水稻矮稈遲抽穗突變體d534 的性狀及其對赤霉素的敏感性分析

曾建光 劉桃李 孫林娟 袁定陽 黃鈺博 金晨鐘 譚炎寧

摘要：水稻半矮稈突變體在株型改良和高產育種中具有重要價值。前期通過輻射誘變秈稻品種五山絲苗（R534）獲得了半矮稈且抽穗期延遲突變體d534，分析了d534 的表型、遺傳模式和GA3敏感性。大田性狀分析發現，和野生型R534相比，d534 的抽穗期延遲了7 d，株高下降了29.22 cm，降幅為26.86%。d534 的穗及倒1至倒5節都明顯縮短，長度分別為野生型的71.27%、68.75%、70.18%、85.17%、77.86%和71.18%，說明d534 的目的基因調控穗及莖節的伸長。遺傳分析發現，d534 的矮化和遲抽穗性狀受同一核基因控制，呈隱性遺傳。內源GA3含量測定發現，一葉一心期d534 莖中GA3含量為0.17 ng·g?1，比R534降低了60.47%，表明d534 的矮化與內源GA3合成不足有關。用25和50 mg·L?1外源GA3處理一葉一心期幼苗5 d，d534 的株高比未處理組（0 mg·L?1 GA3）增加了71.76%和74.98%，且超過了未處理組R534的株高，說明外源GA3能回補d534 的株高表型；qRT-PCR分析發現，與R534相比，d534 莖和葉中OsGA20ox2 和OsGA3ox2 基因表達水平均顯著下調，表明d534 內源GA3合成不足可能與OsGA20ox2 和OsGA3ox2 基因表達水平下調有關。明確了d534 是莖節縮短且內源GA3積累不足的矮化突變體，為解析d534 半矮稈性狀形成的生物學機理奠定了基礎。

關鍵詞：水稻；d534 突變體；半矮稈；遲抽穗；赤霉素

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0649

中圖分類號：S511，Q78 文獻標志碼：A 文章編號：1008‐0864（2024）03‐0007‐08

水稻經濟產量由生物學產量和收獲指數共同決定，株型改良是水稻高產育種的重要內容。與高稈品種相比，半矮稈品種收獲指數較高，耐肥、抗倒性較強，便于機械化收割，已在生產上得到了大面積應用[1]。半矮稈品種的推廣應用引領了“第一次綠色革命”，我國半矮稈水稻育種研究始于20世紀五六十年代。1959年，華南農業科學研究所（現廣東省農業科學院）利用‘矮仔占與‘廣場13雜交培育出半矮稈優質稻品種‘廣場矮，隨后又選育出‘珍珠矮‘廣解9‘廣陸矮系列高產優質半矮稈水稻矮生品種，并在華南地區大面積推廣[2]。1966年，國際水稻研究所利用‘低腳烏尖與‘皮泰雜交，成功培育出優良的半矮稈品種‘IR8，使東南亞的水稻產量顯著提高[3]。

水稻的半矮化主要與赤霉素的合成不足或信號轉導受阻有關。赤霉素的生物合成以牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸為前體，先后經內根-古巴焦磷酸合成酶（copal pyrophosphat esynthase，CPS）、內根-貝殼衫烯合成酶（ent-kaurene synthase，KS）、內根-貝殼衫烯氧化酶（ent-kaurene oxidase，KO）和內根-貝殼衫烯酸氧化酶（ent-kaurenoic acid oxidase，KAO）等的作用逐步轉變為GA12，GA12再經相關氧化酶催化形成GA3和GA1等不同形式的赤霉素[4]。在水稻中，D35編碼KO酶，該基因突變將顯著降低GA12的水平而產生極端矮稈表型[5]；SD1[6]和D18[7]基因分別編碼GA20氧化酶（GA20ox）和GA3氧化酶（GA3ox），其突變將導致活性GA不足而產生半矮稈表型。赤霉素信號轉導通路涉及信號感知、轉導及下游基因的響應過程，其核心模塊是GAGID1-DELLA[8]。GID1 是可溶性GA 受體蛋白，GID1 突變將導致植株對外源GA 不敏感[9]；GID2參與DELLA 蛋白的泛素化降解，GID2 突變將抑制下游GA 響應基因的表達，導致株高極端矮化[10]。

目前，已經利用多種誘變技術獲得了大量的水稻矮化、半矮化突變體，借助這些突變體實現了對赤霉素代謝途徑和株高遺傳調控網絡的深入認識。研究發現，矮化可能伴發分蘗數[11]、葉型[12]、葉色[13]等性狀的變異，但引發花期變異的現象少有報道。本課題組前期通過輻射誘變五山絲苗（R534）獲得了矮化且抽穗延遲的突變體d534，但d534 的生理和遺傳機制還不清楚。為此，本研究對d534 的表型、遺傳和赤霉素敏感性進行了分析，以期為揭示水稻株高降低的形態學和生理學成因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

五山絲苗（R534）是我國南方稻區常用的秈稻恢復系[14]，2018年委托湖南省農業生物輻照工程技術研究中心利用0.30 KGY劑量的60Co-γ輻射R534的成熟種子。參照譚炎寧等[15]的種植和收獲方法，從M2中篩選到1株半矮稈單株，連續自交4代得到穩定遺傳株系，命名為d534。

1.2 表型考查

2022年6月1日，在長沙縣黃花鎮試驗基地同批播種野生型R534和半矮稈突變體d534，6月21日單本移栽大田，每個材料種50株。記載材料的抽穗期；成熟期選取5個單株，測量有效穗和各單株主分糵的株高，分別統計穗和各莖節的長度及主莖各莖節的直徑。

1.3 遺傳分析

2021年3月—2022年9月，在海南三亞和湖南長沙試驗基地分別種植d534 與R534 正交（d534/R534）和反交（R534/d534）后的F1和F2群體。統計F1、F2 群體中突變型（矮化遲抽穗）、野生型（正常株高正?；ㄆ冢﹩沃甑臄盗?，并運用卡方檢驗（χ20.05≤3.84）分析突變型與野生型單株的理論分離比[16]，推測遺傳方式。

1.4 內源GA3含量測定

采用液相色譜- 串聯質譜法（liquidchromatography tandem mass spectrometry， LC-MS/MS）[17]比較分析R534和突變體d534 的內源GA3含量。采集一葉一心期野生型的莖和葉，液氮研磨，以預冷的甲醇浸提0.1 g 樣品16 h，4 000 r·min?1離心15 min，吸取上清于10 mL 容量瓶中，加入2 mL甲醇并用超純水稀釋至刻度線，即得母液。取4 mL母液過混合型陰離子交換固相萃取柱，以甲酸甲醇洗脫后吹干，補超純水至0.5 mL，混勻過濾后待上機分析。

1.5 GA3敏感性測定

選取飽滿一致的R534和d534 種子各300粒浸種催芽，在光照培養室（光照16 h，28 ℃/黑暗8 h，22 ℃）中用木村B營養液（聯邁生物）培養至一葉一心期；然后使用GA3均勻噴霧處理幼苗，以質量濃度0 mg·L?1 為對照組，設置25 和50mg·L?12個處理組。每隔5 d噴施1次GA3，共噴施2次；取5株測量噴施前和噴施后的株高取平均值，計算相對增長率，每個處理重復3次。

1.6 基因表達分析

利用 Trizol提取R534和d534 一葉一心期幼苗莖和葉的RNA，反轉錄獲得cDNA（北京索萊寶科技有限公司），利用引物GA20-F/R（F： 5-TACTACAGGGAGTTCTTCGCGGACAGCA-3；R：5-TGTGCAGGCAGCTCTTATACCTCCCGTT-3）和GA3-F/R（F： 5-CCTTCTTCTCCAAGCTCATGT-3；R：5-CTCCTTGTGAAACTCCTCCATC-3）進行實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RTqRCR）檢測。反應程序為：95 ℃ 10 min；95 ℃15s，62 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40 個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s；40 ℃ 30 s。重復檢測 3次，采用2?ΔΔCT法[18]確定OsGA20ox2 和OsGA3ox2 基因在2個材料莖和葉中的相對表達量。

1.7 數據統計

采用SPSS23.0 軟件單因素方差分析法，對R534和d534 的主要農藝性狀差異、內源GA3含量差異、外源GA3處理下株高表型差異和不同器官中OsGA20ox2 和OsGA3ox2 基因表達差異進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 d534 的主要農藝性狀分析

同期播種R534和d534，R534在 8月24日抽穗，d534 在8月31日抽穗，比R534抽穗期延遲了7 d（圖1）。d534 單株有效穗增加，比R534增加了0.7個（表1）。株高由穗長和莖長共同決定，莖長受莖節數目和各莖節長度的影響。d534 成熟植株的株高為79.58 cm，較野生型R534 降低了29.22 cm，降幅為26.86%（圖1，表1）。d534 穗長為17.56 cm，較R534 下降了7.08 cm，降幅達到28.73%；d534 與R534均具有5個莖節，并且d534各莖節的長度與R534相比顯著降低，其中倒1節和倒2 節下降了11.37 和6.06 cm，降幅分別達到了31.25% 和29.82%，倒3、4、5 節較R534 分別下降了4.5、1.71、1.13 cm（表1），表明d534 突變體穗和所有莖節都發生縮短。另外，與R534 相比，d534 各莖節直徑出現不同程度的增加，倒3、4、5節增加明顯，分別增加了0.17、0.17和0.22 cm，增幅達到33.33%、27.41%和33.33%（表1），倒1節和倒2 節較R534 分別增加了0.08 和0.12 cm，d534的莖節配置特點暗示其可能具有抗倒伏利用潛力。

2.2 d534 的遺傳分析

d534 與野生型R534正交后的35個F1植株和反交后的26個F1植株都表現為野生型（正常株高且正?；ㄆ冢┍硇?；正交 F2群體分離了342個突變型（矮化晚花）和989個野生型（正常株高且正?；ㄆ冢﹩沃辏瑳]有重組出矮化且正常花期、正常株高且遲抽穗類型單株；類似地，反交F2 群體中也只出現突變型和野生型2種表型，未見有重組類型單株，說明矮化與遲抽穗受同一基因控制（表2）。經卡方檢測，突變型與野生型單株的理論分離比符合1：3（χ2 0.05 ≤3.84），表明矮化遲抽穗表型受1個細胞核隱性基因控制（表2）。

2.3 d534 內源GA3含量分析

取一葉一心期幼苗分析了d534 和R534的莖和葉中GA3 含量。野生型R534 莖中GA3 含量為0.43 ng·g?1，d534 為0.17 ng·g?1，較野生型降低了60.47%，差異極顯著。d534 葉中GA3含量為1.25ng·g?1，與R534（1.33 ng·g?1）相當，二者間差異不顯著（表3）。表明d534 的苗期矮化與莖中內源GA3合成不足有關。

2.4 d534 對GA3敏感性分析

在一葉一心期不施GA3條件下，d534 和R534的株高呈現明顯差異，d534 為11.32 cm，較野生型R534（14.14 cm）下降了19.94%（表4）。經25 和50 mg·L?1GA3 處理5 d 后，d534 株高分別達到23.51 和23.88 cm，較對照組（0 mg·L?1 GA3）增加了7.22 和7.59 cm，相對增長率分別為44.32% 和46.59%；處理10 d后，d534 較對照組增長了15.32和16.01 cm，相對增長率為71.76% 和74.98%，說明d534 對外源GA3 敏感。在相同處理條件下，d534 對GA3 的敏感性要明顯強于R534，比如，d534 在25和50 mg·L?1GA3 處理10 d后的相對增長率比野生型R534（61.78% 和65.18%）增加了9.98%和9.80%。還注意到，經25 mg·L?1 GA3處理5或10 d后d534 的株高都超過了未施GA3的R534同期生長幼苗株高（圖2），表明外源GA3 能回補d534 的株高表型。

2.5 OsGA20ox2 和OsGA3ox2 基因表達水平分析

通過實RT-qPCR 分析，比較了d534 和R534間OsGA20ox2 和OsGA3ox2 基因的相對表達量。與R534 相比，d534 莖中OsGA20ox2 和OsGA3ox2表達水平顯著下調，降幅分別為87.74% 和88.14%，差異極顯著；同時期d534 葉中OsGA20ox2 和OsGA3ox2 基因表達量僅為R534的24.02% 和49.88%（圖3）。表明d534 內源GA3 合成不足可能與OsGA20ox2 和OsGA3ox2 基因表達水平下調有關。

3 討論

我國水稻育種經歷了從高稈到半矮稈的過程，目前生產上使用的半矮稈水稻品種株高為90～120 cm[19]，鑒定更優良的半矮稈基因對于選育高產抗倒品種具有重要意義。根據矮化程度可將矮稈資源分為半矮稈、矮稈和極端矮稈3 種類型[20]。矮稈和極端矮稈水稻成熟期株高低于野生型的50%，但過度矮化導致其生物學產量和經濟產量顯著降低而喪失利用價值[21]。半矮稈突變體的株高適當降低，能較好地協調高產與倒伏之間的矛盾而具有應用潛力[22]。d534 是輻射誘變優良常規稻品種五山絲苗（R534）獲得的矮壯型突變體，其成熟期株高為R534的72.22%，基部莖節顯著增粗（表1），具有抗倒伏利用潛力。

不同矮化突變體的莖節縮短特性有所不同：雖然d35、sd1 和d18 的所有莖節都發生縮短，但各莖節的縮短程度有差異；d35 倒1 節縮減幅度最大[23]，sd1 倒2節和倒3節明顯縮短[24]，d18 減少了1個莖節且所有莖節顯著縮短[25]。d534 和R534均為5個莖節，與R534相比，d534 倒1節縮短最明顯，縮減幅度為31.25%（圖1B，表1），其矮化機制與d35 相似但與sd1 不同。d534 各莖節長度縮短的同時莖節直徑有所增加，且越靠近水稻基部的莖節直徑增加幅度越明顯（表1），暗示d534 的矮化有利于增強其抗倒伏能力。

赤霉素是調控水稻株高的重要激素，由赤霉素代謝途徑紊亂所致的水稻矮化突變體既可能對赤霉素敏感，也可能對赤霉素鈍感。赤霉素敏感型突變體是因赤霉素的生物合成途徑受阻而內源赤霉素積累不足所致，若補充外源赤霉素可完全或部分恢復至野生型表型；赤霉素鈍感型突變體可能與赤霉素信號轉導通路受阻有關。半矮稈突變體sd1[26]和d18[27]的株高分別較其野生型降低了33.73%和51.12%，莖中GA20和GA3的含量分別降低了48.14% 和62.36%，與赤霉素合成途徑中GA20氧化酶和GA3氧化酶編碼基因突變有關。本研究中，d534 株高較野生型降低了27.78%，莖中GA3 的含量較野生型降低了60.47%，苗期噴施GA3 后株高顯著增加（表4、圖2），表明d534 屬于赤霉素敏感型突變體，其矮化表型可能與GA3生物合成途徑受到抑制有關。GA20氧化酶和GA3氧化酶編碼基因在植物赤霉素生物合成途徑中起重要作用，參與調控植株高度或莖節伸長[28]。本研究中，d534 莖和葉中OsGA20ox2 和OsGA3ox2 表達水平明顯低于R534，這種表達差異可能影響了d534 內源GA3的生物合成進而導致植株矮化。

水稻矮化可能伴隨其他重要農藝性狀的改變。d53 突變體株高較野生型降低且產生大量分蘗；D53 是感知和響應SL信號的關鍵因子，該基因的突變降低了莖基部中OsCKX9 的表達量，促進細胞分裂素積累，使分蘗增強[11]。本研究中，d534 分蘗能力較R534有所增強，暗示d534 矮桿基因對分蘗具有正向的促進作用。受GA誘導的的MYB 轉錄因子基因GAMYB 是miR319 下游靶基因，gamyb 突變體在營養生長期生長發育不受影響，但轉入生殖生長期后各節間縮短、開花延遲[29]。本研究中，與R534相比，d534 突變體的開花期推遲了7 d，暗示d534 的目的基因導致株高矮化的同時還一因多效的影響了有關開花調控基因的表達。

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（責任編輯：溫小杰）