一款含肌醇乳液的保濕緊致功效評價

目的：采用體外試驗和臨床試驗相結合的方法，評價含肌醇乳液的功效性和安全性。

方法：體外保濕功效通過透明質酸酶活性抑制實驗進行評價，體外緊致功效通過彈性蛋白酶活性抑制實驗進行評價；臨床試驗選取35例具有皮膚老化特征的受試者以自身前后對照進行評價。

結果：體外試驗結果顯示，該含肌醇的乳液對透明質酸酶活性的抑制率為41.00%，對彈性蛋白酶活性的抑制率為12.30%；臨床試驗結果顯示，連續使用該產品4周后，表皮層水分含量改善率為4.28%（P＜0.01），角質層水分含量改善率為27.10%（P＜0.001），彈性R2值改善率為6.14%（P＜0.01），平坦度Sa值改善率為3.51%（P＜0.05），且整個測試過程中均未發生不良反應。

結論：該含肌醇乳液具有良好的保濕和緊致功效。

關鍵詞：肌醇；保濕；緊致；體外測試；臨床實驗

肌醇（Inositol）廣泛存在于自然界中，在新鮮水果、蔬菜及谷物中含量較高，能夠參與動植物細胞中相關的物質代謝活動。據研究報道，肌醇作為胰島素信號通路的第二信使作用于代謝途徑，給藥后發揮胰島素增敏和模擬作用，并能降低血糖，促進肝糖原合成[1]，已被廣泛用于與胰島素抵抗相關的病理治療，如多囊卵巢綜合征（PCOS）和糖尿病[2，3]。有學者綜述肌醇在生物醫學領域的應用，闡述肌醇在治療衰老和相關神經退行性疾病中的作用及分子機制[4]，表明肌醇在人類相關疾病的治療中發揮重要作用。近年來，肌醇在食品、醫藥乃至化妝品等多領域的應用受到廣泛關注。

肌醇又名環己六醇，是B族維生素中的一種水溶性維生素。如果皮膚缺水，導致水油不平衡，皮膚表面的pH值發生變化，將會導致皮膚容易敏感[5]。肌醇可通過調節油脂分泌實現水油平衡，持續補水，控制皮脂，并提供抗氧化等抗衰老因子[6]，從而達到保濕效果。另一方面，肌醇能使血小板衍生因子（PDGF-BB）的產生量顯著增加，而PDGF-BB又是真皮干細胞所需的關鍵物質，能增強真皮干細胞的分泌能力，有助于提高真皮的再生和修復水平，從而達到抗皺/緊致效果。因此可將肌醇用于抗衰老化妝品中。

透明質酸酶廣泛存在于動物組織和微生物中，可降解透明質酸，在皮膚中透明質酸主要通過水合作用保持皮膚水分[7]；彈性蛋白分布于真皮組織，使皮膚具有彈性，彈性蛋白酶主要負責降解彈性蛋白[8]，本文通過透明質酸酶抑制實驗和彈性蛋白酶活性抑制實驗以研究該含肌醇乳液在體外保濕和緊致維度上的效果。

表皮層水分含量和角質層水分含量可客觀表征皮膚水分含量[9]，平坦度Sa值可客觀表征皮膚粗糙程度[10]，彈性R2值應用較廣且具有較高的市場認可度可用于表征皮膚彈性[11]。本文通過28天臨床使用試驗，測試該4個客觀指標以研究該乳液對人體的保濕、緊致效果，并通過受試者自評和不適應癥觀察研究該乳液的試用者喜好度以及臨床安全性情況。

Part 1

實驗部分

1．1 主要試劑與儀器

1.1.1 乳液制備：試劑：丙烯酸（酯）

類/C10-30 烷醇丙烯酸酯交聯聚合物，Lubrizol Advanced Materials， Inc.；阿拉伯膠樹（ACACIA SENEGAL）膠、黃原膠，SEPPIC S.A.；肌醇，TSUNO RICE FINE CHEMICALS CO.，LTD.；1，3-丙二醇，Primient Covation LLC；甘油，PTMUSIM MAS；氫化卵磷脂，NIPPON SURFACTANTINDUSTRIES CO.， LTD.；甘油三（乙基己酸）酯，STEARINERIE DUBOIS Fils S.A.；辛基聚甲基硅氧烷，邁圖（上海）貿易有限公司；生育酚乙酸酯，帝斯曼營養產品有限公司；山崳醇，巴斯夫（中國）有限公司；對羥基苯乙酮，煙臺東方化學有限公司；1，2-己二醇，德之馨香精香料（南通）有限公司。儀器：MDB45305型生物顯微鏡，日本Nikon公司。

1.1.2 體外試驗：試劑：透明質酸酶，默克Sigma-Aldrich公司；透明質酸鈉，默克Sigma-Aldrich公司；對二甲基苯甲醛，上海麥克林生化科技股份有限公司；甘草酸二鉀，阿拉丁試劑（上海有限公司），彈性蛋白酶默克Sigma-Aldrich公司；N-琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸-p-硝基苯胺（AAAPAN），默克Sigma-Aldrich公司；西維來司鈉，默克Sigma-Aldrich公司。儀器：Infinite E PLEX型多功能酶標儀，TeCAN公司；QL-901型渦旋儀，德國IKA公司；HHS11-1型恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司。

1.1.3 臨床試驗儀器：MoistureMeter Epid型表皮層水合測量儀，芬蘭Delfin公司；MoistureMeter SC型角質層水合測量儀，芬蘭Delfin公司；Primos Lite型皮膚快速三維成像系統，美國LMI公司；Cutometer型皮膚彈性測量儀，德國CK公司；VISIA-CR 2.3型皮膚圖像測量儀，美國Canfield公司；C-Cube型成像儀，法國Pixience公司。

1.2 含肌醇的乳液的制備

見表1配方，將A相投入生產鍋攪拌溶脹均勻；B相在外置容器80℃下分散均勻，投入預先90℃溶解混合均勻的C相的料體，攪拌均勻，保溫攪拌，快速降至常溫，將B+C相投入生產鍋，攪拌均勻；投入D相和預先60℃混合溶解并降至常溫備用的E相至生產鍋，攪拌均勻，出料。

通過配方形成的液晶結構（見圖1）可以包裹活性物，進而促進活性物在皮膚上的滲透。液晶結構與人體細胞膜的磷脂雙分子層結構類似，根據相似相溶原理，液晶相與細胞間脂類相互作用，角質層形成更易滲透的脂質通道，促進活性成分的滲透，有利于功效成分發揮作用[12，13]。膚感方面，由于乳液的液晶層是由乳化劑雙分子層與結合水周期性層狀排列而成，層與層之間由于含大量結合水而容易相對滑移，使乳液更易鋪展于皮膚表面，具有優于普通乳液的清爽、柔滑的膚感[6]，有利于提高后續臨床受試者的配合度。制備乳液進行測試，還可以減少部分單一原料功效效果與實際應用于產品時存在功效效果差異的問題[14]。

1.3 功效評價

1.3.1 透明質酸酶抑制實驗：以甘草酸二鉀為陽性對照[15]，將其依次配制成50、80、100、160、200μg/mL溶液，取50μL 30mg/mL透明質酸酶液與50μL含肌醇的乳液或陽性對照混合，于37℃孵育20min；加入100μL 12.5mmol/L CaCl2溶液，于37℃孵育20 min；加入250μL 3mg/mL透明質酸鈉溶液，于37℃孵育40min；加入100μL 0.4mol/L NaOH溶液和100μL 0.4mol/L四硼酸鉀溶液，置于沸水浴中加熱3min后，立即置于冷水中冷卻5min；加入3mL 10mg/mL對二甲氨基苯甲醛溶液，放置20min顯色；吸取250μL上清液加入96孔板中，于540nm下進行測定吸光度，每個樣品3個平行，至少重復2次。

根據所測吸光度值，計算透明質酸酶抑制率（R），公式為：R=（1-OD545樣品組/OD545陰性對照組）×100%，繪制陽性標準曲線，陽性對照IC50在100μg/mL-200μg/mL范圍內認為系統有效。

1.3.2 彈性蛋白酶活性抑制實驗：以西維來司鈉為陽性對照[16]，將其依次配制成2、5、10、20、30μM溶液備用。取90μL Tris-HCl緩沖液與30μL 5.0mmol/L AAAPAN溶液混合后，加入50μL含肌醇的乳液或陽性對照，在25 ℃下孵育15min，隨后加入30μL 0.2U/mL彈性蛋白酶溶液，在25℃下孵育15min后在410 nm下進行測定。每個樣品做3個平行，重復至少2次。

根據所測吸光度值，計算透明質酸酶抑制率（R），公式為：R=（1-OD410樣品組/OD410陰性對照組）×100%，繪制陽性標準曲線，陽性對照IC50在5μM-20μM范圍內認為系統有效。

1.3.3 臨床試驗：（1）受試對象 ：本試驗共觀察皮膚出現老化的受試者35例，其中男2例、女33例，平均年齡50.03歲。依據《赫爾辛基宣言》，受試者知悉本次測試詳情，且自愿參加本次測試并簽閱知情同意書。在知情同意書中，明確解釋了與參與研究相關的可能風險、益處、權利和義務的所有必要信息。

（2）入選標準：①年齡為18-65 歲，健康，性別不限；②皮膚彈性R2值≤0.65；③自愿參加試驗，愿意簽署知情同意書。

（3）排除標準：①正在接受皮膚科治療的，患有皮膚病的人群；②正在接受治療的哮喘或其他慢性呼吸系統疾病患者；③近2個月面部使用任何抗炎藥物；④胰島素依賴糖尿病患者；⑤近5個月內接受抗癌化療患者；⑥哺乳期或妊娠期婦女；⑦過敏體質者、過敏性皮膚炎等人群，有皮膚病或疾病史；⑧嚴重系統疾病、免疫缺陷或自身免疫性疾病者；⑨近1個月曾使用過激素類藥物及免疫抑制劑者；⑩面部有皮損或大面積胎記、抓痕、白斑、色素痣、疤痕疙瘩等影響試驗的皮膚表征；?近6個月內接受過影響皺紋狀態的美容手術或其他美容方式者；?近6個月內使用過肌肉松弛制劑者；?近1個月內參加過其他臨床試驗者。

（4）研究方法：本研究采用自身前后對照研究，35例受試者每天早晚將1mL含肌醇的乳液均勻涂抹于臉部，共使用28天。分別于第0天、第28天進行安全性及有效性評估。測試時，統一在無陽光直射，無風，室溫20℃～22℃，濕度40%～60%的室內環境進行。受試者清潔皮膚后，靜坐20 min后，取躺位進行測試，每次測量均分別選取左右面部同一部位，同一部位共測量3次，取平均值。

（5）安全性評價：臨床觀察期間，實驗室對受試者進行不良反應評價，包括：研究部位是否出現瘙癢、干燥、脫屑或刺痛等癥狀。

（6）無創性皮膚生理功能測試：表皮水分含量測試：采用MoistureMeter Epid測量儀測定皮膚表皮層水分含量，結果表示為表皮層水分含量改善率=[（使用樣品后-使用樣品前）/使用樣品前]x100%；角質層水分含量測試：采用MoistureMeter SC測量儀測定皮膚角質層水分含量，結果表示為角質層水分含量改善率=[（使用樣品后-使用樣品前）/使用樣品前]x100%；皮膚平坦度測試：采用Primos Lite皮膚快速三維成像系統測量皮膚平坦度Sa值，結果表示為平坦度Sa值改善率=[（使用樣品前-使用樣品后）/使用樣品前]x100%；皮膚彈性測試：采用Cutometer皮膚彈性測量儀測定皮膚彈性R2值，結果表示為彈性R2值改善率=[（使用樣品后-使用樣品前）/使用樣品前]x100%；圖片采集：采用VISIA-CR 2.3皮膚圖像測量儀和C-Cube成像儀拍攝受試者使用產品前后對比圖片。

（7）受試者自評：受試者使用受試品28天后對產品整體滿意度、保濕效果滿意度和緊致效果滿意度按5分標準評估：5分=極明顯改善；4分=明顯改善；3分=改善；2分=輕度改善；1分=無改善。受訪時，受試者通過填寫問卷對產品的整體抗皮膚老化效果進行評價。

1.3.4 數據統計分析：采用Graphpad prism 8.0統計軟件對數據進行統計學分析，結果表示為：平均值±標準差。采用單因素方差分析方法計算不同組之間的顯著性差異。對于臨床結果分析，進行正態分布檢驗，符合正態分布要求，自身前后的比較采用配對t檢驗，否則采用兩個相關樣本秩和檢驗，顯著性水平均為P＜0.05。顯著性“ns”表示P＞0.05，“*”表示P＜0.05，“**”表示P＜0.01，“***”表示P＜0.001。

Part 2

結果

2.1 體外試驗結果

2.1.1 含肌醇的乳液抑制透明質酸酶活性實驗：酶標儀檢測透明質酸酶標準溶液與底物HA的反應并做回歸曲線分析，得到回歸方程為y= -0.000 066 09x2 + 0.307 8x - 0.096 86，R2=0.994 3，甘草酸二鉀的IC50值為156.09±2.84μg/mL，其對透明質酸酶活性抑制率曲線，見圖2A；

該含肌醇的乳液對透明質酸酶活性的抑制率達41.00%（見圖2B），相當于濃度為100μg/mL-160μg/mL的甘草酸二鉀的抑制效果，這表明含肌醇的護膚品可有效抑制透明質酸酶活性，預示在化妝品功效應用中能表現出良好的保濕功效。

2.1.2 含肌醇的乳液抑制彈性蛋白酶活性實驗：

酶標儀檢測彈性蛋白酶標準溶液與底物AAAPAN的反應并做回歸曲線分析，得到回歸方程為y= -0.108 9x2 + 5.59x +4.868，R2 =0.977 9，西維來司鈉的IC50值為10.05±0.57μM，其對彈性蛋白酶活性抑制率曲線，見圖3A；

該含肌醇的乳液對彈性蛋白酶活性的抑制率可達12.30%（見圖3B），這表明含肌醇的護膚品可有效抑制彈性蛋白酶活性，預示在化妝品功效應用中能表現出抗皺或緊致功效。

2.2 臨床試驗結果

2.2.1 一般資料：31例受試者完成為期28天的臨床測試，4 例因未能在規定的時間內到訪而脫組。其中有效例男2例、女29例，平均年齡50.55歲。

2.2.2 無創性皮膚生理功能測試：皮膚衰老是一個復雜的過程，主要的臨床表現有皮膚結構，功能和外觀的累積性變化，如皺紋增多，松弛，彈性減退，毛細血管擴張，皮膚色素異常等[17]。此外，皮膚角質層的水分容易因汽化而水分含量急劇減少，容易導致皮膚干燥等不良現象，通過無創性儀器測試可客觀表征皮膚生理情況。通過本次臨床測試（數據結果見表2和圖4），使用產品28天后皮膚表皮層水分含量、角質層水分含量和彈性R2值在使用后第28天較第0天高，差異有統計學意義（P＜0.05）；平坦度Sa值在使用后第28天較第0天低，差異有統計學意義（P＜0.05），說明該含肌醇的乳液使用后可以增加皮膚的水分和彈性，使皮膚平坦更細膩，具有良好的保濕和緊致效果。產品使用后，臉部具有綜合改善效果，見圖5和圖6。

2.2.3 受試者自評：受試者自評見表3，在產品整體滿意度評價結果中，評分≥ 4 分的受試者占比100%，平均分為4.55；在保濕整體滿意度評價結果中，評分≥ 4 分的受試者占比96.77%，平均分為4.58；在緊致整體滿意度評價結果中，評分≥ 4 分的受試者占比87.10%，平均分為4.23。說明該31 位受試者對該含肌醇的乳液保濕、緊致效果較為滿意。

2.2.4 安全性評價 ：31 例受試者均未發生明顯不良反應，說明該含肌醇的乳液具有良好的臨床安全性。

Part 3

結論與展望

本文通過實驗設計，采用體外和臨床試驗相結合的方法，進一步驗證了含肌醇乳液的保濕和緊致功效。其中，體外透明質酸酶抑制實驗和彈性蛋白酶活性抑制實驗結果表明該含肌醇乳液可有效抑制透明質酸酶和彈性蛋白酶活性；臨床試驗結果顯示31 位受試者自評對產品保濕、緊致效果較為滿意，且可以顯著增加皮膚水分含量和彈性，說明該含肌醇乳液具有良好的保濕和緊致功效，可在一定程度上延緩皮膚衰老，適用于預防皮膚老化。

早在1988 年，研究發現肌醇是角質形成細胞生長所需的營養素[18]，為肌醇在化妝品中的應用打開新篇章。在當前化妝品應用中，肌醇可以發揮保濕、滋潤、抗皺、緊致和舒緩皮膚的作用，然而相關應用案例報道不多。肌醇在化妝品領域具有較好的開發價值和開發前景，本文對其保濕和緊致功效做了進一步驗證研究，為肌醇的應用提供了理論和實驗參考，后續可對其作用機理和其它功效進行深入探討和研究。

作者介紹

張 帆，李 梅，陳鈺瑩：供職于廣州益養生物科技有限公司。

黎遠生，黎青勇，萬 陽：供職于廣州暨大美塑生物科技有限公司。

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