非剝脫點陣激光聯(lián)合側柏葉酊對斑禿小鼠IL-7/IL-7Rα信號通路和Tregs細胞亞群的影響

蘇家光 黃家燦 羅世斌 陳信津 鄭文軍

[摘要]目的：研究1 565 nm非剝脫點陣激光聯(lián)合側柏葉酊（Platycladus orientalis tincture， POT）對斑禿（Alopecia areata， AA）小鼠治療作用以及對白細胞介素7（Interleukin 7， IL-7）/白細胞介素7受體α（Interleukin-7 receptor α， IL-7Rα）信號通路和調節(jié)性T細胞（Regulatory T cells， Tregs）亞群的影響。方法：將50只成年雄性C3H/HeJ小鼠隨機分為對照組（C組），模型組[M組，環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide， CTX）誘導AA模型]，M+1 565 nm組（1 565 nm非剝脫點陣激光治療AA），M+POT組（POT治療AA）、M+1 565 nm+POT組（1 565 nm非剝脫點陣激光聯(lián)合POT治療AA），每組10只。流式細胞術檢測C組和M組皮損組織中Tregs細胞亞群的比例和所有組血液中單個核細胞中Tregs細胞亞群的比例。Western blot法檢測各組小鼠皮損組織中IL-7和IL-7Rα的表達。結果：與C組比，M組皮膚組織IL-7和IL-7Rα的表達均明顯增加，而且Tregs細胞比例明顯減少（P＜0.05）。與M組比，M+1 565 nm組和M+POT組IL-7的表達均降低（P＜0.05）。與M組比，M+1 565 nm+POT組IL-7和IL-7Rα的表達均降低，且Tregs細胞比例都顯著增加（P＜0.05）。結論：1 565 nm非剝脫點陣激光聯(lián)合POT治療可以抑制斑禿小鼠IL-7/IL-7Rα信號并減少Tregs細胞的比例。

[關鍵詞]1 565 nm非剝脫點陣激光；斑禿小鼠；側柏葉酊；白細胞介素7；白細胞介素7受體α；調節(jié)性T細胞群

[中圖分類號]R758.71? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2024）05-0005-04

Effects of Non-ablative Fractional Laser Combined with Platycladus Orientalis Tincture on IL-7/IL-7Rα Signaling Pathway and Tregs Cell Subsets in

Alopecia Areata Mice

SU Jiaguang， HUANG Jiacan， LUO Shibin， CHEN Xinjin， ZHENG Wenjun

（Department of Dermatology， the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Nanning 530021， Guangxi， China）

Abstract： Objective? To investigate the therapeutic effect of 1 565 nm non-ablative fractional laser combined with Platycladus orientalis tincture （POT） on alopecia areata （AA） mice， and its impact on the IL-7/IL-7Rα signaling pathway and regulatory T cell （Treg） subsets. Methods? Fifty adult male C3H/HeJ mice were randomly divided into control group （C group）， model group （M group， induced with cyclophosphamide （CTX） to establish AA model）， M+1565 nm group （treated with 1 565 nm non-ablative fractional laser for AA）， M+POT group （treated with POT for AA）， and M+1565 nm+POT group （treated with both 1 565 nm non-ablative fractional laser and POT for AA）， 10 mices in each group. Flow cytometry was used to detect the proportion of Treg subsets in the skin lesions of the C group and M group and in the peripheral blood mononuclear cells of all the groups. Western blot was used to detect the expression of IL-7 and IL-7Rα in the skin lesions of each group of mice. Results? Compared with the C group， the expression of IL-7 and IL-7Rα in the skin lesions of the M group was significantly increased， while the proportion of Tregs cells was significantly decreased （P＜0.05）. Compared with the M group， the expression of IL-7 in the M+1 565 nm group and M+POT group was decreased （P＜0.05）. Compared with the M group， the expression of IL-7 and IL-7Rα in the M+1565 nm+POT group was decreased， and the proportion of Tregs cells was significantly increased （P＜0.05）. Conclusion? The combination of 1 565 nm non-ablative fractional laser combined with POT can inhibit the IL-7/IL-7Rα signaling pathway and reduce the proportion of Tregs cells in AA mice.

Key words： 1 565 nm non-ablative fractional laser; alopecia areata mice; Platycladus orientalis tincture; Interleukin 7; Interleukin-7 receptor α; regulatory T cell population

斑禿是一種T細胞介導的自身免疫性疾病[1]。在全球范圍內，AA的終生發(fā)病率約為0.5%～3.0%，且14%～25%的AA患者會出現(xiàn)大面積頭發(fā)脫落[2]，對人們的心理健康以及生活質量有嚴重的負面影響[3]。研究表明，弱激光療法可促進皮膚細胞的活性[4]，而且1 565 nm非剝脫點陣激光治療斑禿的療效顯著[5-6]。另外，側柏葉酊作為一種生發(fā)烏發(fā)功效的傳統(tǒng)中藥，對于改善斑禿和雄性激素性脫發(fā)具有明顯的幫助[7-8]。但是，1 565 nm非剝脫點陣激光和側柏葉酊對斑禿的治療的內在分子機制并不清楚。臨床研究表明AA患者皮膚的炎癥反應增加[9]，近期研究還發(fā)現(xiàn)AA患者和C3H/HeJ小鼠的損傷皮膚中IL-7明顯上調[10]，外源性IL-7通過增加脫發(fā)組織T細胞的擴增加速AA的發(fā)生，而阻斷IL-7可阻止C3H/HeJ小鼠AA的進展并逆轉早期AA[11]。在AA小鼠體內阻斷IL-7Rα也可以顯著抑制多數T細胞亞群的數量，但可以維持Tregs群的數量。然而，1 565 nm非剝脫點陣激光和POT對斑禿治療過程中對IL-7/IL-7Rα信號通路和Tregs的比例的調控作用并不清楚。因此，本研究主要探討1 565 nm非剝脫點陣激光和POT單獨治療以及二者聯(lián)合治療分別對AA模型小鼠IL-7/IL-7Rα信號通路和Tregs的調控作用。

1? 材料和方法

1.1 材料：POT為自行制備（側柏葉15 g粉碎成粗粉，置密閉玻璃容器加70%乙醇300 ml浸泡1周后，取上清）。磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde-phosphate dehydrogenasem，GAPDH）、IL-7、IL-7Rα的一抗均購于英國Abcam公司。HRP連接抗小鼠IgG（#7076P2）購于美國Cell Signaling Technology公司。RIPA裂解緩沖液（P0013B）、PMSF（ST505）、BCA蛋白檢測試劑盒（P0010）、SDS-PAGE蛋白負載緩沖液（5X）（P0015L）、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（P0012A）、BeyoECL Plus （P0018S）均來自上海碧云天生物科技有限公司。10X TBST緩沖液（C520009）購于由上海三工生物科技有限公司。蘇木精伊紅染色試劑（1092490500）購于美國默克KGaA公司。CD4+CD25+Foxp3+抗體組合TregFlowEX試劑購于武漢AmyJet公司。

1.2 方法

1.2.1 動物的管理：本研究中使用的所有實驗程序和方案都經過筆者醫(yī)院倫理委員會的審查和批準。8周齡雄性C3H/HeJ小鼠50只，由廣西醫(yī)科大學提供（動物生產許可證號：SCXK桂2020-0003），小鼠均適應環(huán)境1周，自由攝入食物和水。小鼠均在溫度為（23±2）℃、濕度為35%～60%、12 h明暗循環(huán)的受控屏障設施中飼養(yǎng)。

1.2.2 小鼠的分組處理：使用隨機數表法將50只小鼠隨機分為對照組（C組），模型組（M組），1 565 nm非剝脫點陣激光治療組（M+1 565 nm組），側柏葉酊治療組（M+POT組）、1 565 nm非剝脫點陣激光聯(lián)合POT治療組（M+1 565 nm+POT組），每組10只。M組小鼠接受融化的松香和石蠟涂背脫毛，隨后，用150 mg/kg CTX腹腔注射C3H/HeJ小鼠8 d后誘導斑禿模型。C組為不進行任何藥物處理健康小鼠。M+1 565 nm組在注射CTX的同時（方案同M組）使用科醫(yī)人醫(yī)療激光設備公司生產的1 565 nm非剝脫點陣激光設備治療2天/次，持續(xù)8 d，脫毛皮膚為激光治療部位，治療時激光設備輕柔接觸皮膚，避免造成額外的機械壓力。M+POT組在注射CTX的同時（方案同M組）用5%POT在脫毛部位輕微按摩3 min，1天/次，持續(xù)8 d。M+1 565 nm+POT組在注射CTX（方案同M組）的同時用1 565 nm非剝脫點陣激光設備治療2天/次，并用5%POT在脫毛部位輕微按摩3 min，1天/次，持續(xù)8 d。每天監(jiān)測小鼠的皮膚顏色和毛發(fā)再生情況。8 d后安樂死小鼠收集小鼠血液和皮膚毛囊組織。血液分離單個核細胞后存于4℃，用于流式細胞術檢測。收集的新鮮皮膚毛囊組織存于-80℃用于Western blot實驗，剩余病灶部位皮膚組織用于病理檢測。

1.2.3 HE染色：將C組和M組的皮膚組織固定在10%中性緩沖福爾馬林中并脫水。進行石蠟包埋，獲得的石蠟塊使用手動旋轉切片機Leica RM2235切片機切成4μm薄片。所有切片隨后根據HE染色試劑盒提供的說明進行染色，隨后乙醇中脫水，然后在二甲苯中清洗，隨后封上蓋玻片后在萊卡光學顯微鏡下觀察放大200倍的組織結構。

1.2.4 流式細胞術：分離各組小鼠血液中的PBMCs以及C組和M組小鼠皮損組織中的PMBCs。為分析其中Tregs細胞的比例，將PBMCs細胞用CD4-FITC、CD25-PE、以及FOXP3-APC抗體進行孵育，細胞被標記后，嚴格的門控條件下分選CD4+、CD25+、FOXP3+細胞，用FACSCalibur流式細胞儀進行比例分析。

1.2.5 Western blot：根據蛋白裂解液說明書，各組毛囊組織（50～80μg）用RIPA緩沖液勻漿，并提取總蛋白。采用二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白測定試劑盒進行蛋白濃度的定量分析。在沸水中使蛋白變性，分離不同大小的蛋白用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行。對含有蛋白的凝膠進行濕法轉膜，待蛋白轉移到聚偏二氟乙烯PVDF膜上后，用5%脫脂牛奶進行封閉，然后與抗IL-7的一抗（1∶600）和抗IL-7Rα的一抗（1∶800）4℃孵育過夜。使用PBST清洗抗體后，進一步與辣根偶聯(lián)二抗（1∶5 000）孵育，并用增強化學發(fā)光試劑孵育條帶。利用Image J軟件對條帶的光密度進行分析。

1.3 統(tǒng)計學分析：本研究的數據都使用GraphPad PRISM 5.01進行數據錄入和統(tǒng)計學分析，正態(tài)分布的數據表示為均數±標準差，多組間比較用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較行LSD-t檢驗。檢驗水準為α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結果

2.1 AA小鼠模型：本研究用CTX誘導小鼠8 d，結果顯示，與C組比，M組可觀察到小鼠背部和腹部部分區(qū)域毛發(fā)出現(xiàn)明顯脫落，導致皮膚出現(xiàn)多個具有斑禿特征的裸露部位（見圖1A）。HE染色觀察到M組皮損部位淋巴細胞數目、中性粒細胞數據明顯增加，說明此部位炎癥細胞浸潤增多（見圖1B）。結果表明CTX成功誘導了小鼠斑禿模型。

2.2 小鼠皮損組織中Tregs的比例變化：流式細胞術檢測皮損組織中Tregs的比例和統(tǒng)計圖結果顯示，M組小鼠皮損組織中Tregs的比例明顯低于C組，差異有統(tǒng)計學意義（t=45.822，P=0.006）。見圖2。

2.3 各組小鼠毛囊組織中IL-7和IL-7Rα的表達比較：與C組比，M組IL-7蛋白表達上調（約3.3倍）（t=28.336，P=0.015），且IL-7Rα的表達上調（約4.9倍）（t=46.075，P=0.007），差異均有統(tǒng)計學意義。對比M組，M+1 565 nm組和M+POT組IL-7蛋白的表達水平都降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而IL-7Rα的表達水平變化無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。但是與M組比，M+1 565 nm+POT組IL-7和IL-7Rα的表達都明顯下調，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與M+1 565 nm組比，M+1 565 nm+POT組IL-7和IL-7Rα的表達均明顯下調，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與M+POT組比，M+1 565 nm+POT組IL-7和IL-7Rα的表達也都明顯下調，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3。

2.4 1 565 nm非剝脫點陣激光聯(lián)合側柏葉酊治療激活斑禿小鼠血液Treg細胞群：與C組相比，M組Tregs（CD4+CD25+Foxp3+）的比例降低了約75.1%，差異有統(tǒng)計學意義（t=35.115，P=0.010）。與M組相比，M+1 565 nm組和M+POT組Treg細胞比例變化不明顯，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。但是與M組比，M+1 565 nm+POT組Treg細胞都明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與M+1 565 nm組比，M+1 565 nm+POT組Treg細胞比例增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與M+POT組比，M+1 565 nm+POT組Treg細胞比例增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖4。

3? 討論

IL-7是外周調節(jié)免疫細胞存活和功能的重要因素，主要由淋巴組織和骨髓的基質細胞分泌，也可由皮膚組織產生[9，12]。研究表明，AA模型的C3H/HeJ小鼠損傷皮膚組織中的IL-7和IL-7Rα的表達水平上調[11，13]，而促炎細胞因子的增多與AA發(fā)展有密切關系[14]，當注射外源性IL-7后，AA的進展速度加快[11，15]。本研究觀察到環(huán)磷酰胺可以誘導AA的發(fā)生，并同時促進了皮膚毛囊組織中IL-7和IL-7Rα的表達，而無論是1 565 nm非剝脫點陣激光治療還是側柏葉酊單獨治療，又或是兩者聯(lián)合治療均可以在治療8 d后抑制皮膚毛囊組織中IL-7的表達，但是對于IL-7Rα的影響僅存在于1 565 nm非剝脫點陣激光聯(lián)合側柏葉酊治療組。這表明1 565 nm非剝脫點陣激光聯(lián)合側柏葉酊治療能有效抑制AA中IL-7/IL-7Rα信號軸。

干擾素γ系統(tǒng)調控促進趨化因子釋放是AA發(fā)病的關鍵機制之一，可以顯著負調控Tregs的水平[16]。研究表明，IL-7能促進IFN-γ的表達并促進T細胞浸潤[11，13，17]，IFN-γ也能誘導角質形成細胞中IL-7的表達[18]，表明皮膚中IFN-γ和IL-7信號級聯(lián)之間存在正反饋調節(jié)[19]。IL-7是Treg細胞生存和功能的重要因素，IL-7及其受體參與T細胞依賴性自身免疫過程[12]。本研究通過流式細胞術分析表明，C3H/HeJ小鼠經過誘導建立AA模型后其皮損組織和血液單個核細胞中的Tregs明顯減少。當使用1 565 nm非剝脫點陣激光聯(lián)合側柏葉酊治療后血液單個核細胞中Tregs增加了近2倍。但是單獨1 565 nm非剝脫點陣激光治療或者單獨側柏葉酊治療并未對Tregs形成顯著性影響。由于Tregs是通過抑制異常或過度的免疫反應來維持免疫自我耐受和免疫穩(wěn)態(tài)的核心[20]，而且Treg缺陷可導致人類自身免疫性疾病和小鼠模型中耐受的喪失[21]。因此，增強Treg是治療自身免疫性疾病的一種策略。本研究表明，1 565 nm非剝脫點陣激光聯(lián)合側柏葉酊在治療AA時可通過提高Tregs的水平并改變自身免疫耐受性。

有研究強調了IL-7/IL-7Rα通路在自身免疫疾病中的作用，且表明阻斷IL-7Rα治療AA可以消耗大部分效應T細胞，增加小鼠體內Treg的比例，從而在AA恢復中發(fā)揮作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn)1 565 nm非剝脫點陣激光聯(lián)合側柏葉酊治療后IL-7/IL-7Rα通路被明顯阻斷，而且Tregs比例則顯著增加，這表明1 565 nm非剝脫點陣激光聯(lián)合側柏葉酊治療可通過抑制IL-7/IL-7Rα通路的激活從而提高Tregs。而阻斷IL-7Rα可以減輕促炎癥反應，增加調節(jié)性T細胞的功能，并減少T細胞的浸潤[23]，這說明了1 565 nm非剝脫點陣激光聯(lián)合側柏葉酊治療改善了小鼠體內的自身免疫反應，抑制了促炎癥反應，其機制可能是促進了Tregs對機體過度免疫反應的抑制。

本研究仍存在一定不足，仍需要在小鼠AA模型中仔細評估用于提高Tregs比例的激光強度和側柏葉酊的最大劑量。另外，需要持續(xù)增加樣本量并統(tǒng)計分析1 565 nm非剝脫點陣激光聯(lián)合側柏葉酊治療下對AA的治療效果。

綜上所述，本研究證明了IL-7/IL-7Rα通路和Tregs細胞群在AA發(fā)生中的重壓作用，并初步探明1 565 nm非剝脫點陣激光聯(lián)合側柏葉酊對AA小鼠體內IL-7/IL-7Rα通路具有阻斷作用而對Tregs細胞亞群具有明顯的增加作用。

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[收稿日期]2023-01-16

本文引用格式：蘇家光，黃家燦，羅世斌，等.非剝脫點陣激光聯(lián)合側柏葉酊對斑禿小鼠IL-7/IL-7Rα信號通路和Tregs細胞亞群的影響[J].中國美容醫(yī)學，2024，33（5）：5-9.