提高截短側(cè)耳素產(chǎn)量的研究進展

收稿日期：2023-09-26

作者簡介：孫穎飛，碩士研究生，制藥工程師，主要從事菌種選育研究工作。

*通信作者：張萍，制藥工程師，主要從事生物發(fā)酵菌種改造、管理工作。

摘要：截短側(cè)耳素（Pleuromutilin）是萜類化合物中半合成抗生素的合成前體之一，是由大型擔子菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌屬于真核生物，改造相對復雜，但市場需求量在不斷擴大，可見在對截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的改良中挑戰(zhàn)和應用潛力并存。本文總結(jié)了截短側(cè)耳素的生物合成途徑，并對截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的誘變育種、基因工程育種及其異源表達等有關增產(chǎn)的相關研究進行了綜述，以期對截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌進行更深入的了解，為后續(xù)的菌種改良提供參考。

關鍵詞：截短側(cè)耳素；生物合成途徑；菌種改良；異源表達

中圖分類號：R978.1" " " " "文獻標志碼：A" " " " "文章編號：1001-8751（2024）02-0084-10

Research Progress in Improving Pleuromutilin Production

Sun Ying-fei，" "Shi Yan-peng，" "Niu Chun，" "Zhang Ping

（Ningxia Tairui Pharmaceutical Co.， Ltd.，" "Yinchuan" "750101）

Abstract： Pruromutilin is one of the synthetic precursors of semi-synthetic antibiotics in terpene compounds and is a secondary metabolite produced by large basidiomycetes. The transformation of fungi is relatively complex， and the market demand is constantly expanding， indicating that there are challenges and potential applications coexisting in the improvement of pleuromutilin producing bacteria." In order to better understand pleuromutilin-producing bacteria and serve as a guide for future strain improvement， this article provides an overview of the biosynthetic pathways of pleuromutilin and reviews relevant research on mutation breeding， genetic engineering breeding， and heterologous expression of pleuromutilin producing bacteria.

Key words： pleuromutilin;" "biosynthetic pathways;" "strain improvement;" "heterologous expression

截短側(cè)耳素（Pleuromutilin）是一種三環(huán)二萜類次級代謝產(chǎn)物，1951年首次從Pleurotus passeckerianus（同菌異名Clitopilus passeckerinus）和Pleurotus mutilus（同菌異名Omphalina mutila、C.scyphoides和F.mutilus）中分離得到[1-2]。截至2009年已鑒定出11株截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌[1]。

截短側(cè)耳素主要通過與50S核糖體亞基的肽基轉(zhuǎn)移酶中心相結(jié)合，抑制原核蛋白質(zhì)合成從而發(fā)揮其抗菌活性，此外，截短側(cè)耳素與細菌核糖體獨特的結(jié)合位點也使其具備了低耐藥性的特點[3-4]。這些有利的特性使截短側(cè)耳素具有極大的發(fā)展?jié)摿Α＝囟虃?cè)耳素母核的三環(huán)結(jié)構、C-14位的酯基、C-3位的羰基和C-11位的羥基是抗菌活性所必需的官能團（圖1）[5]。截短側(cè)耳素常常作為抗生素開發(fā)的前體和起點，經(jīng)過半合成的方式開發(fā)成新的截短側(cè)耳素類抗生素以獲得更好的療效。截短側(cè)耳素的改造大部分都集中在C-14側(cè)鏈[5]，目前已經(jīng)上市的相關藥物有：獸用的泰妙菌素（Tiamulin）、沃尼妙林（Valnemulin），人用批準的瑞他莫林（Retapamulin）和來法莫林（Lefamulin）[6]。

截至2022年，截短側(cè)耳素的生產(chǎn)主要面臨著生產(chǎn)企業(yè)少、產(chǎn)量低、發(fā)酵周期長等問題，高產(chǎn)菌株的選育和新型制劑的研發(fā)一直是截短側(cè)耳素類似物的研究熱點，高價值萜類化合物的研發(fā)已成為科研人員和企業(yè)的共同目標。了解抗生素的生物合成途徑可以為基因工程育種提供思路和方法，因此本文總結(jié)了截短側(cè)耳素的生物合成途徑，并從基因工程育種、誘變育種和異源表達等角度對截短側(cè)耳素增產(chǎn)的相關研究進行了綜述。

1 截短側(cè)耳素的生物合成途徑

截短側(cè)耳素的核心結(jié)構是通過甲羥戊酸途徑（MVA）完成的，由乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）分子作為起始，經(jīng)一系列反應后形成牻牛兒牻牛兒基焦磷酸（Geranylgeranyl diphosphate， GGPP）[7-8]，見圖2。GGPP是萜類的廣泛前體，也是截短側(cè)耳素合成的前體。在二萜環(huán)化酶（又名二萜合酶，Diterpene cyclases， DTS）的作用下，GGPP形成三環(huán)的骨架核心，GGPP環(huán)化產(chǎn)物再經(jīng)過多步反應及修飾最終形成截短側(cè)耳素。近年來多項研究通過體外酶促反應和生物轉(zhuǎn)化實驗進一步闡明了截短側(cè)耳素生物合成下游的主要途徑。

Bailey等[7]從產(chǎn)生菌Clitopilus passeckerianus基因組中鑒定出合成截短側(cè)耳素的基因簇：Pl-ggs（香葉基香葉基焦磷酸合酶）、Pl-cyc（二萜合酶）、Pl-atf/Pl-P450-2/Pl-P450-3（三種細胞色素P450氧化酶）、Pl-sdr（短鏈脫氫酶/還原酶）、Pl-atf（酰基轉(zhuǎn)移酶）、Pl-p450-1、Pl-p450-2和Pl-p450-3（三種細胞色素P450氧化酶），并通過生物合成學方法將截短側(cè)耳素基因簇在異源菌米曲霉（Aspergillus oryzae）中表達成功，這是第一個在子囊菌中成功表達的擔子菌基因簇，同時也揭示了截短側(cè)耳素生物合成下游的主要途徑。Alberti等[9]在Bailey的基礎上，通過異源轉(zhuǎn)化表達上述基因，并對生物合成及異源表達的部分合成途徑的細節(jié)進行了詳細的補充和說明。實驗以及同源性比對結(jié)果表明，Pl-cyc被推斷為編碼雙功能的二萜合酶，Pl-cyc的Ⅱ類萜烯合酶結(jié)構域在GGPP的質(zhì)子化依賴性環(huán)化過程中促進環(huán)收縮，然后I類萜烯合酶結(jié)構域通過電離依賴性去磷酸化催化八元環(huán)的形成。最后通過水捕獲在三環(huán)支架的C-14處引入分子的第一個羥基。Yamane等[10]利用GGPP合成酶對Clitopilus pseudopinsitus基因組的測序數(shù)據(jù)進行BLAST搜索，搜索出了一條基因簇（Ple），包括GGPP合成酶（Ple4）、萜烯合成酶（又名二萜合酶， Ple3）、細胞色素P450（Ple1、5、6）、短鏈脫氫酶（Ple7）和酰基轉(zhuǎn)移酶（Ple2）。該基因簇結(jié)構與2016年Bailey等報道的非常相似。之后該課題組通過米曲霉異源表達和體外酶反應實驗報告了參與截短側(cè)耳素生物合成的所有生物合成酶的功能特征，并闡明了相關的生物合成路徑。

結(jié)合以上研究表明繼MVA途徑形成前體物質(zhì)GGPP后，二萜合酶將GGPP轉(zhuǎn)化為姆替林前體Premutilin，化合物Premutilin在細胞色素P450氧化還原酶的作用下，分別在五元環(huán)的C-3位和八元環(huán)的C-11位發(fā)生羥基化生成化合物3，11-hydroxypremutilin，當Ple6單獨催化化合物Premutilin時，則只在五元環(huán)的C-3位發(fā)生羥基化產(chǎn)生化合物3-hydroxypremutilin，同時也證明了化合物3-hydroxypremutilin通過Ple5的催化作用可以產(chǎn)生3，11-hydroxypremutilin，化合物Premutilin經(jīng)Ple5催化，在八元環(huán)C-11發(fā)生羥基化產(chǎn)生11-hydroxypremutilin，這些結(jié)果揭示了從化合物Premutilin到化合物3，11-hydroxypremutilin的兩條氧化途徑參與了生物合成。化合物Premutilin在兩種細胞色素P450氧化還原酶和短鏈脫氫酶的共同作用下生成化合物Mutilin，化合物Mutilin在乙酰轉(zhuǎn)移酶的催化作用下生成化合物14-O-acetylmutilin，隨后氧化還原酶催化14-O-acetylmutilin的乙酰基側(cè)鏈的α位置，經(jīng)羥基化從而生成最終化合物截短側(cè)耳素。同時，通過體外酶反應和突變分析實驗表明，二萜合酶從催化GGPP到具有特征性5/6/8-三環(huán)碳骨架的Premutilin的兩輪環(huán)化。這些結(jié)果進一步驗證及肯定了Bailey和Alberti的研究工作，提示相關基因參與了截短側(cè)耳素合成途徑，具體路徑詳見圖2。

Guo等[11]于2022年已鑒定出Omphalina mutila產(chǎn)生菌中截短側(cè)耳素的生物合成基因簇（omm基因簇），并在工程釀酒酵母BY-T20中進行了表達。二萜合成酶（OmmC）導入釀酒酵母后產(chǎn)生化合物Premutilin，然后，將兩種細胞色素P450酶（OmmE/F）整合到重組菌株中獲得化合物3-hydroxypremutilin和3，11-hydroxypremutilin，隨后在短鏈脫氫酶/還原酶（OmmG）的作用下生成化合物Mutilin，化合物Mutilin在酰基轉(zhuǎn)移酶基因（OmmB）的催化下生成化合物14-O-acetylmutilin，在細胞色素P450酶（OmmA）的作用下生成截短側(cè)耳素。由此可見，近年來多項研究共同闡明并驗證了截短側(cè)耳素生物合成的同一條途徑，見圖2。

2 截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌種改良研究進展

工業(yè)生產(chǎn)中，菌種選育的目的主要是通過改善工藝條件和遺傳學等手段改良目標菌種的特性，使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀得以保存或強化，去除不良性質(zhì)甚至增加新的性狀，使菌種更有利于穩(wěn)定生產(chǎn)目標物質(zhì)。目前的微生物育種技術主要有：誘變育種、代謝工程育種、原生質(zhì)體融合育種、基因工程育種和雜交育種等，本文綜合了幾種微生物育種技術在截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌中的應用。

2.1 分子改造在截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的應用

截短側(cè)耳素原始產(chǎn)生菌相關基因改造成功的案例鮮有報道，但與截短側(cè)耳素生物合成相關的MVA途徑代謝通路的研究一直是萜類化合物分子改造重點之一。如：HMGR-1蛋白催化結(jié)構域tHMG1（3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶）的過表達可以提高萜類產(chǎn)量[12]；將釀酒酵母中的FPS基因（法尼基焦磷酸合成酶）導入煙草，可以將煙草中FPPS的活性提高到原來的12倍，下游產(chǎn)物生物固醇和類胡蘿卜素的產(chǎn)量也得到了明顯的提升[12]；周雍進等[13]提出并利用模塊化途徑工程策略（即工程萜類合酶及前體供應酶基因融合表達），分別將基因SmCPS（柯巴基焦磷酸合酶）與SmKSL（類貝殼杉烯合酶）融合，BTS1（GGPP合成酶）與ERG20（FPP合成酶）融合，使丹參酮的關鍵中間體Miltiredene的產(chǎn)量提高，并減少了副產(chǎn)物的積累，表明催化靶向途徑內(nèi)兩個連續(xù)反應的酶的融合有助于提高工程途徑的有效性。

研究截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌遺傳操作分子工具構建，截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌（如Clitopilus passeckerianus等）的雙核性質(zhì)使其通過常規(guī)誘變和篩選進行菌株改良變得困難，任何隱性突變都會受到第二個核的保護，并且只會觀察到顯性效應。相關研究已開發(fā)用于修改該物種基因表達的工具，旨在利用分子生物學方法去減輕這些限制。Kilaru等[14]已構建了用于產(chǎn)截短側(cè)耳素的真菌（Clitopilus passeckerianus）的遺傳操作的分子工具，并利用Agaricus bisporus gpdII啟動子（雙孢酵母gpdII啟動子）和Aspergillus nidulans trpC終止子（構巢曲霉trpC終止子），通過Clitopilus passeckerianus基于hph潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)成功表達了GFP和DsRed兩種熒光蛋白，并且RNA干擾（RNAi）結(jié)果顯示該操縱子可以沉默部分熒光蛋白的表達，證明RNAi介導的基因沉默可以作為敲低Clitopilus passeckerianus中特定基因表達的一種手段。自此之后，潮霉素基因抗性以及277 bp-Agaricus bisporus" gpdII和Aspergillus nidulans trpC等分子工具也被多次應用于截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的改造當中[7，15] 。隨后de Mattos-Shipley等[16]在Clitopilus passeckerianus的內(nèi)部EST（表達序列標簽）數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了大量表達的基因cprp，通過反義cprp沉默該基因后發(fā)現(xiàn)，cprp的沉默會顯著降低截短側(cè)耳素的產(chǎn)量，說明cprp基因可能影響截短側(cè)耳素的生物合成。之后該實驗室通過NCBI Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)Cprp蛋白與釀酒酵母的應激反應蛋白DDR48具有顯著的序列相似性。并在釀酒酵母Y16748（ddr48突變株）中過度表達ddr48或cprp基因，但結(jié)果卻導致該菌株生長率的顯著降低，相關研究推測DDR48可能參與營養(yǎng)信號傳導，過度表達可能會導致酵母細胞進入穩(wěn)定期，出現(xiàn)細胞周期停滯的特征，這種現(xiàn)象通常在營養(yǎng)耗盡時發(fā)生[16]，說明Cprp蛋白可能在協(xié)調(diào)進入穩(wěn)定期與二次代謝等過程的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。該項研究中并未說明在生產(chǎn)菌Clitopilus passeckerianus中過表達cprp基因是否會影響截短側(cè)耳素的產(chǎn)量，該基因在截短側(cè)耳素生物合成中的具體作用還有待進一步探索。

2022年Schafhauser等[15]利用Illumina測序和Nanopore測序相結(jié)合的混合組裝策略得到了雙核真菌Clitopilus passeckerianus DSM1602的高質(zhì)量核和線粒體基因組序列，包括功能基因組注釋。使用截短側(cè)耳素生物合成基因簇（BGC）的萜烯合酶進行BLAST搜索。發(fā)現(xiàn)Clitopilus passeckerianus的基因組中存在76個BGC，其中包含55個萜烯BGC，其中有兩個基因簇被分配給截短側(cè)耳素生物合成。由于Clitopilus passeckerianus的基因組來自雙核體，Clitopilus passeckerianus雙核基因組中存在的BGC總數(shù)肯定明顯高于76個數(shù)量，因此，獨特的非同源BGC的數(shù)量肯定高于該值的一半。這顯示了該真菌產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的巨大遺傳能力，也給截短側(cè)耳素的菌種改良帶來了新的希望。

2.2 誘變育種在截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的應用

由于截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌屬于真核生物，遺傳背景復雜，具備雙核或多核細胞且不存在有性生殖階段等特點，該產(chǎn)生菌分子水平的改造至今依然沒有獲得突破性的進展。所以該菌種在工業(yè)生產(chǎn)中依然以傳統(tǒng)誘變育種的方式獲得目標菌。

截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌常用的誘變方法有：紫外誘變、化學誘變、常壓室溫等離子體（ARTP）誘變育種和重離子輻照誘變，或者幾種方法聯(lián)合誘變等。由于誘變的隨機性會增加篩選高產(chǎn)菌的工作量，誘變需要聯(lián)合比較好的篩選方法才能取得事半功倍的效果。常用的篩選方法有透明圈抑菌試驗、高通量固體發(fā)酵檢測和抗生素篩選等，見表1。

梁劍平實驗室利用重離子加速器對截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌Clitopilus passeckerianus進行重離子輻照誘變篩選高產(chǎn)菌株，得到搖瓶效價比對照菌株提高25.3%的菌株。并通過響應面法對篩選得到的高產(chǎn)菌株進行了搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化，使其效價達到24 750 μg/mL[18]。

原生質(zhì)體誘變技術主要是對原生質(zhì)體進行物理或化學誘變處理，經(jīng)再生培養(yǎng)后選育突變株。相對于菌絲而言，失去細胞壁的原生質(zhì)體對誘變劑更加敏感，與常規(guī)誘變相比原生質(zhì)體誘變具有較高的突變率，更容易分離成單細胞體便于后期篩選。因此，原生質(zhì)體誘變育種也是工業(yè)育種常用的手段。早期有研究利用5%諾瓦酶Novozyme234在25 ℃下處理截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌Clitopilus Pinsitus菌體2 h，在高滲培養(yǎng)基中篩選，原生質(zhì)體的再生率可達到70%～80%[24]。但是在后續(xù)的研究中原生質(zhì)體的再生率只有1.20‰[17]，提示對照的選擇和再生率的計算方式和實驗方法等可能對再生率都有很大的影響。

側(cè)耳屬真菌中含有豐富的甾體類物質(zhì)如麥角甾醇，制霉菌素和特比萘芬屬于抗真菌抗生素，能夠抑制真菌細胞被麥角甾醇的生物合成，同時會在一定程度改變細胞膜的通透性。有研究以特比萘芬作為抗性篩選標記，利用亞硝基胍（NTG）對Clitopilus prunulus進行誘變。得到截短側(cè)耳素高產(chǎn)突變子Clitopilus prunulus-40，同時發(fā)現(xiàn)其麥角甾醇含量降低，提示麥角甾醇可能通過改變細胞膜通透性影響了截短側(cè)耳素的生物合成[20]。推測細胞通透性增大后，截短側(cè)耳素向胞外滲透，達到解除終產(chǎn)物的反饋抑制效果。另外麥角甾醇的含量降低或許也可以使更多前體物質(zhì)流向截短側(cè)耳素合成的方向。誘變后，抗生素性狀與次級代謝產(chǎn)物的合成的關系改變的原因目前還不甚明確，但對于這種耐藥性狀與次級代謝物合成效率同時變化的現(xiàn)象，有人推測是生物合成或調(diào)控基因與耐藥基因緊密連鎖，繼而發(fā)生共突變；也有人推測是抗生素的核糖體篩選作用可以獲得核糖體功能改變的突變株，提示核糖體的改變對蛋白合成能力的改變以及對次級代謝產(chǎn)物的生物合成都有一定的影響。

2.3 化學表觀遺傳試劑誘變在截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的應用

通過添加各種小分子修飾劑來實現(xiàn)對基因轉(zhuǎn)錄的表觀調(diào)控（如DNA甲基化和組蛋白修飾），即為化學表觀遺傳修飾。通過化學表觀遺傳試劑誘變菌株，激活真菌中未被激活的沉默基因簇也是菌種改良的一種新方式。周銳[25]利用表觀遺傳試劑伏立諾他和5-氮雜胞苷對Pleurotus mutilus-04進行菌種改良。結(jié)果顯示5-雜氮胞苷對截短側(cè)耳素的產(chǎn)量沒有影響，但伏立諾他卻使截短側(cè)耳素的產(chǎn)量下降了百分之八十以上。其他文獻未見關于此菌種誘變成功案例，說明該誘變方法還需進一步改進。

2.4 通過控制代謝分流提高產(chǎn)素能力的相關研究

甲羥戊酸途徑的中間產(chǎn)物FPP作為眾多產(chǎn)物合成的前體，是倍半萜、二萜和四萜化合物合成途徑的主要競爭支路途徑之一。麥角甾醇（Ergosterol）是一種特殊的細胞膜成分，影響細胞膜的流動性和滲透性，在真菌的生長、繁殖和脅迫耐受性方面起著重要作用。在真菌中，MVA途徑也作為角鯊烯（Squalene，麥角甾醇合成前體）生物合成的上游發(fā)揮作用。因此，通過比較萜類化合物和麥角甾醇之間變化的關系，可以為構建萜類化合物的高效合成細胞提供新的方向。

角鯊烯合酶（Erg9）和角鯊烯環(huán)氧酶（Erg1）是麥角甾醇生物合成途徑的關鍵酶，是FPP下游最鄰近的兩種作用酶，眾多文獻表明沉默或抑制Erg9和Erg1會降低麥角甾醇的合成，并有利于FPP的積累，從而增加FPP下游物質(zhì)的產(chǎn)量。Paradise等[26]通過替換Erg9啟動子為Met3啟動子，發(fā)現(xiàn)下調(diào)甾醇合成途徑第一步Erg9基因的表達水平可以減少旁支途徑角鯊烯和麥角固醇的含量，使FPP下游紫穗槐二烯的產(chǎn)量提高了5倍。Peng等[27]通過減少旁支途徑中角鯊烯的合成而使更多的FPP用于合成GGPP和番茄紅素。Xie等[28]在最新研究中通過使用Erg9p降解蛋白，發(fā)現(xiàn)與不適用抑制劑組相比，可以使橙花叔醇的產(chǎn)量提高86%。角鯊烯是FPP下游的產(chǎn)物之一（見圖2），通過以上研究可知，通過抑制角鯊烯合酶（Erg9）可以積累上游產(chǎn)物FPP的含量，并使FPP偏向于GGPP及其下游產(chǎn)物的合成。同樣的道理也適用于角鯊烯環(huán)氧酶（Erg1）。

麥角甾醇生物合成是一個高耗能過程，Jordá等[29]總結(jié)了釀酒酵母的甾醇生物合成、運輸和解毒系統(tǒng)，并指出特比萘芬是以角鯊烯環(huán)氧酶Erg1為靶點，導致麥角甾醇上游產(chǎn)物角鯊烯等物質(zhì)的積累，可用于萜烯的合成。李冰[30]將鹽酸特比萘芬添加到48 h搖瓶發(fā)酵液中，可以使截短側(cè)耳素的產(chǎn)量提高31%，同時發(fā)現(xiàn)麥角甾醇的產(chǎn)量具有顯著下降的趨勢，說明鹽酸特比萘芬的加入影響代謝流偏向了截短側(cè)耳素的合成。

擔子菌Hypholoma subtertium鯊烯環(huán)氧化物酶基因（erg1）已被克隆，Godio等[31]使用雙孢菇gdh啟動子表達的構建體沉默erg1基因的結(jié)果表明，角鯊烯環(huán)氧化物酶參與克拉維酸的形成和麥角甾醇的生物合成， erg1基因的過表達可以使克拉維酸產(chǎn)量增加32%至97%，而erg1的沉默可以導致麥角甾醇依賴型的完全生長。證實erg1影響抗腫瘤產(chǎn)物克拉維酸的生物合成，表明氧化鯊烯是該擔子菌中初級代謝（甾醇）和次級代謝產(chǎn)物的重要分支點。

甾醇C-24還原酶（Erg4）是麥角甾醇生物合成后期的作用酶，Liu等[32]發(fā)現(xiàn)敲除Erg4基因破壞麥角甾醇生物合成途徑會導致膜滲透性增加，可以誘發(fā)深層發(fā)酵中細胞外紅曲色素的過量產(chǎn)生和分泌，由此可以提高細胞外紅曲色素MPs（exMPs）的產(chǎn)量，降低了下游加工成本。

眾多結(jié)果顯示在一定程度內(nèi)降低麥角甾醇生物合成的代謝流可以提高FPP轉(zhuǎn)化合成倍半萜化合物、二萜化合物和四萜化合物的效率。并且，甾醇代謝的基因改變可以降低這些昂貴化學物質(zhì)的濃度，從而大大降低生產(chǎn)成本。由此推測利用RNAi介導的基因沉默手段可能降低截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌中麥角甾醇生物合成基因的表達，或許也可以作為提高截短側(cè)耳素的生產(chǎn)能力的潛在方法，達到高產(chǎn)性狀，得到穩(wěn)定遺傳的效果。

3 截短側(cè)耳素異源表達研究進展

3.1 米曲霉異源表達截短側(cè)耳素基因簇

由于截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌屬于真核生物，真菌自身的復雜性，截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌基因工程選育的成功案例鮮有報道，但最近幾年由于合成生物學的快速發(fā)展使其逐步應用到截斷側(cè)耳素的研究當中，并獲得了突破性的進展。

Bailey等[7]曾在Clitopilus passeckerianus中試圖過度表達截短側(cè)耳素的生物合成基因。利用天然啟動子用于驅(qū)動表達八個基因Pl-p450-3、Pl-atf、Pl-cyc、Pl-ggs、Pl-p450-1、Pl-p450-2、Pl-sdr和Cp-fbm。然而在多個轉(zhuǎn)化菌株中，截短側(cè)耳素產(chǎn)量沒有增加反而減少或缺失，表明Clitopilus passeckerianus具有一種“感覺抑制”機制，即外源基因的引入將抑制外源和內(nèi)源性拷貝基因的表達。這種現(xiàn)象已經(jīng)在其他擔子菌類真菌中發(fā)現(xiàn)，如新生隱球菌Cryptococcus neoformans和裂褶菌Schizophyllum commune[33-34]。由于使用天然啟動子的過度表達并不能提高截短側(cè)耳素的產(chǎn)量，該研究[7]進而選擇雙孢菌（Agaricus bisporus ）的組成型強啟動子gpdII用于六種基因在Clitopilus passeckerianus中的表達。已知雙孢菌的gpdII啟動子可驅(qū)動Clitopilus passeckerianus的強表達。法尼二磷酸合酶基因（Cp-fds）被包括在這一組中，因為增加底物對途徑的可用性可以增加產(chǎn)量。但是只有一株過表達Pl-ggs的菌株顯示出約50%的截短側(cè)耳素滴度增加，而所有其他菌株顯示出截短側(cè)耳素產(chǎn)量均沒有變化或滴度降低。他們還克隆了包含推定簇的整個基因組區(qū)域，并將其以額外拷貝的形式引入到Clitopilus passeckerianus的基因組中，但也未能實現(xiàn)抗生素產(chǎn)量可重復的顯著增加效果。為改進抗生素的生產(chǎn)并找到可選擇的替代平臺，Bailey繼續(xù)在米曲霉Aspergillus oryzae中重建了截短側(cè)耳素的總生物合成途徑。從Clitopilus passeckerianus中克隆所需的7個基因cDNA序列，在米曲霉中重建并表達了7個基因的側(cè)耳素基因簇。重組菌株截短側(cè)耳素的最高產(chǎn)量可達84.24 mg/L，達到野生型菌株的截短側(cè)耳素產(chǎn)量（8 mg/L）的10.53倍，由于培養(yǎng)周期縮短了一半，該產(chǎn)量也可以認為是野生型菌株的21.06倍。這是第一個在子囊菌中成功表達的擔子菌基因簇，為真菌群中高產(chǎn)菌的開發(fā)開辟了新的道路。

Yamane等[10]通過米曲霉異源表達，其發(fā)現(xiàn)了截短側(cè)耳素合成的基因簇以及體外酶反應實驗，報道了參與截短側(cè)耳素生物合成的所有生物合成酶的功能特征，并闡明了截短側(cè)耳素的生物合成途徑，為從擔子菌真菌中分離的天然產(chǎn)物的酶促合成奠定了基礎。

3.2 釀酒酵母異源表達截短側(cè)耳素基因簇

由于細菌缺少翻譯后修飾功能，很難作為底盤細胞生產(chǎn)具有抗菌活性的萜類物質(zhì)，因此研究者也常常采用釀酒酵母進行萜類的生物合成[35-36]。酵母能夠直接合成較多的二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）和異戊二烯焦磷酸（IPP），為萜類產(chǎn)物的合成提供大量前體物質(zhì)。選用酵母作為底盤細胞還可以通過基因工程手段保留最小基因組，在萜類的生物合成過程中減少其內(nèi)源消耗。在酵母細胞中所有的基因工程操作都可以通過染色體融合完成，保證了工程菌株的遺傳穩(wěn)定性[36]。

可能因為核冗余和一種稱為感覺抑制現(xiàn)象的原因，在以往研究中所有旨在增加原始菌株（Pleurotus passeckerianus和Pleurotus mutilus）中Pleuromutilin產(chǎn)量的嘗試（例如，通過插入額外的生物合成基因）均未成功[7， 14， 37]。盡管Pleuromutilin在藥物研發(fā)中具有重要作用，但截至2022年Pleuromutilin產(chǎn)生菌的基因組序列未有報道。Schafhauser等[15]建立了產(chǎn)側(cè)耳素真菌Clitopilus passeckerianus的高質(zhì)量基因組注釋，為未來的研究提供了寶貴的資源。并在Bailey和Yamane等研究的基礎上，將截短側(cè)耳素生物合成基因成功地重組成酵母特異性基因簇，構建了截短側(cè)耳素生物合成基因簇pleBGC表達盒，計劃將重構的酵母pleBGC轉(zhuǎn)移到合適的釀酒酵母菌株中進行異源表達。而Guo等[11]已將Omphalina mutila中Pleuromutilin的生物合成基因簇（omm基因簇）在GGPP工程釀酒酵母（GGPP-engineered Saccharomyces cerevisiae）中成功表達。二萜合成酶（OmmC）導入釀酒酵母后產(chǎn)生12.2 mg/L的Pleuromutilin，隨后通過提高OmmA的拷貝數(shù)使Pleuromutilin的產(chǎn)量提高到7.3倍。相對于真菌而言，酵母的繁殖周期短，更易于改造，截短側(cè)耳素的異源表達為工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的希望。

4 提高截短側(cè)耳素產(chǎn)量的其他途徑

4.1 傳統(tǒng)發(fā)酵工藝優(yōu)化

岳威[38]利用正交試驗方法總結(jié)了發(fā)酵工藝中對種子液影響較大的幾個因素包括：葡萄糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀和硫酸亞鐵；對發(fā)酵液影響較大的因素主要有葡萄糖、玉米漿和豆油。該實驗結(jié)果為后續(xù)的工藝優(yōu)化提供了重要的參考。李云飛等[39]對初始pH值、溫度和溶氧條件等發(fā)酵條件進行了單因素實驗，并確定了該實驗室條件下發(fā)酵水平較高的相應參數(shù)。另外發(fā)酵模式也會影響截短側(cè)耳素的產(chǎn)量，許瑞娟等[40]測試了新的發(fā)酵模式對截短側(cè)耳素產(chǎn)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于常規(guī)的發(fā)酵模式，直接將大罐中生長到對數(shù)期的細胞接入新的大罐可以顯著提高截短側(cè)耳素的效價。

4.2 影響截短側(cè)耳素生物合成的誘導因子

影響截短側(cè)耳素生物合成的誘導因子鮮有報道，陳曉麗等[20]曾利用制霉菌素、特比萘芬、表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）和氯化十二烷基三甲銨（DTAC）作為抗性篩選標記進行抗性突變子篩選獲得了大量產(chǎn)量提高的突變子，并證明制霉菌素和特比萘芬抗性突變子的正突變率較高。

4.3 優(yōu)化提取工藝

目前，截短側(cè)耳素主要通過溶劑提取來獲得，甲醇是截短側(cè)耳素最常用的萃取劑，但也有人證明乙醚的提取效率比甲醇高[41]，另外提取的過程如溫度也會影響提取的效率，張宗鵬等[42]的研究顯示K銅在40 ℃和60 ℃溫度下萃取效果高于甲醇。胡昌華實驗室證明[43]醋酸丁酯是提取截短側(cè)耳素的優(yōu)良溶劑，其建立的優(yōu)化工藝具有操作簡便、提取時間短、產(chǎn)物易于純化和成本低等優(yōu)點。也有企業(yè)在原有生產(chǎn)工藝的基礎上，采用丙酮浸提，大孔樹脂吸附和重結(jié)晶的方法，使產(chǎn)品的含量由原來的90%提高到97%以上[44]。工業(yè)生產(chǎn)中，提高產(chǎn)量不是唯一的目標，綜合成本、安全和操作方便等多方面的考量才能確定更加合適的提取純化工藝。

5 總結(jié)

截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌屬于真核生物，遺傳背景復雜，工業(yè)生產(chǎn)中的育種方法主要還是以傳統(tǒng)誘變育種為主，但傳統(tǒng)誘變又面臨著工作量大、正向突變率低、遺傳不穩(wěn)定等問題。由此可見尋找一種高效穩(wěn)定的篩選方法顯得尤為重要，目前關于截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌株常用的篩選方法有抑菌圈實驗、高通量固體發(fā)酵或抗生素篩選等。對于誘變育種得到的高產(chǎn)性狀不穩(wěn)定，可能是由于菌絲分離不完全、多核導致的突變核基因丟失等問題，針對這些問題，研究人員已經(jīng)從原生質(zhì)體的水平對菌株進行誘變，期望可以獲得性狀良好且穩(wěn)定的菌株。

近年來，隨著合成生物學的快速發(fā)展，截短側(cè)耳素已經(jīng)在米曲霉和釀酒酵母中表達成功，并且產(chǎn)量均高于原始菌株。雖然部分萜類化合物如青蒿酸已經(jīng)實現(xiàn)了在釀酒酵母中的工業(yè)化生產(chǎn)，但大多數(shù)萜類化合物由于合成關鍵酶在釀酒酵母中的表達活性低和受酵母內(nèi)源調(diào)控的影響等原因?qū)е缕洚a(chǎn)量仍局限于毫克每升甚至是微克每升的水平，尚未達到工業(yè)化生產(chǎn)的需求。異源表達工程菌的產(chǎn)量依然沒有正在使用的工業(yè)生產(chǎn)菌的產(chǎn)量高，所以，截短側(cè)耳素的異源表達技術對于工業(yè)化的生產(chǎn)的應用尚需時日。

雖然已經(jīng)有人建立了可以在Clitopilus passeckerianus中發(fā)揮作用的操縱子，但是在原始產(chǎn)生菌中過表達截短側(cè)耳素基因簇的實驗還是沒有得到理想增產(chǎn)的結(jié)果。而利用Agaricus bisporus" gpdII啟動子和Aspergillus nidulans trpC終止子等原件和相應的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可以成功抑制Clitopilus passeckerianus中某些蛋白的表達，提示利用該操縱子或許可以通過抑制旁支通路促進中間產(chǎn)物積累，達到目標產(chǎn)物增產(chǎn)的效果。如通過抑制截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的麥角甾醇生物合成途徑（見圖2藍色部分），達到GGPP累積的目的，從而獲得截短側(cè)耳素增產(chǎn)的效果。目前截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌Erg系列基因的沉默與截短側(cè)耳素產(chǎn)量關系的研究還沒有相關報道，這或許是在生產(chǎn)菌中提高截短側(cè)耳素產(chǎn)量的一種新的途徑。由此可見RNAi技術或許也可以為截短側(cè)耳素的增產(chǎn)指示一條新的方向。

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