擬無枝酸菌糖肽類和聚酮類抗生素的遺傳信息及生物合成途徑的研究進展

收稿日期：2023-10-11

作者簡介：牛莎莎，助理工程師，主要從事微生物菌種選育工作。

*通信作者：牛春，助理工程師，主要從事微生物菌種選育工作。

摘要：擬無枝菌屬（Amycolatopsis）是萬古霉素和利福霉素等次生代謝產物的菌株，該菌屬天然抗生素的分子遺傳學已經有了廣泛研究。由于抗生素耐藥率的上升，尋找新的藥物來對抗感染治療已成為當務之急。了解代謝產物遺傳信息的新進展有助于合理地操縱生物合成途徑，以便于研發新型抗生素。本文綜述了近年來通過Amycolatopsis基因組序列發現的糖肽類和聚酮類抗生素及其生物合成途徑方面的成果。

關鍵詞：擬無枝酸菌；糖肽類抗生素；聚酮類抗生素；萬古霉素；利福霉素；生物合成途徑

中圖分類號：R978.1" " " " "文獻標志碼：A" " " " "文章編號：1001-8751（2024）02-0074-10

Progress on Genetic Information and Biosynthetic Pathways of Glycopeptide and Polyketide Antibiotics of Amycolatopsis

Niu Sha-sha，" "Zhang Ping，" "Niu Chun

（Ningxia Tairui Phamaceutical Co.， LTD.， Yinchuan 750100）

Abstract： The genus Amycolatopsis produces secondary metabolites like rifamycin and vancomycin， which are widely used in agriculture and medicine. This genus's natural antibiotics' molecular genetics have been thoroughly researched. Due to the rise in antibiotic resistance， finding new drugs to fight infections has become a priority. New advances in understanding the genetic information of metabolites can help rationally manipulate biosynthetic pathways for the development of new natural antibiotics." In this review， we review the recent achievements of glycopeptide and polyketide antibiotics discovered by the Amycolatopis genome sequence and their biosynthetic pathways.

Key words： Amycolatopsis;" "glycopeptide antibiotics;" "polyketide antibiotics;" vancomycin;" "rifamycin; biosynthetic pathways

1 介紹

微生物來源的抗生素對人類健康做出了重大貢獻。其中，放線菌是藥物先導化合物的最重要來源。然而，隨著多重耐藥細菌的出現以及耐藥細菌感染病例數量不斷增加，迫切需要研發新型抗生素。近年來，隨著微生物天然產物生物合成的分子遺傳學和合成生物學的不斷發展，通過操縱酶、調控基因和生物合成途徑等方法，對現有抗生素結構的靶向修飾，有望產生具有新穎結構或優越性能的天然產物類似物從而獲得新型抗生素[1]。

放線菌目包含大量的屬，鏈霉菌屬是70%～80%次級代謝產物的來源，其代謝產物能夠合成多種天然生物活性產物。此外，抗生素的重要產生菌還有擬無枝酸菌屬（Amycolatopsis）、游動放線菌屬、小單孢菌屬和糖多孢菌屬[2]。其中擬無枝酸菌屬被認為是涵蓋多種有價值的生物活性天然產物的重要來源，包括利福霉素和萬古霉素[3]。擬無枝酸菌屬是具有IV型細胞壁且缺乏分枝菌酸的放線菌，該屬涵蓋94個已驗證種和4個亞種，在假諾卡氏菌科（Pseudonocardiaceae）進化樹中形成了一個獨特的分支。他們中的大多數在各種土壤中定植，少數在陸地（昆蟲、地衣、島嶼和植物）和海洋（海綿和沉積物）環境中生存。擬無枝酸菌屬物種具有生物降解、生物轉化和生物吸附的潛力，這可能解決未來的環境污染問題[4]。來自擬無枝酸菌屬菌株的次級代謝產物有多酚類、線性聚酮化合物、大環內酯類、大環內酰胺類、噻唑基肽類、環肽類、糖肽類、酰胺和氨基衍生物、糖苷衍生物、烯二炔衍生物和倍半萜類等，其生物活性包括抗微生物、細胞毒性、抗氧化劑、topoIIα抑制、抗高血糖、酶抑制和DNA損傷[5]。

擬無枝酸菌產生兩種主要類型的抗生素：糖肽類和聚酮類。糖肽類抗生素用于治療嚴重的革蘭陽性菌感染，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）[6]。糖肽類的抗微生物活性基于與細菌細胞胞膜的結合，而不是與靶蛋白的結合。糖肽與細菌細胞質膜外表面上的肽聚糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸（D-Ala-D-Ala）二肽末端結合[7]，進而干擾肽聚糖層的成熟，由于不完整和受損的細胞壁容易受到滲透壓的影響，復制細菌無法存活。但是，糖肽類抗性生物體用D-丙氨酰-D-乳酸鹽（D-Ala-D-Lac）或D-丙氨酰-D-絲氨酸（D-Ala-D-Ser）替換D-Ala-D-Ala末端，從而顯著降低抗生素對細胞靶標的親和力[8]。所有糖肽類抗生素都有一個基于七肽骨架的共同結構，肽側鏈氧化交聯形成大環，并在不同位置攜帶糖取代基[9]。聚酮類抗生素的結構變化很大，包括環狀、非環狀、小、大、簡單和復雜分子，可以分為亞群：脂肪酸，聚丙酸酯和芳香族聚酮。由擬無枝酸菌屬產生的利福霉素等都是通過聚酮化合物前體獲得的。聚酮類抗生素的抗菌作用各不相同：螯霉素通過抑制RNA翻譯來阻止細菌生長，而利福霉素則抑制DNA依賴性RNA合成[10]。從擬無枝酸菌屬已公布基因組序列中，已經檢測到許多與次生代謝物相關的生物合成基因簇。例如，除東方擬無枝酸菌中的萬古霉素生物合成基因外，已鑒定出26個次級代謝產物基因簇[11]。目前，對擬無枝酸菌屬其他次生代謝產物的生物合成研究較少[12]，有必要對擬無枝酸菌屬中具有生物活性的化合物在作用機制、生物合成和調控基因等方面進行深入研究。本文以擬無枝酸菌中分離的抗生素為例，討論了遺傳信息和生物合成途徑的研究進展，分析這些生物活性產物的生物合成基因簇和生物合成途徑，為合成抗耐藥病原微生物的新藥奠定基礎。

2 糖肽類抗生素在擬無枝酸菌屬中的生物合成

2.1 萬古霉素及其類似物

萬古霉素（Vancomycin）是1956年從Amycolatopsis orientalis（原Streptomyces orientalis）中分離得到的一類糖肽類抗生素，臨床應用已有60年，檢測萬古霉素有關物質，推廣使用歐洲藥典（EP）10.0中的有關物質檢測方法[13]。萬古霉素是一種七肽鏈形成的三環結構糖肽，它的兩個重要類似物是氯東方菌素A（Chloroeremomycin）和巴爾赫霉素（Balhimycin）。與萬古霉素的L-vancosamine-1，2-葡萄糖不同，氯東方菌素A的雙糖是L-4-epi-vancosamine-1，2-葡萄糖[9]；而巴爾赫霉素在糖基化模式上與萬古霉素有所不同（圖1）。另外，糖肽類抗生素的七肽骨架富含源自莽草酸途徑的芳香族殘基，巴爾赫霉素的產生菌Amycolatopsis balhimycina含有莽草酸途徑的關鍵酶，即脫氧-d-阿拉伯-庚酮酸-7-磷酸合酶（Dahp）和苯丙酸脫氫酶（Pdh），是糖肽類抗生素的關鍵前體酪氨酸，也是預苯酸脫水酶（Pdt）的激活劑，Pdt在Amycolatopsis balhimycina中的過表達可促使菌株中抗生素產量增加[14]。此外，Oritavancin作為新一代半合成脂糖肽抗生素，其直接前體糖肽A82846B與萬古霉素在結構上具有相似性，而上述結論源于研究人員利用CRISPR-Cas12a系統，將萬古霉素基因簇中的糖基轉移酶模塊（gtfDE）和糖基合成模塊（vcaAEBD）分別替換為A82846B基因簇中相應的糖基轉移酶模塊（gtfABC）和糖基合成模塊（evaAEBD），即通過人工構建的合成途徑成功制備了A82846B[15]。

根據相應基因簇編碼的蛋白序列推斷，巴爾赫霉素、氯東方菌素A和萬古霉素的生物合成途徑是相似的[16]。萬古霉素生物合成涉及三個步驟。首先，合成7個氨基酸前體，其中3個非蛋白氨基酸生物合成酶的編碼基因，分別為AORI_1491-1497和AORI_1502-1505。接下來，七個前體通過非核糖體肽合成酶（NRPSs）VcmA、VcmB和VcmC組裝形成七肽骨架。最后完成七肽主鏈的組裝后修飾，包括環化、鹵化、甲基化和糖基化。七肽骨架的環化涉及三個P450基因（oxyA，oxyB，oxyC），而糖基化涉及兩個糖基轉移酶基因（gtfD，gtfE） [11]（圖2）。

有關P450基因，研究顯示參與七肽骨架環化的P450基因是從萬古霉素的產生菌Amycolatopsis" orientalis[17]，氯東方菌素A的產生菌Amycolatopsis" orientalis A82846[18]和巴爾赫霉素的產生菌Amycolatopsis balhimychina[19]中克隆出來的。具有Amycolatopsis orientalis相應加氧酶基因的Amycolatopsis balhimychina突變株通過異源互補可恢復巴爾赫霉素的生產，證明巴爾赫霉素和萬古霉素產生菌的加氧酶功能等效[20]。另外通過Amycolatopsis" balhimycina基因敲除實驗，可確定OxyA-C參與三種苯酚偶聯反應。第一次偶聯反應發生在殘基4和殘基6之間，由OxyB催化；第二次反應發生在殘基2和4之間（OxyA），最后在殘基5和7之間（OxyC）。上述前兩個反應是C-O耦合，而最后一個反應是C-C耦合[21]。同時在另一項研究中發現，一個保守的X-結構在所有糖肽類抗生素的非核糖體肽合成酶（NRPS）復合物中，當招募必需的Oxy酶（OxyA-C）時，對糖肽類生物合成中Oxy催化的交聯結合起重要作用[22]。

1989年，研究推測在Amycolatopsis orientalis中首次鑒定到糖基轉移酶（Gtf）與肽核中添加的糖基有關。也從萬古霉素產生菌Amycolatopsis orientalis C329.4中擴增出兩個Gtf基因（gtfD，gtfE）。GtfD和GtfE經異種表達和純化后，活性得到了表征。GtfE參與萬古霉素的結構修飾，將葡萄糖轉移到萬古霉素的糖苷配基（UDP-葡聚糖作為糖基供體） 形成萬古霉素假苷元；而GtfD能夠利用非天然受體和非天然核苷酸糖供體UDP-4-epi-Vancosamine合成一種新型混合替考拉寧/萬古霉素的糖肽類抗生素。同時從氯東方菌素A的產生菌Amycolatopsis orientalis A82846中擴增出三個Gtf基因（gtfA、gtfB、gtfC）[23]。推測GtfA催化4-epi-vancosaminyl轉移6β-OH-tyr殘基的β-羥基；GtfB的糖基化活性與GtfE相似，但效率較低。GtfC的活性與GtfD相似[24]。此外，發現Gtf能夠產生新的糖基化模式，從而產生雜化糖肽類抗生素。1997年首次報道了用gtfs產生的雜交糖肽類抗生素，將gtf基因導入豐加鏈霉菌（Streptomyces toyocaensis）中，產生了一種替考拉寧的七肽類抗生素A47934 （無糖殘基）。

替考拉寧也是一種糖肽類抗生素，它與萬古霉素的區別在于肽骨架上多了脂肪酸側鏈，提高了親脂性，更易于滲入組織和細胞，以及芳香氨基酸1和3之間有額外的環閉合[25-26]。Losey等[24]使用GtfE將大量NDP-葡萄糖類似物轉移到萬古霉素和替考拉寧的七肽骨架上，然后用GtfD與4-epi-vancosamine對糖基肽修飾，得到萬古霉素和替考拉寧衍生物。在另一項研究中發現，GtfE通過替考拉寧苷元和UDP-葡萄糖生成替考拉寧糖基化衍生物。使用GtfD將非天然核苷酸糖（udp-4-epi-Vancosamine）轉移到該非天然受體上，可合成一種新的替考拉寧/萬古霉素的雜合糖肽類抗生素，其對敏感菌株的活性明顯高于兩種親本糖肽類抗生素[27]。Truman等[28]報道通過混合和匹配糖肽糖基轉移酶的N端和C端結構域來產生功能性嵌合糖基轉移酶，設計構建GtfA和GtfB嵌合體，可以生成大量的雜化糖肽類抗生素。

這些早期的研究表明，通過結合不同的苷元、NDP-氨基脫氧己糖變體和Gtfs，有可能制造新的糖肽定向文庫。

2.2 阿伏霉素

阿伏霉素（Avoparcin）的化學性質與萬古霉素相似，是抗生素的混合物：主要有α和β兩個組成部分，除了在β變體上多了一個芳香族氯原子外，其他結構都相同（圖3）。阿伏霉素最初是從Amycolatopsis coloradensis（原屬念珠鏈霉菌）中分離出來的，是一種II型糖肽類抗生素，在農業上被用作促進生長的飼料添加劑[29]。因為阿伏霉素在農場的廣泛使用會增加萬古霉素耐藥菌株的流行，動物和人類糞便樣本中萬古霉素耐藥腸球菌（VRE）的發生率和多樣性已得到充分記錄，所以1997年開始被歐盟委員會禁止使用[30]。由于目前禁止使用阿伏霉素，因此對其遺傳信息的進一步研究受到限制。

2.3 瑞斯托菌素

Amycolatopsis lurida是唯一目前用于商業生產瑞斯托菌素（Ristocetin）的菌種。瑞斯托菌素是III型糖肽類抗生素，最初是以Ristocetin A和Ristocetin B的混合物被發現，它們的微生物特性相似，但Ristocetin B更活躍。最近，發現Amycolatopsis sp.MJM2582和Amycolatopsis japonicum也能產生瑞斯托菌素。瑞斯托菌素的一個顯著特征是它的支鏈四糖結構，由于其毒副作用包括血小板減少和血小板凝集，瑞斯托菌素僅用于體外診斷應用[31]。

Amycolatopsis sp.MJM2582的瑞斯托菌素生物合成基因簇（ris）序列于2014年首次被報道[32]。幾乎與此同時，Spohn等[33]報道了Amycolatopsis japonicum的風險基因簇，這個基因簇是沉默的。但是，將巴爾赫霉素通路特異性調控基因bbrAba（bbr基因來自Balhimychina）在Amycolatopsis japonicum中異源表達后可以激活瑞斯托霉素（Ristomycin）的隱性基因簇[34]。這表明來自瑞斯托霉素和瑞斯托菌素生產菌的調節功能相似。

通過對ris編碼蛋白的序列的研究，發現了瑞斯托菌素的生物合成途徑：四個NRPS將β-羥基酪氨酸（Bht）、4-羥基苯甘氨酸（Hpg）和3，5-二羥基苯基甘氨酸（Dpg）組裝成肽，然后修飾七肽。四種細胞色素P450酶，六種Gtfs和兩種甲基轉移酶（Mtfs）參與瑞斯托菌素苷元的糖基化和甲基化[32]（圖4）。瑞斯托菌素是非氯代糖肽類抗生素，其生物合成路線包括稀有的二脫氧糖L-ristosamine，這是瑞斯托菌素生產所必需的。Ristocetin A的糖苷被證明沒有血小板聚集的毒副作用，更重要的是，與瑞斯托菌素相比，表現出更好的抗菌活性，這意味著這種苷元有希望被開發成一種抗菌制劑。

3 聚酮類抗生素在擬無枝酸菌屬中的生物合成

3.1 利福霉素

利福霉素（Rifamycin）最早是從Amycolatopsis mediterranei分離出來的，利福霉素B是通過商業發酵生產的，利福霉素SV是利福霉素B的生物合成前體，效力更強，是第一個臨床使用的利福霉素[35]。利福霉素屬于安莎類抗生素[36]，因其類似籃子的分子結構而得名，即芳香部分在非相鄰位置由脂肪鏈橋接。同位素標記前體的追蹤實驗、誘變和互補實驗表明，利福霉素是由芳香起始單元3-氨基-5-羥基苯甲酸（AHBA）、兩個乙酸酯和八個丙酸酯的延伸鏈組裝而成的聚酮[37]。利福霉素B生物合成中氨基莽草酸（ASA）途徑的一系列反應可導致AHBA的合成，先將合成的3，4-二脫氧-4-氨基-D-阿拉伯-庚糖酸7-磷酸（aminoDAHP）轉化為3-脫氫奎寧酸（aminoDHQ），后者脫水為5-脫氧-5-氨基-3-脫氫莽草酸（aminoDHS），最后通過AHBA合成酶芳構化為AHBA[38]。在2010年，首個完整的Amycolatopsis mediterranei基因組序列被報道（擬無枝酸菌屬的第一個基因組測序）[39]。

Yu等研究顯示[40]，通過失活和異源表達發現基因rifG～rifN參與了AHBA的生物合成。五個大型開放閱讀框架（ORF，rifA-E）共同編碼I型PKS以及NRPS腺苷化/巰基化結構域[41]。AHBA是起始單元，2個丙二酰輔酶A分子和8個甲基丙二酰輔酶A分子是形成初始大環中間體Proansamycinx的延伸單元。RifA-E負責組裝一個線性的非修飾體；隨后一種由rifF編碼的酰胺合成酶催化這種未解肽的再釋放，并將其環化成大內酰胺，即Proansamycin X。通過羥基化、乙酰化和甲基化，形成后期中間體利福霉素SV[37]。最后，細胞色素P450單加氧酶Rif16和轉酮酶Rif15將利福霉素SV轉化為最終產物利福霉素[42]（圖5）。此外，利用蛋白—蛋白質相互作用研究參與利福霉素生物合成的不同結構和調節蛋白之間的關系，發現RifA、RifK、RifL、Rif-Orf19是主要的調控中心[43]。

RNA聚合酶β亞基（由rpoB編碼）與各種放線菌對利福平的耐藥性有關。遺傳學研究表明，rpoB突變顯著激活隱性或沉默的次生代謝產物生物合成基因簇，從而導致這些放線菌中產生新的抗生素[44]。

3.2 Chelocardin

Chelocardin（CHD）是一種非典型四環素，它是一種重要的多酮類廣譜抗生素。典型的四環素通過抑制蛋白質合成來阻止細菌生長，與之相反，非典型四環素似乎擾亂了細菌胞質膜的組織，從而導致細胞死亡[45]。1962年首次報道自Amycolatopsis sulphurea分離的CHD，典型的四環素在C-2上有一個碳酰胺基團，與之相比，CHD具有不同尋常的結構特征，包括C-2上有一個乙酰基，環上有獨特的芳構化模式C和C-9的功能化[46]。

2013年，從Amycolatopsis sulurea中克隆出CHD生物合成基因簇（chd），它包含18個候選ORF和一個II型PKS。推測CHD可能的生物合成途徑：第一步是合成新生聚酮主鏈，由最小的II型PKS催化，該基因由酮合酶α、酮合酶β和酰基載體蛋白（分別由chdP，chdK和chdS編碼）組成。接下來是CHD主鏈的環化和芳構化，以及對核心的修飾，包括C-9甲基化和C-4羥基化（圖6）[47]。CHD生物合成途徑中的許多基因在典型的四環素生物合成途徑中沒有對應的基因，這與C-9甲基轉移酶chdMII、C4-氨基轉移酶chdN和輸出/抗性基因chdR有關，因此表明CHD基因簇整合了來自II型金黃色酸PKS系統的基因[48]。總的來說，這些酶促使分子具有獨特的環C芳構化，從而導致四環素主鏈的不尋常結構。此外，大多數II型PKSs被認為是由一個丙烯基單位的脫羧引發的，CHD的生物合成是由乙酸引發的，這種差異表明，通過組合生物合成有效地產生了新四環骨架[46]。

3.3 ECO-0501

13-羥基-2，12，14，16，22-五甲基-28-八烷基-2，4，6，8，10，14，20，24-辛烯酸（2-羥基-5-氧-環戊烯-1-烯基）酰胺（ECO-0501）是2006年通過基因組掃描技術發現的一種新型線性多烯類抗生素[49]。該化合物從Amycolatopsis orientalis中分離得到，其結構定義了一個新的聚酮類抗菌藥物：辛烯酸葡糖苷。

ECO-0501生物合成集群的跨度約為100 kb，由27個ORF組成，其中包括一個Ⅱ類PKS。基于其與合成抗真菌劑ECO-02301基因簇的相似性[50]，ECO-0501生物合成途徑預測為PKS體系（ORFs 18-23）可生成含有多烯發色團的長聚酮骨架。三個ORF編碼將精氨酸轉化為4-胍-硝基丁基輔酶A的酶，并將活化的4-胍-硝基丁基裝載到第一個PKS模塊的裝載酰基載體蛋白結構域上，從而確定了聚酮的起始單元。兩個ORF為5-氨基乙酰丙酸酯的合成提供了酶，并通過輔酶A酯將其轉化為氨基—羥基環戊烯酮，而氨基—羥基環戊烯酮被編碼的酶濃縮到聚酮鏈的羧基端ORF 15。由ORF13編碼的糖氧化還原酶將D-葡萄糖氧化形成D-葡萄糖醛酸，隨后通過糖基轉移酶（ORF 14）將其轉移到聚酮鏈的羥基上（圖7）[49]。通過逆轉錄PCR對ECO-0501基因簇表達分析表明，ECO-orf 4的轉錄與聚酮化合物生物合成的基因轉錄相關，這些結果表明ECO-orf 4是ECO-0501生物合成所必需的途徑特異性正調控基因[51]。

4 總結與展望

擬無枝酸菌屬提供了大量有價值的抗生素，從該屬菌株中分離出的六種類型抗生素已被闡明。除了ECO-0501是通過基因組分析和經典篩選方法發現外，幾乎所有這些活性產物都是基于經典的生物測定指導分離研究發現的。在Amycolatopsis orientalis ATCC 43491中發現了至少10個產生次生代謝產物（包括ECO-0501，但不包括萬古霉素）的遺傳位點。這使人們再次認識到這個屬的生物合成潛力還遠沒有得到充分利用。

基因組測序和基因操作技術的快速發展使研究人員能夠研究這些次生代謝產物的生物合成基因，以及生物體采用的酶促策略。對這些途徑的理解，便于考慮調整生物合成系統，使其利益最大化。此外，為了設計具有特異性途徑來生產新的“非自然”產品，應該加大努力，破譯當下難以捉摸的沉默或神秘基因簇。

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