正己醇對機械傷香蕉采后生理特性影響及磷脂酶D的抑制作用

甘婷 黃方 黃敏 易萍 李麗 李杰民 零東寧 陳瑜嫻 張蘭

關鍵詞：香蕉；正己醇；磷脂酶D 抑制劑；采后品質；生理特性

香蕉（Musa nana L.）是世界四大水果之一，原產于東南亞，目前國內主產于廣西、云南、海南及臺灣等地[1]。成熟香蕉具有氣味芬芳、果肉細膩的特點。其次，香蕉因富含蛋白質、VC、礦物質K 等營養元素和多酚、胺類等活性成分，且具有抗氧化、預防心血管等保健功能，因此深受消費者喜愛[2]。另外，香蕉屬于呼吸躍變型果實，采后出現呼吸躍變，乙烯釋放量迅速上升，從而促進香蕉成熟和衰老。但由于香蕉在貯運、銷售等過程中易產生微生物、機械傷、冷害等采后病害，尤其在貯運過程中常因振動產生的碰撞和擠壓，使組織細胞膜系統和細胞結構遭到破壞，造成果實采后品質劣變，加速果實成熟和衰老，嚴重影響果實貯藏期限，降低商品價值[3]。因此，有效延長具有機械傷香蕉的貯藏保鮮期，保持其在貯藏期間的品質對香蕉產業的發展具有重要意義。

磷脂酶D（phospholipase D，PLD），全稱磷脂酰膽堿磷脂水解酶，是催化生物膜主要成分磷脂水解的關鍵酶[4]。由于機械傷可使植物細胞膜完整性喪失，激活并促進PLD 與膜結合而提高PLD 活性，導致磷脂降解，膜通透性改變，最終造成植物傷害甚至死亡[5]。目前，隨著人們生活水平提高，越來越注重果蔬采后品質，因此對果蔬采后保鮮技術的要求也不斷提高。正己醇是植物脂氧合酶代謝途徑中形成的代謝產物，也是細胞膜衰老代謝關鍵酶磷脂酶D 的抑制劑，可用于果蔬采后保鮮[6-8]。李英華等[9-10]研究了不同濃度正己醇對草莓的保鮮效果，發現0.05%正己醇處理可有效抑制采后草莓呼吸作用和果實軟化，降低果實采后腐爛率，較好地維持草莓VC 含量；0.1%正己醇顯著提高草莓在貯藏期間的抑菌能力，減少微生物病害，此外，正己醇處理還有效抑制草莓LOX 活性，降低丙二醛（MDA）含量，提高POD活性。正己醇處理在桃[11]、桑葚[12]等作物中均較好地維持果實品質，延緩果實成熟衰老進程。

目前，正己醇對香蕉在機械傷脅迫后其生理特性的影響尚無報道。因此，研究正己醇對機械傷香蕉采后貯藏期間生理特性的影響，為維持機械傷香蕉采后品質和延長貯藏期限提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用香蕉品種為桂蕉6 號，成熟度為7～8 成熟，采自廣西南寧市壇洛鎮果園。采后立即運回實驗室，將香蕉分成單根果指，挑選果實外觀完好、成熟度一致、大小相近、無病蟲害的果實為材料。用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡清洗10 min，取出晾干備用。

正己醇（1-hexanol）購自中和化學（山東）有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙酸乙酯、NaOH 等試劑均為國產分析純。

本試驗所用儀器設備：BSA124s 型電子天平、GY-4 型果實硬度計、UV-3200 PCS 型紫外可見分光光度計、3-18ks 型高速冷凍離心機。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 將預處理的香蕉果實進行模擬機械損傷處理，采用不銹鋼打孔器（直徑為2 mm）在香蕉中軸部位戳傷。隨后將處理好的香蕉隨機分成2 組，每組60 個香蕉果實，分別用蒸餾水（對照組）和（正己醇處理組）0.1%濃度正己醇浸泡處理果實10 min，然后自然晾干。晾干后的香蕉置于PE 保鮮袋中扎口包裝，于25 ℃室溫下貯藏15 d，每3 d 取樣觀察并測定相關指標，試驗重復3 次。

1.2.2 硬度的測定 使用GY-4 型果實硬度計測定（探頭直徑為5 mm），每次隨機取6～8 個香蕉，每個果面測2 個點，最終取平均值為該果實的硬度。

1.2.3 可溶性固形物（TSS）含量測定 使用MZB-53（N）便攜式數顯糖度計測定，取去皮香蕉的中部果肉進行切塊打漿，重復測6 次，最終取平均值為果實的TSS 含量。

1.2.4 呼吸強度的測定 呼吸強度測定參照曹健康等[13]的方法，采用靜置法進行測定。

1.2.5 病情指數的測定 參考吳小建等[14]的方法并加以改進，根據香蕉果實表面腐爛面積大小分為0～4 級。分級標準為：0 級果（無病斑）、1級果（<1/10 病斑）、2 級果（1/10～1/4 病斑）、3級果（1/4～1/2 病斑）、4 級果（>1/2 病斑）。每次取樣測量香蕉表面病斑的大小。

病情指數=Σ（腐爛級別×該級別樣品數量）/（最高級別×樣品總數量）×100%

1.2.6 MDA 含量測定 參照劉瑤等[15]的方法，采用硫代巴比妥酸法測定450、532、600 nm 處的吸光值。

1.2.7 相對電導率測定 參考SONG 等[16]的方法，用相對電導率表示膜透性，并稍作修改。將樣品煮沸10 min 并冷卻至室溫，測定相對電導率。

1.2.8 PLD 酶活性測定 參照SUN 等[17]和CHEN 等[18]的方法，取磨樣后的香蕉果肉組織1 g，測定PLD 活性及蛋白質含量，單位用U/g表示。

1.2.9 實時熒光定量分析 按照RNAprep PurePlant Kit 試劑盒說明書，提取香蕉果皮中軸組織總RNA。取總RNA 1 μg 使用HiFiScript cDNA試劑盒反轉錄合成cDNA 第一鏈，用于后續實時熒光定量分析[17]。根據PLD 基因序列，使用Premier 5.0 軟件設計基因特異性引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。根據Real time PCR Master Mix（SYBR Green）試劑盒說明書進行RT-qPCR。以香蕉Actin 基因為內參基因[19-20]，采用2–ΔΔCT 法計算PLDγ 和PLDζ 基因的相對表達量。

1.3 數據處理

采用Excel 2010 軟件對實驗數據進行統計；利用SPSS 26.0 軟件Duncans 法對數據進行差異顯著性分析；使用Origin 2018 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 采后正己醇處理對香蕉硬度的影響

硬度是反映果實采后軟化程度的重要指標[21]。如圖1 所示，采后貯藏過程中，香蕉硬度整體呈下降趨勢。貯藏0 d，果實硬度最大，為378.89 N。至貯藏3 d，2 組硬度變化不明顯。隨貯藏時間增加，果實硬度逐漸降低。貯藏6 d 時，處理組硬度為262.38 N，在貯藏15 d 降至最低值165.25 N，較對照組顯著提高71%（P<0.05）。貯藏15 d，對照組和處理組較貯藏6 d 分別降低65.5%和37%，表明正己醇處理可延緩香蕉果實軟化的進程。

2.2 采后正己醇處理對香蕉可溶性固形物（TSS）含量的影響

可溶性固形物（TSS）可反映果蔬的成熟度和品質狀況。如圖2 所示，采后貯藏過程中，香蕉TSS 含量整體呈上升趨勢。貯藏6 d 前，2 組的TSS 含量無顯著差異。貯藏9 d，對照組和處理組的TSS 含量分別為9.35%和6.07%。貯藏15 d，香蕉TSS 含量積累至最大值，處理組為16.27%，較對照組降低20%（相對值）。貯藏9 d后， 處理組TSS 含量極顯著低于對照組（P<0.01），表明PLD 抑制劑正己醇在一定程度上降低了香蕉TSS 含量，維持果實品質，延緩采后貯藏期限。

2.3 采后正己醇處理對香蕉呼吸強度的影響

如圖3 所示，采后貯藏過程中，香蕉呼吸強度整體呈先上升后下降的趨勢。貯藏0 d，香蕉呼吸強度為2.17 mg/（kg·h），隨后逐漸上升。貯藏6 d，處理組呼吸強度為7.74 mg/（kg·h），顯著低于對照組。對照組和處理組均于9 d 出現呼吸峰，處理組呼吸強度較對照組極顯著降低33.93%，隨后下降。貯藏9～15 d，對照組呼吸強度由14.62 降至8.27 mg/（kg·h），處理組由9.66 降至6.56 mg/（kg·h），處理組顯著低于對照組（P<0.05）。采后貯藏期間，處理組呼吸強度均低于對照組，其中6～15 d 降低效果顯著，表明正己醇處理可有效抑制采后香蕉貯藏期間呼吸強度上升，延緩果實成熟和衰老的進程。

2.4 采后正己醇處理對香蕉病情指數的影響

病情指數可反映采后貯藏期間果蔬的病害情況，是衡量果實品質的重要指標[22-23]。如圖4 所示，隨貯藏時間增加和果實逐漸成熟，香蕉病情指數呈上升的趨勢。貯藏0 d，香蕉病情指數為0，貯藏6 d，處理組病情指數為1.22%，顯著低于對照組。貯藏9～15 d，處理組病情指數由11.59%升至35.88%，極顯著低于對照組。貯藏15 d，香蕉病情指數最大，處理組病情指數為35.88%，較對照組極顯著降低54.07%。綜上，正己醇處理可有效抑制貯藏期間香蕉果實病斑的擴大和增加，降低采后果實病情指數。

2.5 采后正己醇處理對香蕉MDA 含量的影響

MDA 是膜脂過氧化的產物，加速采后果實衰老進程。如圖5 所示，采后貯藏期間，香蕉MDA含量整體呈上升的趨勢。貯藏9 d，對照組MDA含量為2.4 nmol/g，顯著低于對照組，隨后于15 d迅速增至最大值6.75 nmol/g。采后貯藏期間，處理組MDA含量較對照組推遲3 d 上升，貯藏12 d，處理組MDA 含量為2.25 nmol/g，較對照組極顯著降低55.00%，隨后于貯藏15 d 迅速增至最大值4.95 nmol/g，較對照組極顯著降低26.70%。綜上，PLD 抑制劑正己醇在采后貯藏過程中可抑制MDA 生成，延緩果實衰老。

2.6 采后正己醇處理對香蕉細胞膜透性的影響

如圖6 所示，隨貯藏時間增加，香蕉的相對電導率整體呈上升趨勢。貯藏9 d，對照組和處理組的相對電導率分別為22.88%和15.75%，隨后處理組相對電導率于貯藏12 d 升至24.56%，較對照組極顯著下降（P<0.01）。貯藏15 d，香蕉相對電導率達到最大值，處理組的電導率為33.84%，較對照組極顯著降低62.20%（P<0.01）。結果分析表明，貯藏9 d 后，處理組的相對電導率和MDA含量均低于同期對照組，說明PLD 抑制劑正己醇可有效抑制香蕉膜脂過氧化反應，延緩果實貯藏期限。

2.7 采后正己醇處理對香蕉PLD 酶活性的影響

磷脂酶D（PLD）是催化磷脂水解的關鍵酶，在逆境脅迫下被激活的PLD 可降解果實的細胞膜，導致膜透性增大，促進果實老化，降低果實品質[24]。如圖7 所示，采后貯藏過程中，對照組PLD 含量呈逐漸上升的趨勢，處理組呈先上升后下降再上升的趨勢。對照組PLD 活性于貯藏15 d增至最大值590.13 U/g。貯藏3 d 處理組PLD 活性為456.25 U/g，顯著低于對照組（P<0.05），隨后于6 d 降至407 U/g，較對照組極顯著降低17.4%（P<0.01）。貯藏15 d，處理組PLD 活性增至最大值531.88 U/g，較對照組顯著降低10%（P<0.05）。處理組PLD 活性在采后貯藏期間顯著低于對照組（P<0.05），表明正己醇處理可有效抑制PLD 生成，維持果實品質，延緩貯藏期限。

2.8 采后正己醇處理對香蕉PLDγ 基因表達的影響

如圖8 所示，香蕉PLDγ 表達量整體呈上升的趨勢。貯藏0～12 d，對照組和處理組的PLDγ表達量均較低，且兩組間的PLDγ 表達量無顯著差異。貯藏15 d，香蕉PLDγ 表達量達到峰值，處理組PLDγ 表達量為5.39，較對照組極顯著降低72.06%；對照組和處理組PLDγ 表達量較12 d上升11.18 倍和2.68 倍。綜上，PLD 抑制劑正己醇可抑制采后香蕉PLDγ 表達，降低采后果實的膜脂代謝，延長貯藏期限。

2.9 采后正己醇處理對香蕉PLDζ 基因表達的影響

如圖9 所示，香蕉PLDζ 表達量在貯藏過程中呈先下降后上升的趨勢。貯藏第3 天，處理組PLDζ 表達量降至0.41，較對照組顯著降低46.75%（P<0.05），隨后上升。隨貯藏時間增加，香蕉PLDζ 表達量于15 d 達到峰值，處理組PLDζ 表達量為1.78，較對照組極顯著降低33.08%（P<0.01）。綜上，PLD 抑制劑正己醇可抑制采后香蕉PLDζ表達，降低采后果實的膜脂代謝，延長貯藏期限。

3 討論

硬度是果實采后品質的重要指標之一，可反映果實采后的耐貯性。本研究結果表明，隨貯藏時間增加，香蕉果實硬度不斷降低，但與對照組相比，正己醇處理可有效抑制香蕉果實軟化。采后貯藏期間，香蕉果實中的淀粉降解轉化成葡萄糖，使果實TSS 含量累積增大，表現為果實采后成熟度變大而衰老，因此TSS 含量可反映果實的營養價值和果實品質[25-26]。本研究結果顯示，貯藏期間香蕉果實TSS 含量呈上升趨勢，正己醇處理在貯藏后期極顯著抑制了香蕉可溶性固形物含量上升（P<0.01），從而維持采后香蕉貯藏品質，延長果實貨架期。李英華[27]研究發現，正己醇處理顯著延緩采后草莓果實軟化、抑制MDA 累積，但對草莓TSS 含量的影響不顯著。

呼吸強度和病情指數是衡量果實采后貯藏期間的重要指標[22，28]。本研究結果表明，與對照組相比，正己醇處理在貯藏期間可有效抑制采后香蕉果實呼吸強度和病情指數的上升，維持果實貯藏品質，其中，貯藏后期抑制效果極顯著（P<0.01）?；魬椘餥12]研究了不同濃度正己醇對采后桑葚的影響，發現1.5 mL/L 和1.0 mL/L 正己醇抑制采后桑葚呼吸強度的效果最佳。

丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的產物，可反映膜脂過氧化的程度[29]。果實采后的成熟衰老與膜脂過氧化反應密切相關，機械傷等非生物性逆境脅迫會促進膜脂過氧化反應，造成膜透性增大，電解質外滲，因此相對電導率可間接反映果實的膜透性[30-32]。本研究結果顯示，貯藏0 d 時，香蕉MDA 含量和相對電導率均較低，說明此時香蕉細胞膜完整性良好，過氧化程度不大。隨貯藏時間增加，果實逐漸成熟衰老，香蕉MDA 含量和相對電導率呈上升趨勢，正己醇處理組MDA含量和相對電導率在貯藏后期顯著低于對照組（P<0.05），說明果實的成熟衰老會引起果實膜透性的改變，正己醇處理可有效抑制果實MDA 含量上升和膜透性的增大，從而延緩果實衰老的進程。

當果實衰老或遭受機械損傷等逆境脅迫時，會引起細胞膜發生膜脂代謝，促進果實衰老[33]。磷脂是細胞膜的重要組成成分，PLD 是膜脂代謝過程中的關鍵酶，被激活的PLD 可催化磷脂水解，進而破壞膜結構和膜功能，因此，PLD 的活性可反映磷脂的降解程度。蟠桃[11]、青棗[34]和南果梨[35]的研究中表明，PLD 活性上升，膜脂代謝變快，說明PLD 在膜脂代謝中有重要作用。

本研究結果顯示，正己醇處理顯著抑制了PLD 活性的上調（P<0.05），與對照組相比，正己醇處理在貯藏結束時極顯著抑制了PLDγ 和PLDζ的表達量（P<0.01），表明PLD 抑制劑正己醇可有效延緩采后香蕉果實膜脂代謝的進程。李銀[11]研究發現，正己醇和正己醛處理均可抑制PLD 活性，提高抗氧化酶系活性，延緩果實軟化，維持果實采后品質。

綜上，正己醇處理可有效抑制采后貯藏期間香蕉果實的呼吸作用，減輕果實病情指數，從而延緩香蕉果實軟化的進程和減慢TSS 的產生；另一方面，采后正己醇處理能有效抑制PLD 活性，從而降低MDA 含量和膜透性增大，并下調PLDγ和PLDζ 表達。因此，正己醇處理能夠降低機械損傷對采后果實生物膜的影響，保護膜結構和膜功能，延長采后果實的貯藏期限，是維持機械傷香蕉采后貯藏品質的新方法。但正己醇處理延緩果實衰老的機理是否與果實本身抗氧化相關酶活性的提高有關，這有待于進一步研究。