蒙藥復方沙棘顆粒劑中甘草酸單銨鹽、總黃酮的含量測定

王海榮 孟柯 特格喜白音 趙巖 烏日娜

【摘 要】

目的：建立蒙藥復方沙棘顆粒劑中甘草酸單銨鹽、總黃酮的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜法，C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）為色譜柱，以乙腈-0.05%磷酸溶液（38∶62）為流動相，體積流量為1.0 mL/min，進樣量為10 μL，在252 nm波長下測定甘草酸單銨鹽含量；利用紫外可見分光光度法，以蘆丁為對照品，在510 nm波長下檢測蒙藥復方沙棘顆粒劑總黃酮含量。結果：甘草酸單銨鹽對照品在0.053～0.530 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系，Y=11.003X+0.0031， r=1，平均回收率為105.9%， RSD =1.22%（n=6）；蘆丁對照品在2.0～80.0 μg/mL范圍內與吸光度值呈良好的線性關系，線性回歸方程為Y=11.537X+0.0014，r=0.9999，平均回收率為99.20%， RSD 值為0.54%（n=6）。結論：該方法操作簡便，準確，具有良好的精密度、重復性和穩定性，適用于蒙藥復方沙棘顆粒劑的質量控制。

【關鍵詞】

蒙藥復方沙棘顆粒劑；甘草酸單銨鹽；總黃酮；含量測定；質量標準

【中圖分類號】R29?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2024）07-0037-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.07.zgmzmjyyzz202407009

Determination of Monoammonium Glycyrrhizinate and Total Flavonoids in Compound Shaji Granules

WANG Hairong1，4 MENG Ke2* Tegexibaiyin3，4 ZHAO Yan4 Wurina2

1.Inner Mongolia Traditional Chinese and Mongolian Medical Research Institute，Hohhot 010010， China;

2.Ordos Institute of Mongolian Medicine， Ordos 017010， China;

3.Affiliated Hospital of Inner Mongolia University for the Nationalities，Tongliao 028007，China;

4.Inner Mongolia International Mongolian Hospital，Hohhot 010065，China

Abstract：

Objective To establish a method for the content determination of monoammonium glycyrrhizinate and total flavonoids in compound Shaji granules.Methods The content of monoammonium glycyrrhizinate was determined by HPLC with C18250 mm×4.6 mm， 5 μm）was used as chromatographic column， acetonitrile-0.05% phosphoric acid （38∶62） as mobile phase， volume flow rate was 1.0 mL/min， injection volume was 10 μL and wavelength was 252 nm.The total flavonoids was determined at 510 nm by UV with rutin as the control.Results Monoammonium glycyrrhizinate had a good linear relationshipin the range of 0.053-0.530 μg.The linear regression equation was Y=11.003X+0.0031， r=1. The average recovery was 105.9%， RSD=1.22% （n=6）.The rutin reference substance showed a good linear relationship with the absorbance value in the range of 2.0-80.0 μg/mL. The linear regression equation was Y=11.537X+0.0014， r=0.9999.The average recovery was 99.20%， RSD=0.54% （n=6）.Conclusion The method is simple， accurate， with good precision， repeatability and stability.It is suitable for the quality control of compound Shaji granules.

Keywords：

Mongolian medicine compound Shaji granules; Monoammonium glycyrrhizinate; Total flavonoids; Content determination; Quality standard

蒙藥復方沙棘顆粒劑組方含沙棘、甘草、白葡萄干、石膏、北沙參、廣木香、紫草茸、石榴等15味藥材［1］。具有清熱、止咳、利痰、平喘功能。用于急慢性支氣管炎、肺結核、咽喉炎等見肺熱痰多、久咳喘促、胸脹痰稠［2-3］。目前，復方沙棘顆粒劑相關文獻報道較少，質量控制相對薄弱，烏興榮［4］對復方沙棘顆粒劑中異鼠李素的含量進行了測定，但未見以主要藥效成分為指標成分的質量控制方法研究報道。沙棘為蒙藥復方沙棘顆粒處方中君藥，具有止咳祛痰，活血散瘀作用，其主要藥效成分為黃酮類，具有抗菌［5］、抗炎［6］的作用。甘草為蒙藥復方沙棘顆粒處方中臣藥，具有止咳、化痰，清熱解毒作用，其主要藥效成分為三萜皂苷類、黃酮類化合物［7］。甘草酸為齊墩果烷型五環三萜類化合物，具有抗菌［8］ 、抗炎［9］作用，多以鹽的形式存在于藥材或復方制劑中。本課題組前期研究已證實，甘草酸在復方沙棘顆粒劑中以甘草酸單銨鹽形式存在。本實驗采用紫外可見分光光度法測定復方沙棘顆粒劑中總黃酮的含量，采用高效液相色譜法測定制劑中藥效成分甘草酸單銨鹽的含量，為該制劑質量標準提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技）；KQ-500DE型超聲波清洗機（昆山超聲儀器有限公司）；BT25S型電子天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司）；UV-1800B型紫外可見分光光度計（上海普美達儀器有限公司）。

1.2 試藥 甘草酸單銨鹽對照品（成都樂美天醫藥科技有限公司，批號：DST200301-008），蘆丁對照品（成都樂美天醫藥科技有限公司，批號：DSTDL001601），亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均購于天津市風船化學試劑科技有限公司，均為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。

1.3 分析樣品 蒙藥復方沙棘顆粒劑（鄂爾多斯市蒙醫研究所，批號：22107010，22207015，22207017）。

2 方法與結果

2.1 甘草酸單銨鹽測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱選用Thermo scientific C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）;流動相為乙腈：0.05%磷酸溶液，體積比為38∶62；檢測波長為252 nm，流速為1.0 mL/min，進樣量10 μL。

2.1.2 溶液制備

2.1.2.1 對照品溶液制備 精密稱取甘草酸單銨鹽對照品，加入70%乙醇制成每1 mL含0.318 mg甘草酸單銨鹽的溶液。

2.1.2.2 供試品溶液制備 精密稱取蒙藥復方沙棘顆粒劑1 g ，精密加入70%乙醇25 mL，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz） 30 min，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.1.2.3 陰性溶液制備 按處方比例及制備工藝，配制不含甘草的陰性樣品，并按 “2.1.2.2”項下供試品溶液制備方法制成陰性對照液。

2.1.3 方法學驗證

2.1.3.1 專屬性試驗 按“2.1.1”色譜條件測定陰性對照溶液、供試品溶液、甘草酸單銨鹽對照品溶液，結果可見，在與對照品色譜中甘草酸單銨鹽峰對應的位置上，供試品色譜圖檢出色譜峰，而陰性對照樣品在相應的位置上無相應峰出現，說明方中其他藥味對甘草酸單銨鹽的測定無干擾，如圖1所示。

2.1.3.2 線性關系考察 取按“2.1.2.1”項下方法制得甘草酸單銨鹽的對照品溶液（0.053 mg/mL），分別進樣1.0 μL、2.0 μL、4.0 μL、6.0 μL、8.0 μL、10.0 μL，在“2.1.1”項下色譜條件下進行檢測，記錄色譜峰的峰面積。再以橫坐標為甘草酸單銨鹽進樣量（μg），縱坐標為不同進樣體積所對應的色譜峰峰面積繪制標準曲線，結果得甘草酸單銨鹽進樣量在0.053～0.530 μg范圍內，線性關系良好，回歸方程為Y=11.003X+0.0031， r=1。

2.1.3.3 精密度試驗 取按“2.1.2.2供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液，在上述色譜條件，連續進樣6次，記錄每次所測的色譜峰面積。甘草酸單銨鹽峰面積的RSD（n=6）為0.57%，表明儀器精密度良好。

2.1.3.4 穩定性試驗 取同一供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，分別于0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h測定，以甘草酸單銨鹽峰面積計算，其峰面積的RSD為1.8%，室溫條件24 h內，樣品穩定性良好。

2.1.3.5 重復性試驗 取批號為22107010蒙藥復方沙棘顆粒劑，按“2.1.2.2”項下供試品溶液制備法，平行處理6份，按“2.1.1”項下色譜條件測定顆粒劑中甘草酸單銨鹽的含量，計算得甘草酸單銨鹽的含量均值為0.7046 mg/g，RSD為0.41%（n=6），結果表明，該方法具有良好的重復性。

2.1.3.6 回收率試驗 分別精密稱取已知甘草酸單銨鹽含量（0.7478 mg/g）的樣品0.5 g，各6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入濃度為0.4 mg/g的甘草酸單銨鹽對照品1.0 mL（約相當于供試品含有量的50%），按照供試品溶液的制備方法和色譜條件進樣檢測，計算加樣回收率和RSD值。平均回收率為105.9%，RSD為1.22%。表明該方法具有良好的準確度。結果見表1。

2.1.3.7 樣品測定 取不同批次樣品，按上述供試品溶液的制備方法和測定條件，測定了3批蒙藥復方沙棘顆粒劑中甘草酸單銨鹽含量，每批平行測定3份，結果見表2。

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 溶液制備

2.2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取蘆丁對照品5 mg置25 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度，搖勻。

2.2.1.2 供試品溶液制備 精密稱取復方沙棘顆粒劑3 g，加60%乙醇50 mL超聲提取，濾液過濾，取1 mL樣品置10 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，6 min后再加10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，6 min后再加氫氧化鈉試液4 mL，搖勻，加60%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min，即得供試品溶液。

2.2.2 檢測波長確定 取“2.2.1.1”項下蘆丁對照品溶液、“2.2.1.2”項下供試品溶液，用紫外-可見分光光度計在200～600 nm進行全波長測定。結果顯示供試品和對照品溶液均在510 nm處具有較大吸收，故確定檢測波長為510 nm。

2.2.3 線性關系考察 精密量取蘆丁對照品溶液（0.2 mg/mL）0.1 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL分別置于10 mL容量瓶中，各加30%乙醇至5 mL，加5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，6 min后再加10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，6 min后再加氫氧化鈉試液4 mL，搖勻加30%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min。以溶劑為空白，用紫外可見分光光度計在510 nm處檢測其吸光度值，以吸光度Y為縱坐標，測定濃度X（mg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得蘆丁的回歸方程為Y= 11.537X+0.0014，r=0.9999，表明蘆丁含量在2.0～80.0 μg/mL范圍內其質量濃度與吸光度呈良好線性關系。

2.2.4 精密度試驗 取蒙藥復方沙棘顆粒劑（批次為22107010）1份，按照“2.2.1.2”方法制備供試品溶液，重復測定6次。峰面積的RSD（n=6）為0.05%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復性試驗 精密取蒙藥復方沙棘顆粒劑（批次為22107010）6份，按照“2.2.1.2”方法制備供試品溶液，測定吸光度，計算顆粒劑中總黃酮含量，得含量平均值為12.141 mg/g， RSD為0.94%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.2.6 穩定性試驗 精密吸取“2.2.1.2”方法制備的供試品溶液1.0 mL置于10 mL容量瓶中，按“2.2.1.2”項下靜置20 min、25 min、30 min、35 min、40 min、45 min、50 min、55 min、60 min后，在510 nm波長處測定吸光度值， RSD為1.48%，表明供試品溶液在60 min內穩定性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 取已知總黃酮含量的復方沙棘顆粒劑（批號為22107010）研細藥粉約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入一定量的蘆丁對照品（加入量與樣品中蘆丁含量比例約1∶1），照“2.2.1.2”項下供試品溶液制備方法自“60%乙醇50 mL超聲提取”起，制備回收率供試品溶液，平行制備6份，在波長510 nm下測定吸光度值，記錄吸光度值，計算回收率，結果平均回收率為99.20%， RSD值為0.54%（n=6），說明該方法準確度良好。

2.2.8 樣品測定 取不同批次樣品，按照“2.2.1.2”方法制備供試品溶液，測定3批蒙藥復方沙棘顆粒劑中總黃酮含量，每批平行測定3份，結果見表3。

3 討論

蒙藥復方沙棘顆粒劑處方中君藥沙棘和臣藥甘草，均富含黃酮類化合物，黃酮類化合物具有抗炎、抗菌作用，故選擇總黃酮為指標成分，測定其含量可有效反映復方沙棘顆粒劑的質量。本文建立的紫外可見分光光度法，以蘆丁為對照品，在510 nm波長下檢測蒙藥復方沙棘顆粒劑總黃酮含量，方法操作簡便、準確可靠。HPLC法測定甘草酸單銨鹽含量時，首先參考2020年版《中華人民共和國藥典》一部藥典“甘草”項下甘草酸單銨鹽含量測定方法［10］，流動相為乙腈-0.05%磷酸溶液，梯度洗脫時甘草酸單銨鹽色譜峰未能與其他干擾峰得到很好的分離。經過色譜條件探索，在不改變流動相組成的前提下將梯度洗脫改為等度洗脫，流動相比例調整成38∶62時，待測成分能夠達到基線分離且峰形良好，陰性無干擾，可用于測定蒙藥復方沙棘顆粒劑中甘草酸單銨鹽的含量。

綜上所述，本研究所建立的 HPLC 法和紫外可見分光光度法快速簡便、準確度高、重復性好，為蒙藥復方沙棘顆粒劑質量控制提供了科學依據。

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（收稿日期：2023-07-25 編輯：劉 斌）

基金項目：

2017年內蒙古自治區科技計劃項目“蒙藥復方沙棘顆粒劑新藥研究”。

作者簡介：

王海榮（1987—），女，蒙古族，碩士，副主任藥師，研究方向為中（蒙）藥分析與質量控制。E-mail： 562322818@qq.com

通信作者：

孟柯 （1962—），男，蒙古族，本科，主任醫師，研究方向為民族醫學。E-mail： munh_9017@163.com