腰果CBF基因家族的鑒定及響應冷脅迫的表達模式

崔恒久 曾教科 李雯 黃海杰 彭世清 郭冬 蒲金基 周永凱 李輝亮

關鍵詞：腰果；低溫響應；CBF 轉錄因子；基因家族；qRT-PCR

植物生長受多種環境因素的控制，其中溫度是重要的因素之一[1]。低溫脅迫會影響甚至破壞細胞的動態平衡，導致植物生長發育受到嚴重影響[2]。C-repeat binding factor（CBF）轉錄因子，也叫做dehydration responsive element binding factor1蛋白（DREB1 蛋白）[3-4]，在響應低溫脅迫中起重要作用，冷應答途徑是植物感受低溫信號重要的調控途徑之一。ICE-CBF-COR 是被研究最透徹的一條通路。植物對低溫等非生物脅迫抗性的提高與脯氨酸、可溶性糖等物質的積累密不可分，而相關物質的積累需要下游基因的激活表達。下游基因的激活表達需要CBF 轉錄激活因子與下游COR 基因啟動子中的DRE/CRT （C-repeat/dehydration responsiveelement）順式作用元件特異性結合[5-8]。

CBF轉錄因子屬于Apetala2/Ethylene responsivefactor 基因家族（AP2/ERF 基因家族），AP2/ERF由AP2 亞家族、ERF 亞家族和RAV 亞家族組成。目前，CBF 基因家族已經在多種植物中得以研究，擬南芥（Arabidopsis thaliana）研究表明，擬南芥基因組中含有6 個CBF 基因[9]。此外，CBF/DREB1轉錄因子還存在于其他植物中，如番茄[10-13]、水稻[14-20]、大豆[21-25]等。CBF/DREB1 轉錄因子具有高度保守的AP2/ERF 結構域。AP2/ERF 結構域含約60 個氨基酸[26]。

腰果（Anacardium occidentalie Linn）被譽為世界四大著名堅果之一。是典型的熱帶果樹，原產地在巴西東北部地區，16 世紀被引入亞洲、非洲以及南美洲的熱帶國家和地區[27]。栽培的緯度范圍在北緯20°和南緯20°之間，但主要分布在15°以內地區。我國腰果種植主要集中在云南、海南等地。

腰果仁有豐富的營養價值，用途十分廣泛，可作為甜品、點心、菜肴的原材料。副產品主要有果梨、果殼液等，果殼液被作為重要的工業原料被大量使用，果梨可以食用，用在果酒、果醬、腌菜等[28]。因此，種植腰果可以帶來很大的經濟效益、社會效益和生態效益。在中國熱帶地區脫貧攻堅和鄉村振興中起到重要作用。腰果對低溫比較敏感，當溫度低于15 ℃時生長緩慢，在8 ℃時受到嚴重傷害，此前，海南等地的腰果因低溫受災嚴重。目前，對腰果的研究主要集中在生理層面，對于分子層面的研究較少。抗逆基因已經在許多物種中進行了挖掘和應用，本研究將腰果作為實驗材料，對腰果的CBF 基因家族進行相關生物信息學分析，分離鑒定得到AoCBF 基因，為后續深入開展腰果耐寒性研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

將保存于中國熱帶農業科學院種質庫的腰果種質資源CJSX 作為實驗材料。通過篩選得到有活力的種子，將篩選的種子進行催芽，長出真葉后移栽至育苗盤中，在溫度為25 ℃，16 h 光照，2800 lx 的環境下生長。生長到6 片真葉時，移栽至人工氣候屋，保持光照條件不變，對照溫度25 ℃（CK）不變，溫度分別調至8 ℃、16 ℃，2個溫度下處理時間為6 h、24 h，共4 個處理（T1：8 ℃ 6 h，T2：8 ℃ 24 h，T3：16 ℃ 6 h，T4：16 ℃24 h）。將低溫處理過的腰果葉片采摘，液氮處理，送公司進行Illumina 轉錄組測序。

1.2 方法

1.2.1 腰果CBF 基因家族的鑒定和分析 在擬南芥資源網站TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）上獲取相關AtCBFs 蛋白序列。將得到的AtCBFs蛋白序列進行本地BLAST 分析， 相關參數E_value 設置為10e–50；蛋白的篩選標準為identity≥60%，align_ratio≥60%。將蛋白是否含有AP2結構域作為重要的判斷依據，使用NCBI-CDD 數據庫與Pfam_scan 軟件進行驗證，由此得到具有AP2 結構域的候選腰果CBF 基因。利用在線軟件Expasy（ https：//web.expasy.org/protparam/）分析腰果AoCBF 蛋白序列，對每個AoCBF 蛋白的等電點、長度、相對分子質量進行預測[29]。使用Cell-PLoc 2.0（http：//www. csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）在線軟件對候選的腰果CBF 基因進行亞細胞定位預測[30]。

1.2.2 AoCBF 蛋白保守結構域和保守基序（motif）分析 對每個AoCBF 氨基酸序列使用MEGA-X軟件進行比對，使用MEME 在線軟件（https：//meme-suite.org/meme/）對AoCBF 蛋白保守結構域對進行分析。對相關AoCBF 蛋白的保守基序進行分析[31]，設置為5 個基序，設置基序為10～200個氨基酸長度，其他參數均為默認值。使用SWISS軟件對AoCBF 蛋白進行三維結構預測[26]。

1.2.3 AoCBF 蛋白系統進化分析為了進一步研究腰果和擬南芥之間的進化關系，將6 個AoCBF 蛋白和6 個AtCBF 蛋白采取Neighborjoining（NJ）法在MEGA-X 軟件上構建系統發育樹[24]，Bootstrp method 參數值設為1000。

1.2.4 AoCBF 基因上游序列的順式作用元件分析從 JGI（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Aoccidentalev0_9）網站上獲取AoCBF 基因上游2000 bp 的序列，利用PlantCARE 軟件對其進行順式作用元件預測分析[32]。

1.2.5 AoCBFs 在冷脅迫下的表達模式 用TBtools（v1.082）軟件提取轉錄組數據庫中腰果CBF 基因家族的CDS 序列，并通過IDT（https：//sg.idtdna.com/pages）在線網站進行引物設計（表1）。使用多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（成都福際生物技術有限公司）按照說明書從每個樣品中提取總RNA，并對其濃度和純度進行檢測，結果顯示A260/A280 和A260/A230 的參數均在2.0 左右，表明RNA 無明顯的DNA 和蛋白污染，此外，通過瓊脂糖電泳也檢測RNA 的完整性。隨后通過逆轉錄試劑盒（蘇州莫納生物科技有限公司）按照說明書合成cDNA 第一鏈并檢測其濃度，稀釋后備用。并使用2–ΔΔCT 方法計算每個AoCBFs 的最終相對表達水平。使用GraphPad Prism 8 軟件制圖，每個處理3 個生物學重復。

2 結果與分析

2.1 腰果CBF 基因家族成員的鑒定和分析

用轉錄組數據庫和6 個已知的擬南芥AtCBFs序列進行本地BLAST 分析，共得到15 個注釋的DREB 基因。經過結構域分析，鑒定出11 個腰果CBF 基因。設計特異性引物進行PCR 擴增，獲得6 條腰果序列（AoCBF1～AoCBF6）。

理化性質分析結果顯示，AoCBFs 編碼的氨基酸序列存在較大差異，預測蛋白的長度為189～334 aa，最長的為AoCBF1，最短的為AoCBF4。蛋白分子量介于21.31～37.89 kDa 之間；6 個AoCBFs全部呈酸性，其理論等電點（pI）介于4.93～5.79之間。通過亞細胞定位分析得出所有AoCBFs 都有核定位信號（表2）。

2.2 AoCBF 蛋白保守基序分析

保守基序（motif）預測結果表明（圖1），AoCBFs 含有5 個保守motifs。motif 1、motif 2存在所有AoCBFs 中，表明2 個基序高度保守。AoCBF1只包含motif1、motif2，AoCBF2、 AoCBF3、AoCBF4、AoCBF5、AoCBF6 包含motif1、motif2、motif3、motif5，原因可能是串聯重復過程中堿基丟失造成的。對上述保守基序檢測發現motif 1 含有AP2 結構域。根據其在結構上有所不同，推測不同AoCBF 在功能上存在一定差異。

2.3 腰果和擬南芥CBF 蛋白的系統發育樹分析

將6 個AoCBFs 氨基酸序列和6 個AtCBFs氨基酸序列構建系統發育樹。結果顯示，上述CBF氨基酸序列可分成A、B 兩個亞家族。AoCBFs在A 組有1 個，B 組有5 個。AtCBFs 在A 組有2個，B 組有6 個（圖2）。

2.4 AoCBFs 三維結構及序列特征分析

6 個AoCBF 蛋白序列相似性在46%～58%之間。一段長度為60 個氨基酸左右較為保守的序列在N 段被發現，軟件預測其為CBF 蛋白的DNA結合結構域（圖3）。AoCBFs 的identity 最高為AoCBF4 和AoCBF6。最高的同源性為58.21%。對AoCBFs 進行三維結構建模分析，1 個α-螺旋和2 個β-折疊構成AoCBFs 的三維結構。

2.5 AoCBFs 上游序列的順式作用元件分析

利用PlantCARE 軟件注釋AoCBFs 基因上游2000 bp 啟動子區域序列，在其上游發現了參與激素反應的相關順式作用元件（茉莉酸甲酯、脫落酸、赤霉素、生長素、水楊酸有關的順式作用元件）、參與低溫、干旱和高鹽誘導脅迫相關的響應元件、光響應元件。此外，普遍存在于啟動子與增強子區的核心元件、生長發育相關調控順式作用元件也被發現。結果表明，AoCBF 基因在抵御非生物脅迫、生長發育、激素調控中發揮重要作用（表3）。

2.6 AoCBFs 在冷脅迫下的表達模式

為了探明AoCBFs 在冷脅迫下的表達模式，對AoCBFs 進行實時熒光定量PCR 分析。結果表明，經8 ℃和16 ℃低溫誘導處理6 h 和24 h 后，除了AoCBF5 在8 ℃時相對表達量變化較少，在16 ℃表達變化較大，其他基因在8 ℃的表達量均顯著升高。表明AoCBF 基因參與響應冷脅迫相關生物學過程（圖4）。

3 討論

腰果是典型的熱帶果樹，對低溫極敏感。主要在我國熱區的海南、云南等地種植。但是近年來冬季寒潮頻發，溫度降低使腰果受到冷害的問題愈加嚴重。植物中CBF 家族在面對低溫時發揮調控作用，減少低溫對植株的損傷。因此，本課題組對腰果CBF 家族進行生物信息學分析，以期發現腰果CBF 基因在低溫脅迫下的調控機制。

本研究共鑒定獲得6 個AoCBF 基因。并對其理化性質、亞細胞定位、系統發育進化樹、蛋白三維結構、順式作用元件以及對低溫脅迫下的表達方式進行研究。由于AoCBFs 的等電點為4.93～5.79，蛋白呈酸性，故在酸性亞細胞環境下，AoCBF 蛋白可能會發揮作用。AoCBFs 可以分為2 個亞族：AoCBF1 為A 族，AoCBF2、AoCBF3、AoCBF4、AoCBF5、AoCBF6 為B 族。而B 族中AoCBF3、AoCBF4 具有更高親緣性，AoCBF2、AoCBF5、AoCBF6 可能具有類似的調控方式。

目前CBF 基因在十字花科植物、禾本科植物、豆科植物、漆樹科植物、茄科植物中均有研究。最早是STOCKINGER 等[33]在模式植物擬南芥中克隆得到相關CBF 基因。擬南芥的6 個家族成員，受外源ABA 誘導的有CBF1、CBF2 和CBF3。CBF1 和CBF3 的表達受CBF2 的負調控。CBF4不能響應低溫脅迫誘導但是能夠響應干旱和ABA誘導[34]。DREB1E 和DREB1F 均可以受高鹽脅迫誘導。本研究在6 個AoCBFs 啟動子上不僅篩選到響應低溫誘導、干旱誘導、光響應元件有關的順式作用元件，而且篩選到與茉莉酸、生長素、水楊酸、脫落酸、赤霉素等激素有關的順式作用元件。后續可開展分子對激素和冷信號調控的相關機制。

AoCBF 基因家族6 個成員均不存在內含子，所以AoCBF 基因為內含子缺失型。內含子缺失型基因在面對脅迫時，可通過減少轉錄處理的方法提高轉錄本積累的效率[35]。

本研究發現，腰果經過冷脅迫處理后，6 個AoCBF 基因均對低溫產生響應，除了AoCBF1、AoCBF3、AoCBF4、AoCBF5 在16 ℃表達顯量著提高，其余的基因均在8 ℃時表達量顯著提高。

相較于傳統的雜交育種、誘變育種等方式，基因工程技術有高效率、短周期、提高植物抗逆性等優勢。科研工作者可以利用基因克隆技術、基因重組技術、轉基因技術等基因工程技術提升植物抵御低溫脅迫的能力。本研究通過對AoCBF基因家族進行生物信息學分析，分析AoCBF 基因在低溫脅迫下的調控機制，為未來的腰果抗性分子輔助育種研究工作奠定基礎。