核桃葉片揮發性成分提取及其驅蚊活性的研究

王茹 楊夢思 張萍 孫雅麗 虎海防

摘要：為篩選具有較強持效性和驅蚊效果的核桃葉片提取物，利用超聲輔助水蒸氣蒸餾法提取‘溫185‘山核桃‘美國東部黑核桃和‘實生核桃葉片揮發油，以核桃葉片揮發油提取率為指標，在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，得出核桃葉片揮發油的最佳提取條件，并結合驅蚊試驗，以驅蚊率為指標，篩選4種核桃葉片提取物的最佳驅蚊含量水平。結果表明，超聲輔助水蒸氣蒸餾法提取‘美國東部黑核桃葉片揮發油的最佳提取條件為提取時間8 h，超聲時間10 min，固液比1∶10（ g·mL-1）；在此條件下，核桃葉片揮發油的提取率為0.475%。以無水乙醇為溶劑將4種核桃葉片揮發油提取物溶液稀釋為10%、20%、30%、40%并測定其溶液的驅蚊率，‘美國東部黑核桃葉片揮發油提取溶液在30%含量水平下驅蚊時間可達20 min，此時驅蚊率為85.18%，驅蚊效果最佳。‘美國東部黑核桃葉片揮發油提取物溶液具有良好的驅蚊效果，具有開發為植物源驅避劑的潛力，可進一步推廣應用。

關鍵詞：核桃葉片；最佳提取條件；活性成分；驅蚊效果

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.0448

中圖分類號：S664.1 文獻標志碼：A 文章編號：1008‐0864（2024）03‐0223‐11

蚊蟲是重要的病媒之一，不僅傳播瘧疾、黃熱病、登革熱等傳染病，而且嚴重威脅人類健康[1]。使用化學殺蟲劑防治是控制蚊蟲危害的重要措施。目前市場上使用的蚊蟲驅避劑主要是化學合成的避蚊胺（N， N-diethyl-3-methyl benzoyl amide，DEET），因其良好的驅蚊作用而被廣泛地用作驅蟲劑，但DEET有毒，對皮膚有刺激作用。化學殺蟲劑的大量、長期使用易引起蚊蟲抗藥性并對環境造成污染，所以研發安全有效、低毒無副作用的驅蚊劑，已成為研究熱點[2]。近年來，國內外學者致力于研究天然殺蟲成分和植物源的天然驅避劑代替殺蟲劑。從植物中提取的揮發性化合物[3‐4]是重要的次生代謝物，是從葉片和植株表層釋放出來的揮發性化學成分，其所含的檸檬烯、石竹烯、α-蒎烯、香葉醇和芳樟醇均有驅蚊效果[5-9]。有學者利用高效液相層析法（high performance liquidchromatography，HPLC）、氣相色譜-質譜聯用（gaschromatography-mass spectrometer，GC-MS）等手段對植物揮發性物質進行分析研究，取得了重大突破。楊中林[10]采用GC-MS分析山雞椒油、薄荷油和月桂油的主要組成成分有肉桂烯、萜品油烯、D-檸檬烯等，并獲得對人體驅蚊效果較好的配方制劑，可作為植物源驅避劑。林琳[11]對側柏、孔雀草、薄荷、驅蚊香草、番茄等不同種類驅蚊材料的驅蚊效果進行了測試，發現5種植物都有一定的驅蚊作用，隨時間的推移驅蚊效果逐漸減弱。Tunón等[12]發現青蒿中的香豆素和側柏醇可作為驅蚊物質。植物源驅蟲劑作為一種天然產品，對環境無害，因此利用植物衍生資源產品開發驅蟲劑，已經成為目前的研究熱點。但是，從天然驅避劑中研制出一種可以取代DEET的高效、廣譜的驅蟲劑，仍然存在著許多問題[13]。比如，在開發的過程中，如何兼顧植物資源的保護，如何利用植物資源，是否對環境產生影響，是否破壞生態平衡，以及能否推廣到工業化生產中，這些問題都要慎重考慮[14]。而在當前的人工合成驅避劑中，尚無性能較好、毒性較低、環境友好的驅避劑。本研究利用超聲波輔助水蒸氣蒸餾提取方法，分別對‘美國東部黑核桃（J. nigra）、‘ 溫185（J. regiaWenl85）、‘實生核桃（J. regia Shisheng）及‘山核桃（C. cathayensis）進行有效成分的提取，結合驅蚊試驗，篩選4種核桃葉片提取物的最佳驅蚊劑量。以期為開展核桃種質資源利用提供參考依據，也為核桃葉片揮發性物質在醫藥、植物源揮發性物質研究和農副產品工業的開發與應用提供參考數據，對實現核桃資源多功能利用和產業可持續發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 驅蚊植物供試材料 石竹烯、香葉醇、芳樟醇、羅勒烯、檸檬烯對白紋伊蚊（Aedes albopictus）具有強殺蚊活性，對新疆佳木果樹學國家長期科研基地的核桃樹進行篩選，選擇‘美國東部黑核桃‘溫185‘實生核桃和‘山核桃葉片為試驗材料。采樣樹齡為9 年，株行距為4 m×6 m，生長健壯、無病蟲害。每個品種選3棵樣樹，樹形為開心形，從東、西、南、北4個方位進行收集，樣品采摘大小相似。于2021年5、6、7和8月底，采摘同一株樹相同部位、無病蟲害且葉片完整的老葉，然后對收集的新鮮核桃葉片進行篩選，去除灰塵及其他雜質，陰干，粉碎，過40目篩，按樣品號分別標記，稱重后備用。

1.1.2 供試蚊蟲 白紋伊蚊在飛凡標準技術服務有限公司養蟲室內飼養。室內溫度（temperature，T）（26±1）℃；相對濕度（relative humidity，RH）65%±10%；光周期（光照/黑暗）12 h/12 h，試驗時選用整齊一致的健康3～5 d齡成蟲。

1.2 核桃葉片揮發物制備

超聲波水蒸氣蒸餾法提取葉片揮發性物質，提取方法如下：準確稱取‘溫185‘山核桃‘實生核桃‘美國東部黑核桃4種核桃干葉片粉末20g，置于圓底燒瓶中，加入定量水，振蕩混勻后置于超聲波清洗器中（超聲頻率40 kHz、輸出功率200W）進行超聲處理，然后將圓底燒瓶放入電熱套并連接冷凝管及揮發油提取器，回流提取。揮發油經無水硫酸鈉干燥后，稱重，根據公式（1）計算提取率[15]，于-4℃保存待用[16]。試驗重復3次，結果取平均值。通過揮發油質量，比較同一種植物的不同提取時間、不同固液比、不同超聲時間的提取率。

1.3 超聲波水蒸氣蒸餾法的正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以超聲時間、提取時間、固液比為考察因素，采用3因素3水平正交試驗，以核桃葉片揮發油提取率為指標，確定最佳提取條件[17]。正交試驗設計見表1。

1.3.1 提取時間對揮發油提取率的影響試驗 稱取核桃葉片20 g，在設定固液比為1∶10（g·mL-1），超聲時間為10 min，超聲功率為200 W，提取時間分別為6、7、8、9 h的條件下，于揮發油提取裝置中提取，研究不同提取時間對揮發油提取率的影響。

1.3.2 固液比對揮發油提取率的影響試驗 稱取核桃葉片20 g，在設定提取時間為8 h，超聲時間為10 min，超聲功率為200 W，固液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20（g·mL-1）條件下，利用揮發油提取裝置提取，研究不同固液比對揮發油提取率的影響。

1.3.3 超聲時間對揮發油提取率的影響試驗 稱取核桃葉片20 g，在設定提取時間為8 h，固液比為1∶10（g·mL-1），超聲功率為200 W，超聲時間分別為5、10、15、20 min 條件下，利用揮發油提取裝置提取，研究不同超聲時間對揮發油提取率的影響。

1.3.4 正交試驗設計優化 采用正交試驗設計，在綜合單因素試驗結果的基礎上，以核桃葉片揮發油的提取率（%）為值，通過正交試驗分析，進行揮發油提取條件的優化[18]。

1.4 驅蚊活性指標測定

1.4.1 驅避液制劑制備方法 將4種核桃葉片提取液使用乙醇稀釋為4 個體積分數處理：10%、20%、30%、40%（以目前市場驅避劑中精油含量為依據），并對其進行蚊蟲驅避試驗測定，篩選出最佳驅蚊效果的含量水平。

1.4.2 驅蚊試驗 實驗室溫度為25～27 ℃，相對濕度為60%～70%。將3個直徑21 cm、長度43 cm的透明圓筒進行串聯，3個圓筒之間用擋板隔開，兩側用擋板擋住，一邊圓筒用透氣紗網封口，中間圓筒預先放100只試驗蚊蟲，另一圓筒放入測試精油并用擋板密封。放入測試精油樣品5 min后，同時抽開3 個圓筒間的2 塊擋板，分別在5、10、15、20、45、60 min時將擋板插回并記錄兩邊圓筒的蚊蟲數量[19]，參照公式（2）計算驅蚊率。

1.5 數據統計分析

采用Excel 2016 進行試驗資料的整理與統計，采用SPSS 26.0進行正交試驗設計及顯著性的差異分析。

2 結果與分析

2.1 提取時間對揮發油提取率的影響

由圖1可見提取時間對核桃葉片揮發油提取率的影響，提取時間6～9 h，核桃葉片揮發油提取率‘ 溫185為0.031 5%～0.037 0%、‘ 山核桃為0.032 0%～0.042 0%、‘ 實生核桃為0.025 0%～0.027 5%、‘ 美國東部黑核桃為0.034 5%～0.043 0%。不同提取時間下各核桃葉片揮發油提取率依次為‘美國東部黑核桃>‘山核桃>‘溫185>‘實生核桃。隨著提取時間的不斷增加，揮發油的提取率先增加后減少，8 h時‘美國東部黑核桃揮發油的提取率最大，為0.043 0%。隨著提取時間的延長，核桃葉片中的揮發油提取率不斷增加，提取時間超過8 h后，揮發油已基本被提取出來，核桃葉片揮發油提取率開始緩慢降低，說明核桃葉片揮發油的最佳提取時間為8 h。

2.2 固液比對揮發油提取率的影響

由圖2可以看出，固液比對核桃葉片揮發油提取率的影響，固液比1∶5～1∶20（g·mL-1）揮發油提取率‘溫185為0.018 5%～0.030 5%，‘山核桃為0.020 5%～0.032 0%，‘實生核桃為0.014 5%～0.027 5%，‘ 美國東部黑核桃為0.023 0%～0.037 5%。在不同固液比下各核桃葉片揮發油提取率依次為‘美國東部黑核桃>‘山核桃>‘溫185>‘實生核桃。隨著固液比中水分的增加，揮發油的提取率先升高后下降，固液比超過1∶10（g·mL-1）之后，揮發油提取率開始下降。隨著固液比中水分的不斷增加，揮發油的釋放空間充足，揮發油量將不會增加，而水溶液過多則會增加揮發油的溶解速度，不易收集水蒸氣，所以隨著固液比中水分不斷增大，當超出一定范圍時，揮發油提取率會有相應程度的減小[20]。固液比為1∶10（g·mL-1）時提取效果最佳，核桃葉片精油的提取率達到最大。

2.3 超聲時間對揮發油提取率的影響

由圖3可見，超聲時間對核桃葉片揮發油提取率的影響，超聲時間5～20 min時揮發油提取率‘溫185為0.027 0%～0.037 5%，‘山核桃為0.025 0%～0.036 5%，‘實生核桃為0.019 5%～0.029 0%，‘美國東部黑核桃為0.029 5%～0.047 5%。不同超聲時間下各核桃葉片揮發油提取率依次為‘美國東部黑核桃>‘溫185>‘山核桃>‘實生核桃。超聲波在一定程度上提高了核桃葉片揮發油提取率，隨著超聲處理時間的增加，其提取率呈遞增趨勢，當超聲持續10 min后，提取率有所降低。隨著超聲時間的延長，細胞越容易破碎，有利于精油進入溶劑中；但由于精油是易揮發物質，提取時間過長，導致精油提取率下降[21‐22]。當超聲時間為10 min時，核桃葉片精油的提取率達到最大。

2.4 正交試驗結果分析

在單因素試驗的基礎上，以超聲時間、提取時間、固液比為考察因素，采用3因素3水平正交試驗，以核桃葉片揮發油提取率為指標，確定最佳提取條件[23]，正交試驗結果見表2。從極差結果分析得出，3個因素對核桃葉片揮發油提取率的影響由強到弱順序為提取時間>超聲時間>固液比，提取時間的極差最大，為0.062，表明提取時間對核桃葉片揮發油提取量影響最大；固液比的極差最小，為0.030，表明固液比對核桃葉片揮發油提取量的影響最小；正交試驗結果表明，在超聲波處理時間為10 min的條件下，A2B2C2 為核桃葉片揮發油提取條件的最佳組合，即提取時間為8 h，超聲時間為10 min，固液比為1∶10（g·mL-1）。

2.5 不同核桃葉片粗揮發油提取溶液的驅蚊效果分析

2.5.1 ‘溫185葉片提取物溶液驅蚊效果 從圖4可以看出，核桃葉片揮發油的含量水平不同，驅蚊效果也有所不同。通過對4種含量水平‘溫185核桃葉片揮發油驅蚊效果的比較可以看出，其驅蚊率依次為30%處理>40%處理>20%處理>10%處理，30%含量水平的驅蚊時間最長，是驅蚊效果最好的處理水平，40% 含量水平揮發油效果比30% 處理效果稍差。在30% 含量水平下驅蚊時間達到20 min，說明‘溫185葉片揮發油對蚊蟲的驅避效果，在30%含量水平下效果最好。

2.5.2 ‘美國東部黑核桃葉片提取物溶液驅蚊效果 由圖5可知，‘美國東部黑核桃葉片揮發油提取物隨著時間的增加驅蚊率先增加后減小。4種含量水平‘美國東部黑核桃葉片揮發油驅蚊效果依次為30% 處理>40% 處理>20% 處理>10% 處理，30%含量水平葉片揮發油在前20 min內的驅蚊率為85.18%，具有最好的驅蚊效果。但是從20 min后驅蚊率開始下降，說明揮發油溶液在空氣中揮發較快。

2.5.3 山核桃葉片提取物溶液驅蚊效果 由圖6可知，‘山核桃葉片揮發油提取物溶液的驅蚊率由高到低依次為20%處理>40%處理>30%處理>10% 處理。20%、40% 和10% 含量水平下20 min時，其驅蚊率均達到最高，驅蚊效果較好，但從20 min后驅蚊率出現下降的趨勢，直至60 min時20% 含量水平的驅蚊率下降為27.04%。30% 含量水平的揮發油提取物溶液不同于其他含量水平，30% 含量水平在15 min時驅蚊率達到最高，驅蚊效果較20%和40%含量水平稍差，當驅蚊時間為20 min時，30%含量水平的驅蚊率已經開始下降，且下降較快。‘山核桃葉片揮發油提取物溶液在20 min內20%、40%、30%和10%具有一定的驅蚊效果，其中揮發油提取物溶液含量水平為20%、驅蚊時間為20 min時驅蚊效果最好，驅蚊率達到最高，為68.82%。

2.5.4 ‘ 實生核桃葉片提取物溶液驅蚊效果 由圖7可知，‘實生核桃葉片揮發油提取物隨著時間的增加驅蚊率呈先增加后減小的趨勢，‘實生核桃葉片揮發油不同含量水平驅蚊率由高到低依次為40%處理>30%處理>20%處理>10%處理，‘實生核桃葉片揮發油提取物稀釋為40%水平、驅蚊時間為20 min時驅蚊率為63.40%，具有最好的驅蚊效果。

2.6 同一水平下不同核桃葉片驅蚊效果由表3所知，4個核桃樣品葉片揮發油提取溶液均具有一定的驅蚊活性，不同含量水平下驅蚊效果有明顯差異。‘美國東部黑核桃揮發油提取溶液在30%含量水平下效果最佳，驅蚊率可達到85.18%；其次是‘溫185，驅蚊率達到84.11%；‘山核桃和‘實生核桃揮發油提取溶液驅蚊效果低于‘美國東部黑核桃和‘溫185。可知4個核桃葉片揮發油提取溶液在30%含量水平下驅蚊效果由強到弱依次為‘美國東部黑核桃>‘溫185>‘山核桃>‘實生核桃。

3 討論

利用超聲水蒸氣蒸餾法提取核桃葉片揮發油，可以選擇的因素較多。采用正交試驗能全面地比較各因素之間的相互作用，并且通過正交試驗的設計能分析出最優的提取方案，在核桃葉片揮發油的提取優化方面廣泛應用。本試驗得出超聲水蒸氣蒸餾法提取‘美國東部黑核桃葉片揮發油的最佳工藝條件為提取時間8 h，超聲時間10 min，固液比1∶10（g·mL-1）。其中，核桃葉片粉末含量過多對核桃葉精油提取率有負影響，隨固液比中水分的增加，揮發油提取率先增加后下降，當固液比增大到1∶10（g·mL-1）后提取率明顯開始下降，可能是當核桃葉片與水溶液之間混合后擴散達到一定平衡，提取率反而降低，因為核桃粉末過多，固液比過大，蒸餾瓶容積太小，核桃葉片溶解不完全導致提取率降低[23]，這和Ravanfar等[24]的試驗結果相一致。隨著提取時間的延長，核桃葉片中揮發油成分不斷析出，到達一定量后基本飽和，提取率趨于平緩，所以揮發油提取率先增加后減少，這與王藝茜[25]對桃葉最佳提取條件優化中結果一致。但張鷹等[26]在不同蒸餾提取時間對柚皮精油提取率的影響中得出，隨著提取時間的延長，柚皮精油提取率增加，當提取時間達到2 h后，精油提取率趨于平緩，并沒有下降，而本試驗中核桃葉片揮發油提取率則先上升后下降。

核桃葉片揮發油的提取率隨超聲時間的增加，呈現先增加后下降趨勢，當超聲時間為10 min時提取率達到最大，10 min以后核桃葉片揮發油提取率隨著超聲時間延長開始緩慢下降。這與華燕青等[27]對薄荷揮發油的提取試驗結果一致。但覃勇榮等[28]在對無患子總皂苷提取率研究過程中發現，隨著超聲時間的延長皂苷提取率逐漸下降。本試驗中提取率的下降是由于超聲時間的延長，大量核桃葉片細胞破碎且破碎程度增加，揮發油溶出較多，但是由于揮發油易揮發，提取時間過長，引起核桃葉片物質結構和組成的變化，導致核桃葉片揮發油提取率下降，所以核桃葉片揮發油提取率隨超聲時間的增加先增加后減小[29‐30]。同時，超聲時間過長不僅增加了成本，而且可能影響精油成分[31]。本試驗在影響核桃葉片揮發油的提取率單因素試驗的基礎上，將正交試驗法應用于優化核桃葉片揮發油提取工藝中，確定提取時間為8 h，超聲時間為10 min，固液比為1∶10（g·mL-1）為最佳提取條件。在此條件下，核桃葉片揮發油的提取率為0.475%，顯著高于桃葉提取率[27]。本試驗利用正交試驗法對超聲輔助水蒸氣蒸餾法提取核桃葉片揮發油的提取方法進行優化，為后期提高核桃葉片揮發油的提取率及核桃葉片驅蚊精油的綜合開發利用提供依據。

天然植物精油大多具有芳香性，毒性低，刺激性低，對人體和環境無害，使用安全，使嗅覺和感覺更容易接受[32‐33]。驅蚊試驗發現，30%含量水平下‘美國東部黑核桃葉片揮發油提取溶液驅蚊效果最佳，在驅蚊時間為20 min 時，驅蚊率達85.18%，具有很好的開發前景。目前關于植物精油驅蚊效果的研究較多，但多集中于植物本身，而有關揮發性物質的有效組分和不同植物間的相互協作關系的探討很少[34]。劉磊等[35]通過比較5種驅蚊植物及植物萃取液驅蚊效果發現，5種驅蚊植物提取液在2 h后均表現出不同程度的蚊蟲驅避作用，且隨著處理時間的延長，其作用由開始升高在20 min內逐漸降低，而在120 min內，香葉天竺葵沒有顯著的降低。這與本試驗結果中核桃葉片揮發油提取物的驅蚊效果相一致。唐麗萍等[36]對4種植物精油驅蚊貼對白紋伊蚊的驅避效果的研究發現，香茅油驅蚊貼的驅避效果最好，高達78.2%，復方精油驅蚊貼的驅避率為56.0%，所有測試的驅蚊貼在24 h后驅蚊效果明顯減弱。以30%含量水平核桃葉片的精油為驅蚊劑的最佳配比，但其作用不及市面上的驅蚊產品。考慮到核桃葉片的獨殊香氣和低成本，該產品與其他植物精油配合使用，能實現較好的驅蚊作用，是一種具有潛力的新型驅蚊劑。

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（責任編輯：胡立霞）