Wnt信號通路在急性心肌梗死中的研究進展

楊壽娟 張海濤 崔明麗 王建 李洋 程艷麗

1濱州醫學院附屬醫院心內科，濱州 256603；2濱州醫學院附屬醫院神經外科，濱州 256603

急性心肌梗死（AMI）是常見的急性心血管事件之一，通常是動脈粥樣硬化斑塊不穩定發展的結果，即纖維帽破裂并將斑塊的內容物釋放到血液循環中［1］。然而，心肌梗死也可能是斑塊侵蝕所致的遠端栓塞或冠狀動脈痙攣的結果［2］。由于血液流動中斷，受缺血影響的心臟區域缺乏氧氣和營養物質，導致該區域的心肌細胞壞死。

盡管在心臟中發現了干細胞，但梗死區域的修復并不會引起壞死的心肌明顯再生［3］。最初的反應包括多形核中性粒細胞和巨噬細胞的炎癥反應，這些細胞的功能是清除梗死區域的壞死碎片，這是修復梗死區域重要的第一步。炎癥階段之后是肉芽組織的形成，肉芽組織通常富含肌成纖維細胞和新形成的血管，嵌在組織疏松的細胞外基質中。肉芽組織中的肌成纖維細胞有不同來源，如原位成纖維細胞、循環成纖維細胞或內皮上皮間質轉型（EMT）的心外膜細胞。由于其獨特的收縮和基質合成特性，肌成纖維細胞在替代丟失的心肌細胞過程中發揮著重要的作用［4］。肉芽組織的肌成纖維細胞減少，細胞外基質的數量和交聯增加，逐漸發展為瘢痕組織［5］。

Wnt 信號通路（Wingless Integrated signaling pathway）是由多種信號分子介導的信號轉導途徑的復雜集合，參與調控細胞的生長、增殖、分化、癌變、凋亡、應激等多種病理過程，是調控心臟和血管發育的重要信號通路。Wnt 通路經合成Wnt 蛋白影響下游的信號分子產生級聯反應，最終調控靶基因的表達。Wnt 信號傳導不僅具有大量配體、受體和協同受體的特征，而且可以在許多不同的水平上進行調控。Wnt 信號通路可分為經典通路和非經典通路。在經典通路中，Wnt/β-連環蛋白（β-catenin）信號組成成分包括Wnt 配體、卷曲蛋白（FZD）家族受體、低密度脂蛋白受體相關蛋白5（LRP5）、LRP6、β-catenin 破壞復合物［包括軸蛋白（Axin）復合物、大腸腺瘤性息肉病基因產物（APC）、酪蛋白激酶（CK）1α 和糖原合酶激酶3（GSK3）］、鈣粘蛋白相關蛋白（如β-catenin）、T 細胞因子（TCF）和淋巴增強因子（LEF）等。當存在Wnt信號時，Wnt配體與LRP-5/6受體和FZD受體的結合觸發了β-catenin 依賴性信號通路，激活Dishevelled（DVL）蛋白，導致Axin、CK1α和APC組成的復合物募集到受體，通過基因轉導以及TCF/LEF 轉錄因子誘導Wnt 最終作用的目標基因轉錄，誘導后續細胞反應的發生。非經典通路可以分為平面細胞極性通路（PCP）和Wnt/Ca2+信號途徑。其組成是Wnt 配體以及FZD 家族受體、蛋白質酪氨酸激酶等信號物質。通過這些信號物質的層層傳遞，最終觸發PCP 信號通路。在體內還通過受體FZD 及配體的結合激活整個Wnt/Ca2+信號通路［5］。從以下幾個方面闡述Wnt信號通路在AMI發展過程中發揮的重要作用。

Wnt表達和分泌的調節作用

Wnt 信號在心臟發育過程中特別活躍，相比之下，健康成人心臟中的Wnt 信號通路是靜止的，而心肌梗死后這條信號通路會被激活，因此可以通過干預該途徑，進而促進心肌梗死后梗死區的愈合［6］。這種變化發生在心臟的病理重塑過程中，許多胎兒基因包括Wnt信號的成分被重新激活。在心肌梗死小鼠模型中，通過冠狀動脈的手術結扎模擬了人類心肌梗死的潛在病理，調控Wnt 通路多個基因的表達已被報道，這包括Wnt2、-4、10-b 和-11 的表達上調和Wnt7b 的下調；此外，發現FZD1、-2、-5、-10 的表達增加，FZD8 的表達降低［7-8］。Mizutan M 等［9］使用原位雜交技術監測新生小鼠低溫損傷模型中19 個Wnts 的表達，研究發現，損傷心外膜層的Wnt2b 和Wnt5a 以及Wnt9a 表達上調的程度較低，Wnt3a、-4、-5b、-6、-8a、-9b 和-10b 在損傷心肌中表達上調，而Wnt8b、-10a、-11 和-16 在損傷心肌和未損傷心肌中表達相似。這些結果證明了Wnt信號在損傷心肌中的調節作用，也強調了年齡（新生兒與成人）和損傷模型（低溫損傷與冠狀動脈結扎）對Wnt 基因表達模式的潛在影響［10］。

既往研究探討了調控Wnt表達或分泌對梗死愈合的影響［11］。對心肌細胞特異性過表達Wnt10b 的小鼠模型進行冠狀動脈結扎和冷凍損傷，觀察到梗死區新生血管的增加，瘢痕變小，肌成纖維細胞減少，心室功能改善［12］。在小鼠心肌梗死模型中也報道了類似的有益結果，該模型中Wnt11 通過腺相關病毒介導的過表達而過表達，梗死心臟的炎癥反應顯著減少［8］。巨噬細胞特異性缺失Wnt 配體轉運蛋白Wntless（WLS）（csfm-icre；Wlsfl/fl小鼠）也可導致炎癥反應減弱和新生血管增加。WLS 缺陷巨噬細胞顯示出M2表型，可刺激修復和生成血管［13］。通過對小鼠心肌梗死模型靜脈注射膜結合 O- 酰基轉移酶（PORCN）抑制劑GNF-6231 來干擾Wnt 蛋白的脂化，還可以減少梗死面積，抑制不良重構，并減少心功能下降。在心肌梗死誘導后1 周，PORCN 抑制劑Wnt-974 被口服灌胃給梗死小鼠。研究人員觀察到心肌的促再生反應和膠原蛋白Ⅵ依賴的抗纖維化治療效果，認為PORCN 抑制可能是一種有前途的治療策略，以阻斷心肌梗死患者的病理重塑［14］。另一方面，在梗死區域的邊界直接注射重組Wnt3a 蛋白，已證明對梗死愈合有不利影響，因為這種治療被發現可以抑制心臟側群細胞的增殖［11］。從這些研究中可以得出結論，對Wnt 的處理和分泌進行更全面的干預會導致更好的梗死愈合，但需要更多的研究來確定單個Wnt基因對傷口愈合過程的積極和消極作用。

分泌卷曲相關蛋白（sFRPs）水平的調節

sFRPs 被認為是主要作為Wnt 信號的負調節因子。Barandon 等［15］證實了心肌梗死后sFRP1 的表達上調，在過表達sFRP1 的牛同源物FrzA 轉基因小鼠中，證明了FrzA 對心肌梗死后的梗死面積和心功能存在有益作用，有益作用可歸因于心肌細胞凋亡、細胞浸潤和改善瘢痕中的毛細血管密度。將過表達sFRP1 的小鼠骨髓細胞移植到野生型白受體中，隨后進行心肌梗死，也得到了類似的結果［7］。sFRP1 能夠通過促炎性細胞因子和抗炎性細胞因子表達的平衡來減少缺血后中性粒細胞浸潤，從而減少瘢痕形成、降低心臟破裂發生率和維持心臟功能［16］。據報道，在中國漢族人群中，sFRP1 基因變異與心肌梗死風險增加相關［17］。在缺血/再灌注損傷小鼠模型中，也描述了sFRP5 的抗炎和抗凋亡作用，支持sFRPs對梗死愈合的有益作用［18］。

sFRP2 被證明是干細胞分泌的一種旁分泌因子，可激活心肌細胞中的抗凋亡基因表達譜［19］。據報道，在大鼠梗死心肌中直接注射重組sFRP2 具有抗纖維化和改善心功能的作用［20］。研究還發現，sFRP2 有助于間充質干細胞（MSCs）的植入，而在梗死小鼠的邊界區注射過表達sFRP2 的MSCs 可以促進傷口愈合和改善心臟功能［21］。另一方面，與野生型相比，缺乏sFRP2 基因的小鼠在心肌梗死后也顯示出纖維化減少和心功能改善［22］。這些不同研究的矛盾結果可以用sFRPs 的多種作用模式來解釋，一些關于sFRPs 的研究也給出了相互矛盾的結果，基于許多研究，人們提出了四種sFRPs 調節Wnt 信號的機制，其中兩種是抑制的，兩種是促進的：（1）通過清除Wnt 蛋白，抑制信號，因為Wnt 無法與受體相互作用；（2）形成同源或異質sFRP 復合物，有利于Wnt 信號；（3）與FZD 的半胱氨酸富集區（CRD）直接相互作用，抑制Wnt 信號；（4）將Wnt 與網絡相關基序結合，將Wnt呈現給FZD的CRD，刺激Wnt信號［23］。

對受體復合體的干預

Wnt受體復合物是由與受體LRP5/6或受體酪氨酸激酶樣孤核受體2（ROR2）密切相關的FZD 蛋白家族成員組成的。利用永久性冠狀動脈結扎誘導的心肌梗死大鼠模型，描述了Wnt/FZD 信號系統成員FZD2的表達上調，在心肌梗死后7 d 達到峰值。FZD2 的最高表達最初定位于梗死邊界區，并向梗死中心擴展，伴有肌成纖維細胞浸潤［24］。通過無偏性G 蛋白偶聯受體反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）篩選，證實了FZD2 和-4 在心臟成纖維細胞中的高水平表達［25］。在大鼠心肌梗死模型中觀察到信號轉導分子DVL1 類似的表達動力學，支持了傷口愈合過程中激活Wnt信號的概念［26］。后有研究表明，心肌梗死后，更多FZD家族成員的表達受到調控：FZD1、-2、-5 和-10 表達上調，而FZD8在心肌梗死后7 d表達下調［15］。

目前，在FZD 受體水平上對Wnt 信號傳導的藥物干預選擇非常有限，研究表明Wnt3a和Wnt5a肽段對Wnt信號通路有拮抗作用；在永久性冠狀動脈閉塞小鼠模型中測試了皮下輸注UM206（Wnt5a的13個氨基酸肽）對梗死愈合的影響。在心肌梗死誘導后直接開始，通過滲透性微型泵給藥，并在心肌梗死后5 周評估其效果；UM206 可減少左心室擴張，改善心臟功能，防止心力衰竭的進展；組織學分析顯示，梗死面積更小、更厚，肌成纖維細胞數量增加［27］。在UM206 處理的心臟缺血/再灌注損傷的豬中也觀察到梗死擴展的衰減，并隨訪5 周；然而，在這項研究中，梗死區域的肌成纖維細胞數量減少，正如在小鼠中觀察到的；此外，UM206治療組的心功能并不比對照組好［28］。在這兩項研究中觀察到的梗死擴展衰減表明，Wnt 通路可能是改善梗死愈合和抑制心肌梗死后重構的一個希望靶點。

近幾年的研究中，研究了LRP5/6 共受體對梗死愈合的影響［29］。這些輔助受體特異性參與了Wnt/β-catenin 信號轉導。在豬缺血再灌注模型中，發現LRP5僅在高膽固醇飲食喂養的動物中表達增加，而在正常膽固醇飲食組中沒有增加［30］。β-catenin 向細胞核的易位，以及Wnt 靶基因骨橋蛋白和骨形態發生蛋白2 的表達增加，證實了該組Wnt/β-catenin信號通路的激活，同時發現LRP5的缺失對小鼠的梗死愈合有不良影響；此外，與擴張型心肌病相比，缺血性心肌病移植的人類心臟表達更高水平的LRP5 和β-catenin［31］。這些結果可以通過攜帶心肌細胞特異性LRP5 和6 缺失的小鼠來證實［32］。迄今為止，沒有關于共受體ROR2在梗死愈合中的作用研究發表。

在最近的研究中，LRP5/6 抑制劑家族血清分泌型蛋白（DKK）成員在心肌梗死中的作用已被闡明；與非ST 段抬高心肌梗死患者相比，ST 段抬高心肌梗死患者血漿DKK1 水平更高，可作為主要不良心血管事件的獨立預測因子［33］。在小鼠梗死區邊緣注射純化的DKK1 蛋白可加重缺血損傷，并在心肌梗死后4 周增加纖維化標志物的表達，然而這種治療并不影響心功能［32］。研究發現，DKK1 和DKK2 對血管生成有相反的作用，而在邊緣區注射DKK2 蛋白可增強梗死區域的新生血管形成，同時改善心臟功能［34］。在培養的心臟成纖維細胞中，DKK2 以Wnt/β-catenin 依賴的方式減少肌成纖維細胞的增殖和分化，這種效應可以被微小RNA-154 的過表達所拮抗［35］。研究發現，DKK3 基因的整體缺失可促進細胞凋亡、炎癥和重構，心肌細胞特異性過表達DKK3［α-肌球蛋白重鏈（α-MHC）啟動子］則產生相反的作用［36］。在一項基于適配體的心血管疾病候選生物標志物的研究中，DKK4 在肥厚性心肌病患者計劃的室間隔消融（一種引起心臟缺血的手術）后10 min 和60 min 上調，在發生自發性心肌梗死的心血管疾病患者Wnt 信號通路中，可證實循環中的DKK4 水平升高［30］。雖然這些研究并沒有顯示DKK 家族的不同成員在梗死愈合中的統一作用，但它們清楚地強調了Wnt/β-catenin 信號在與心臟重塑和梗死愈合相關過程中的重要性。

β-catenin破壞復合體

在靜息狀態下，β-catenin 不斷被β-catenin 破壞復合物降解，保持其細胞內較低水平。這涉及到CK1和GSK3隨后的兩個磷酸化步驟，分別為該蛋白準備泛素化和降解。利用遺傳模型研究了GSK3 的兩種亞型（GSK3α 和-β）在心肌梗死后重塑中的作用。由于完全敲除GSK3β 是胚胎致命的，這些研究使用了誘導型心肌細胞特異性GSK3β 缺失［α-MHC 啟動子控制下的Cre 重組酶（mer-Cre-mer）］［37］。盡管梗死面積相似，在心肌梗死后5 d基因缺失導致心肌梗死后8 周時與對照組相比，GSK-3α 的心臟特異性敲除小鼠的左室擴張減少，左室功能保存更好。誘導遠端心肌肥厚可能支持其對心功能的有益作用［38］。與GSK3β 相比，GSK3α基因的整體缺失并不影響小鼠的發育或壽命［37］。然而，當這些小鼠發生心肌梗死時，我們觀察到梗死引起的心臟破裂導致死亡率增加，左室擴張增強和心功能減弱。此外，由于梗死邊界區細胞凋亡增加，梗死面積增加［39］。值得注意的是，心肌細胞特異性缺失GSK3α 對梗死愈合有相反的作用，它能更好地保護心功能，并在邊緣區有更多存活的心肌細胞［38］。后者可能與心肌細胞凋亡減少和心肌細胞增殖率升高有關［40］。然而，心肌細胞特異性缺失GSK3α 和GSK3β［α -MHC 啟動子控制下的 Cre 重組酶（mer-Cre-mer）］，導致左心室自發性擴張和心功能下降［41］。由于這兩個GSK3 同源物非常相似，且沒有亞型特異性藥物，這一觀察結果可能會質疑GSK3抑制劑在AMI治療中的有效性［37］。

目前暫無研究表明通過基因干預來解決CK1在梗死愈合中的作用。然而，另一種替代和轉化上有趣的方法是使用食品和藥物管理局批準的化合物吡啶。該化合物被登記為一種抗蠕蟲藥物，但它已被證明通過激活半抑制濃度約為10 nm的CK1α來抑制Wnt信號通路［42］。心肌梗死后30 d，單次心肌內注射吡啶可增加分化心肌細胞的增殖，改善不良心臟重構，并限制左室擴張。然而，由于心內給藥吡啶的毒性，死亡率增加，且沒有發現心功能的顯著改善［43］。在另一項研究中，吡啶被證明可以降低心臟成纖維細胞的存活率，特別是在低糖條件下；梗死后第1 天至第14 天口服磷酸吡啶懸液可減少心肌梗死后第4天和第14天梗死心臟纖維化和瘢痕形成，且射血分數優于小鼠；研究還表明，口服將是該藥物的優先給藥途徑［44］。

β-Catenin介導的基因轉錄

在Wnt/β-catenin 信號通路中，β-catenin 的核積累和參與增殖和信號蛋白存活的基因轉錄調節是Wnt/β-catenin信號通路的最后步驟。Wnt/β-catenin報告基因小鼠的可用性為觀察梗死區β-catenin 介導的Wnt 信號通路激活提供了機會。通過使用由Axin2啟動子驅動的報告基因β-半乳糖苷酶基因（LacZ）小鼠，發現邊界區的LacZ+細胞數量在心肌梗死后第7 d至第21 d之間顯著增加。共染色結果顯示，LacZ+細胞共表達造血干細胞抗原（造血干細胞）、血小板內皮細胞粘附分子（CD31）（內皮細胞）、白細胞共同抗原（白細胞）、血管性血友病因子（內皮細胞）和a-平滑肌肌動蛋白（肌成纖維細胞），表明Wnt 信號在多種細胞類型中被激活［45］。在一個LacZ 表達由TCF/LEF 反應啟動子（TOPGAL小鼠系）驅動的模型中，其梗死的邊界區和心外膜側可觀察到類似的LacZ 表達，心肌梗死后誘導內皮到間充質轉化（EMT），并導致心肌梗死后心臟纖維化［46］。心臟纖維化是心肌梗塞后的修復過程，引起心臟重塑，最終導致心力衰竭。心肌梗死后血漿中Wnt 信號拮抗劑sFRP3 顯著下降，AMI 后血漿中sFRP3 的降低通過增加轉錄因子叉頭框蛋白M1（FOXM1）促進二尖瓣瓣膜內皮細胞的EMT。心肌梗死后，恢復sFRP3 水平或抑制FOXM1 可能提供了一種調節二尖瓣中EMT 以預防缺血性二尖瓣反流和心力衰竭的新策略［47］。最近，在TCF/LEF 敏感啟動子的大鼠模型中，使用了由鐵結合人鐵蛋白重鏈和綠色熒光蛋白（GFP）組成的MRI探針，該結構通過9 型腺相關病毒載體局部注射傳遞到梗死心臟［48］。心肌梗死后4 周，在轉導心臟梗死的邊界區可檢測到鐵的積累。組織學分析證實了鐵和GFP 信號的共定位。使用化合物SEN195 抑制Wnt/β-catenin 信號，完全消除鐵信號。聯合研究為心肌梗死后第1 周梗死邊緣的Wnt/β-catenin 信號激活提供了證據，涉及多種細胞類型［48］。

鋅指蛋白667（ZNF667）是一種廣泛表達的N端含有KRAB結構域、C端含有多個C2H2型鋅指結構的KRAB/C2H2-鋅指轉錄因子型，可預防缺氧缺血性心肌損傷。研究報道了AMI 小鼠心臟中CD31 陽性內皮細胞中ZNF667 的表達上調，缺氧激發（1%氧氣）以時間依賴性方式促進ZNF667在人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）中的mRNA 和蛋白質表達；此外，ZNF667 促進了缺氧誘導的HUVECs 侵襲和血管形成，ZNF667通過血管抑制素1的轉錄抑制和Wnt信號通路的調節促進心肌缺血驅動的血管生成。促血管生成被認為是治療AMI的一種希望策略［49］。

在心肌細胞和心臟成纖維細胞中，β-catenin 組成活性形式的腺病毒基因轉移誘導心肌細胞增殖，而在前一種細胞類型中觀察到肥大和雙核。在成纖維細胞中，觀察到肌成纖維細胞的分化增強。在梗死大鼠心臟的邊界區注射腺病毒，由于心肌成纖維細胞和心肌細胞的凋亡與細胞周期激活減少，導致梗死面積減小［50］。研究表明，在心臟缺血再灌注損傷過程中，甲基轉移酶樣蛋白14（Mettl14）通過甲基化Wnt1 mRNA，以N6-甲基腺苷依賴的方式上調Wnt1蛋白表達，激活Wnt/β-catenin 信號通路，從而減輕心肌缺血/再灌注時心肌細胞損傷和心功能障礙，因此Mettl14 有望成為缺血性心臟病的治療靶點［51］。然而，心肌細胞特異性β-catenin 缺失（aMHC-Cre PR1 模型）也被報道對存活和左心室功能產生有益的影響，此外小分子Wnt 信號抑制劑CDMG1，β-catenin 水平降低的梗死心臟顯示心肌細胞產生增加和纖維化減少，CDMG1 治療后左心室射血分數明顯增加［52］。小分子Wnt信號調節劑ICG-001對β-catenin介導的轉錄進行藥理學抑制，導致雌性大鼠心肌梗死10 d后射血分數提高［53］。基于這些研究的綜合結果，在心肌梗死后是否應該刺激或抑制β-catenin 信號有待進一步深入研究。

AMI 引起的缺血性壞死通常是不可逆的，而心肌細胞自身再生能力有限。干細胞作為一種未分化的細胞，能夠分化成具有特殊功能的各類成熟細胞［54］。目前，在MSCs治療AMI 研究比較多。骨髓間充質干細胞移植可用于治療AMI，且通過激活Wnt/β-catenin通路實現［55］。

綜上所述，Wnt 信號機制在心肌增殖、分化、修復、重構等病理生理過程中均起著重要作用，Wnt 信號經典通路與AMI 關系緊密，明確Wnt 通路的信號網絡及作用機制，抓好通路的每一個重要節點，將為AMI 的精準治療提供更多新思路和可能性。

作者貢獻聲明楊壽娟：起草文章，對文章的知識性內容作批評性審閱；張海濤、崔明麗：采集數據；王建、李洋：分析/解釋數據；程艷麗：指導，支持性貢獻