proliferation and osteogenic differentiation.

Key words： periodontal ligament stem cells; nflammatory microenvironment; ferroptosis; proliferation; osteogenic differentiation

牙周炎是細菌感染引起的牙周組織慢性炎性疾病，可引起牙周支持組織破壞、牙槽骨吸收，最終導致牙齒脫落。牙周膜干細胞是用于牙周支持組織及牙槽骨修復的重要種子細胞，PDLSCs在牙周炎的局部微炎癥環境中的增殖能力和成骨分化能力顯著減弱，不利于PDLSCs在牙周炎治療中發揮組織修復作用[1-2]。因此，深入認識PDLSCs增殖及成骨分化的調控機制，特別是在炎癥微環境下的增殖及成骨分化調控機制對牙周炎的治療至關重要。鐵死亡是新發現的一種鐵依賴性新型細胞死亡形式，對細胞的增殖和分化均具有調控作用，有研究報道高糖環境下鐵死亡的激活對基質細胞的成骨分化具有抑制作用[3]。炎癥是刺激鐵死亡激活的重要因素之一，牙周炎發病過程中存在鐵死亡的激活[4]，但炎癥微環境下PDLSCs鐵死亡的變化及其對細胞增殖、成骨分化的調控作用缺乏研究證據。因此，本研究將通過細胞實驗探究鐵死亡在炎癥微環境抑制牙周膜干細胞增殖及成骨分化中的作用。

1? 材料和方法

1.1 材料和試劑：PDLSCs細胞株（LM-H002）購自上海聯邁生物工程有限公司。TNF-α、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、茜素紅購自美國Sigma公司，鐵死亡激動劑Erastin、鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1購自美國MCE公司，CCK8法細胞增殖檢測試劑盒、ALP活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技公司，細胞RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量檢測試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司，TfR1、GPx4、Runx2、OCN、OPN及β-actin的特異性一抗及辣根過氧化物酶二抗均購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 PDLSCs培養及分組：PDLSCs在含有10%胎牛血清的培養基中貼壁培養，每2 d更換1次培養基，待細胞密度達到90%時用胰蛋白酶進行消化，消化后的細胞繼續傳代培養。取第3代PDLSCs進行分組，方法如下。對照組用不含藥物的培養基處理，炎癥組用含有10μg/L TNF-α的培養基處理，鐵死亡激動劑組參照Li Y等[5]的研究確定Erastin的劑量為10μmol/L、用含有10μg/L TNF-α及10μmol/L Erastin的培養基處理，鐵死亡抑制劑組參照李暢等[6]的研究確定Ferrostatin-1的劑量為1μmol/L、用含有10μg/L TNF-α及1μmol/L Ferrostatin-1的培養基處理。

1.2.2 PDLSCs干細胞特性的鑒定：取第3代PDLSCs，胰蛋白酶消化后收集細胞，4℃避光孵育CD44、CD90抗體1 h，在流式細胞儀上檢測CD44、CD90的表達情況。

1.2.3 PDLSCs增殖活力的檢測：第3代PDLSCs接種在96孔培養板內，分組處理1 d、3 d、5 d、7 d時采用CCK8法進行檢測，按照試劑盒說明書在每個培養孔內加入CCK8檢測液10μl，繼續孵育2 h后在酶標儀上檢測490 nm波長的吸光值，以該吸光值反映細胞增殖活力。

1.2.4 PDLSCs的成骨誘導：培養成骨誘導培養液，包括0.1μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C、10%胎牛血清。將第3代PDLSCs接種在6孔培養板內，待細胞達70%匯合后，用成骨誘導培養液配置10μg/L TNF-α、10μmol/L Erastin、1μmol/L Ferrostatin-1，每2 d更換1次。

1.2.5 PDLSCs成骨誘導后茜素紅染色：PDLSCs成骨誘導后第21天時，用1%茜素紅染色液對細胞進行染色20 min，觀察鈣結節并拍照記錄，加入1 ml十六烷基吡啶溶解鈣結節，震蕩后吸取100μl移入96孔培養板，在酶標儀上測定540 nm波長的吸光值OD540。

1.2.6 PDLSCs成骨誘導后ALP活力檢測：PDLSCs成骨誘導后第3天、第5天、第7天時，采用ALP檢測試劑盒進行檢測，按照試劑盒說明書進行操作，在酶標儀上測定標準品和待測樣品的510 nm波長吸光值，根據標準品的吸光值繪制標準曲線，計算待測樣品的ALP活力。

1.2.7 PDLSCs中成骨標志基因mRNA表達水平的檢測：PDLSCs成骨誘導后第7天時，采用細胞RNA提取試劑盒提取細胞中的總RNA，采用cDNA第一鏈合成試劑盒將細胞中提取得到的RNA反轉錄為cDNA。采用熒光定量檢測試劑盒對cDNA中的Runx2、OCN、OPN進行熒光定量PCR檢測，PCR的體系為：cDNA 1μl、試劑盒中反應混合液10μl、上下游引物各0.6μl，去離子水補足至20μl；PCR的反應程序為：95℃預變性3 min，95℃ 15 s、特異性退火溫度25 s、72℃ 30 s，共進行40個循環的熒光定量PCR反應，反應結束后得到得到循環曲線及循環閾值（Ct），以β-actin為內參、按照公式2-△△Ct計算GPx4、TfR1、Runx2、OCN、OPN的mRNA表達水平。

1.2.8 PDLSCs中成骨標志基因蛋白表達水平的檢測：PDLSCs成骨誘導后第7天時加入裂解液提取蛋白，進行Western blot檢測。在測定蛋白含量后取20μg蛋白樣本加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離后將分離的蛋白質電轉移至NC膜，5%脫脂牛奶室溫封閉NC膜1 h，4℃孵育1∶1 000稀釋的GPx4、TfR1、Runx2、OCN、OPN、β-actin抗體或1∶5 000稀釋的β-actin的抗體過夜；第2天，室溫孵育1∶2 000稀釋的HRP標記的二抗1 h，顯色后在凝膠成像系統中觀察蛋白條帶，根據條帶灰度值計算GPx4、TfR1、Runx2、OCN、OPN的蛋白表達水平。

1.3 統計學分析：采用SPSS 23.0軟件進行統計學處理，實驗數據為計量資料，以均數±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1 PDLSCs干細胞特性的鑒定：經流式細胞術檢測PDLSCs表面CD44及CD90的陽性表達率均超過99%，符合干細胞的特征。見圖1。

2.2 炎癥微環境下PDLSCs中鐵死亡標志基因表達的影響：炎癥組PDLSCs中GPx4的mRNA表達水平和蛋白表達水平均低于對照組，TfR1的mRNA表達水平和蛋白表達水平均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 鐵死亡在炎癥微環境下對PDLSCs增殖的影響：處理第1天時，各組PDLSCs的增殖活力比較差異無統計學意義（P＞0.05）；處理第3、5、7天時，炎癥組PDLSCs的增殖活力低于對照組，鐵死亡抑制劑組PDLSCs的增殖活力高于炎癥組，鐵死亡激動劑組PDLSCs的增殖活力低于炎癥組（P＜0.05）。見圖3。

2.4 鐵死亡在炎癥微環境下對PDLSCs成骨誘導后鈣結節的影響：成骨誘導21 d時進行茜素紅染色，炎癥組PDLSCs的鈣結節數量少于對照組、OD540水平低于對照組，鐵死亡抑制劑組PDLSCs的鈣結節數量多于炎癥組、OD540水平高于炎癥組，鐵死亡激動劑組PDLSCs的鈣結節數量少于炎癥組、OD540水平低于炎癥組（P＜0.05）。見圖4。

2.5 鐵死亡在炎癥微環境下對PDLSCs成骨誘導后ALP活力的影響：成骨誘導3 d、5 d、7 d時，炎癥組PDLSCs的ALP活力低于對照組，鐵死亡抑制劑組PDLSCs的ALP活力高于炎癥組，鐵死亡激動劑組PDLSCs的ALP活力低于炎癥組（P＜0.05）。見圖5。

2.6 鐵死亡在炎癥微環境下對PDLSCs成骨誘導后成骨標志基因表達的影響：成骨誘導3 d、5 d、7 d時，炎癥組PDLSCs中Runx2、OCN、OPN的mRNA表達水平和蛋白表達水平低于對照組，鐵死亡抑制劑組PDLSCs中Runx2、OCN、OPN的mRNA表達水平和蛋白表達水平高于炎癥組，鐵死亡激動劑組PDLSCs中Runx2、OCN、OPN的mRNA表達水平和蛋白表達水平低于炎癥組（P＜0.05）。見圖6。

3? 討論

PDLSCs是組織工程領域重要的種子細胞，來源于牙周組織且具有自我更新、多向分化的潛能，在特定條件下發生成骨分化能夠參與牙槽骨的重建和修復。牙槽骨的吸收和破壞是慢性牙周炎進展過程中的特征之一，PDLSCs能夠用于牙槽骨的重建和修復，但PDLSCs在炎癥微環境下增殖和成骨分化受到抑制，進而影響了PDLSCs對牙槽骨的重建和修復作用[7-9]。TNF-α處理是細胞實驗中建立炎癥微環境的常用方法，本研究的結果均證實TNF-α處理PDLSCs后細胞的增殖活力減弱，成骨誘導分化后的鈣結節減少、ALP活力降低，與既往相關研究的結果一致[1-2]。但炎癥微環境下PDLSCs增殖及成骨分化的調控機制尚不明確，深入研究相關的分子機制有助于為今后發現新的慢性牙周炎治療靶點提供依據。

本研究以鐵死亡為切入點，對炎癥微環境下PDLSCs增殖和成骨分化受抑制的相關分子機制展開探索。鐵死亡是一種新型細胞死亡方式，分子生物學表現為TfR1表達增加以及GPX4表達降低[10]；TfR1介導了三價鐵的內吞及入核，繼而促進鐵死亡[11]；GPX4是還原過氧化物酶的關鍵酶，能夠減輕鐵死亡[12]。多項牙周炎相關的研究證實牙周炎患者、牙周炎動物模型、牙周炎細胞模型中均存在鐵死亡的顯著激活[13-15]。本研究在TNF-α處理的PDLSCs中檢測到TfR1表達增加以及GPX4表達降低，提示PDLSCs在炎癥微環境中出現了鐵死亡的激活，與既往臨床研究、動物實驗和細胞實驗的相關結果吻合。

鐵死亡的生物學作用廣泛，在細胞增殖及分化中均發揮調控作用。在多種組織損傷的模型中，鐵死亡的激活顯著降低細胞增殖活力、加重組織損傷[16-18]；在干細胞和基質細胞成骨分化的研究中，鐵死亡對成骨分化具有抑制作用。本研究在炎癥微環境中觀察了鐵死亡對PDLSCs增殖和成骨分化的影響，分別在炎癥微環境中使用鐵死亡激動劑和抑制劑進行干預，使用激動劑進一步加劇了炎癥微環境對PDLSCs增殖和成骨分化的抑制作用，而抑制劑明顯改善炎癥微環境對PDLSCs增殖和成骨分化的抑制作用。以上結果提示炎癥微環境下鐵死亡的激活對PDLSCs的增殖和成骨分化具有抑制作用。

成骨分化過程中存在多種成骨標志基因表達增加，其中Runx2是成骨分化過程中特異性高表達的轉錄因子，OCN和OPN是骨基質中主要非膠原成分，在骨質疏松的進展、成骨分化受抑的過程中Runx、OCN、OPN的表達均明顯降低[19-20]。為深入認識炎癥微環境中鐵死亡對PDLSCs成骨分化的調控作用，本研究進一步對上述三種成骨標志基因的表達進行了檢測，TNF-α處理后PDLSCs中Runx、OCN、OPN的表達降低，符合炎癥微環境下PDLSCs成骨分化受抑制的特點；分別使用鐵死亡激動劑和抑制劑后，PDLSCs中成骨標志基因的表達分別降低和增加，表明炎癥微環境下鐵死亡的激活抑制了PDLSCs中成骨標志基因的表達。

綜上所述，炎癥微環境下PDLSCs中鐵死亡顯著激活，異常激活的鐵死亡對PDLSCs的增殖及成骨分化均具有抑制作用。在今后的臨床實踐中，抑制鐵死亡有望成為治療慢性牙周炎的新靶點，在炎癥微環境下抑制鐵死亡能夠促進PDLSCs的增殖和成骨分化，進而有利于牙槽骨的重建和修復。

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[收稿日期]2023-02-15

本文引用格式：徐小倩，孫衛國，朱瑩.鐵死亡在炎癥微環境中抑制牙周膜干細胞增殖及成骨分化的作用[J].中國美容醫學，2024，33（5）：1-5.