ELISA方法測定重組人表皮生長因子滴眼液中rhEGF含量

摘 要 目的：建立重組人表皮生長因子（rhEGF）滴眼液中rhEGF含量的檢測方法，并進行方法學驗證。方法：應用商品化試劑盒Quantikine ELISA，采用酶聯免疫定量測定技術（ELISA）測定樣品中的rhEGF含量。結果：標準曲線的線性范圍為20～200 pg/mL；中間精密度所得相對標準偏差RSD為14.98%（n=9）。低、中、高3個質量濃度的平均回收率分別為94.08%、100.46%、104.89%，相對標準偏差分別為11.03%、9.85%、8.75%（n=3），重復檢測10次的相對標準偏差為5.58%。結論：該研究建立的ELISA方法專屬性強，精密度、準確度、穩定性均良好，適用于重組人表皮生長因子滴眼液中rhEGF含量的檢測。

關鍵詞 重組人表皮生長因子 ELISA 滴眼液

中圖分類號：R927.2； R988.1 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）05-0077-04

引用本文 張軍， 李玉柱， 樊婷婷. ELISA方法測定重組人表皮生長因子滴眼液中rhEGF含量[J]. 上海醫藥， 2024， 45（5）： 77-80.

Determination of recombinant human epidermal growth factor （ rhEGF） content in rhEGF eye drops by ELISA

ZHANG Jun1， LI Yuzhu2， FAN Tingting1，2

（1. Shanghai Haohai Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 201613， China； 2. Shanghai Li Kang Rui Biological Engineering Co.， Ltd.， Shanghai 201707， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the determination of rhEGF content in rhEGF （ recombinant human epidermal growth factor） eye drops and perform method validation. Methods： The content of rhEGF in eye drops was determined using a commercial kit Quantikine by enzyme-linked immuno sorbent assay （ELISA）. Results： The linear range of the standard curve was 20-200 pg/mL. The relative standard deviation （RSD） of intermediate precision was 14.98% （n=9）. The average recoveries of low， medium， and high concentrations of samples were 94.08%， 100.46% and 104.89% with RSD 11.03%， 9.85%， 8.75% （n=3）， respectively. The RSD for 10 replicates was 5.58%. Conclusion： The ELISA method established in this study has a good specificity， precision， accuracy and stability， and is suitable for the determination of the content of rhEGF in rhEGF eye drops.

KEY WORDS rhEGF； ELISA； eye drop

重組人表皮生長因子（recombinant human epidermal growth factor，rhEGF）是由53個氨基酸組成的活性多肽，具有廣泛的生物學效應，能促進各種表皮組織生長，應用廣泛。在醫學上用于燒燙傷、潰瘍、各類創傷及角膜損傷等的治療。添加至美容護膚品中可達到美白、抗皺、延緩衰老等作用。目前，國內市售的rhEGF及其衍生物劑型，包括溶液劑、凍干粉、凝膠劑、滴眼液等，均為外用制劑[1-2]。

目前制劑中rhEGF含量的檢測方法為中國藥典2020版三部收錄的rhEGF生物活性測定方法中的3T3細胞增殖法[3-4]。生物學活性檢測是評價生物技術藥物有效性的重要手段，在rhEGF相關產品的質量控制中至關重要。但是該方法具有明顯的缺點：涉及有毒試劑、信噪比較低、且采用細胞培養的方法而使實驗周期長，結果重復性也較差。因此，有必要開發檢測快速、準確度高的新方法。而類似于雙抗體夾心的方法[5-7]，能快速檢測樣品中的rhEGF含量，且檢測的靈敏度和準確度較高，對rhEGF的快速檢測具有一定的指導作用。

本研究參考中國藥典2020年版[4]通則179及《生物制品質量控制分析方法驗證技術審評一般原則》[8]的相關內容，采用酶聯免疫定量測定技術（雙抗體夾心ELISA法），測定rhEGF滴眼液中rhEGF的含量，驗證了方法的線性、專屬性、準確度和精密度、穩定性等，并對3批rhEGF滴眼液進行了測定。

1 材料和方法

1.1 儀器

ELx800酶標儀（BioTek公司）；恒溫恒濕箱（上海博訊公司）；移液器（Gilson公司）。

1.2 藥品與試劑

Quantikine ELISA試劑盒（RD公司產品，包含RD6N稀釋液、96孔板、酶標二抗、底物顯色液等）；rhEGF滴眼液供試品（上海昊海生物科技股份有限公司研發部自制，批號160308）；rhEGF原液（1.386 mg/mL，批號150618，內部標定標準品）。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

1）rhEGF滴眼液空白溶液 由磷酸氫二鈉0.048%、磷酸二氫鈉0.025%、氯化鈉0.85%、玻璃酸鈉0.1%、注射用水組成。

2）供試品溶液 取3管rhEGF原液各1 mL，分別加入276.2、137.6、68.3 mL rhEGF滴眼液空白溶液，稀釋至rhEGF濃度分別為5、10、20 μg/mL，得供試品，保存于2～8 ℃備用。

3）標準曲線溶液 取rhEGF原液，用rhEGF滴眼液空白溶液稀釋至濃度為10 μg/mL得標準品母液A。然后用RD6N稀釋液系列稀釋至200、133.3、88.9、59.2、39.5、26.3 pg/mL作為的rhEGF標準曲線溶液。

4）待檢樣品預處理 質控品、供試品溶液及rhEGF滴眼液樣品等需先用RD6N稀釋液稀釋至約100 pg/mL后方可加入96孔板檢測。

1.3.2 rhEGF含量測定

參考試劑盒說明書[9]。

1.3.3 計算

采用線性回歸計算法，以標準品濃度為橫坐標，OD450/OD570值作為縱坐標進行標準曲線擬合，并計算其線性R2。按公式：供試品中rhEGF含量（μg/mL）=計算值（pg/mL）×稀釋倍數/1 000 000計算，式中：計算值為測得的稀釋樣品OD值根據標準曲線計算所得的濃度。

2 方法學驗證結果

2.1 專屬性

取不含有rhEGF活性成分的0 μg/mL的滴眼液空白溶液與20 μg/mL的rhEGF滴眼液測定供試品的rhEGF含量。結果顯示，含有rhEGF的滴眼液樣品濃度為18.829 μg/mL，而未添加rhEGF滴眼液的基質濃度為0，說明該方法專屬性良好。

2.2 線性

測定標準曲線溶液中rhEGF的含量，每個濃度測定3次，每次每個稀釋度做兩個重復，測定值求平均值后計算供試品的含量。結果顯示，樣品濃度在26.3～200.0 pg/mL范圍內標準曲線呈線性，將吸光度OD450/OD570值進行線性擬合，得到一條線性標準曲線回歸方程y=0.007 4x+0.085 9，其擬合度R2>0.996 5，說明其該標準曲線線性較好。

2.3 中間精密度

取含量為10 μg/mL的rhEGF供試品溶液，在不同日期由2位試驗人員共測定3次，重復3次。結果顯示，3次測定的平均值都在（10±2）μg/mL范圍內波動，中間精密度所得相對標準偏差RSD為14.98%（n=9，表1），表明中間精密度符合《生物制品質量控制分析方法驗證技術審評一般原則》的要求。

2.4 準確度

取含量為5、10、20 μg/mL的rhEGF供試品，每個濃度供試品在不同日期測定3次，每個稀釋度的供試品和標準品都做2個重復。結果顯示，50%、100%、200%濃度水平的供試品回收率均在100%±15%范圍以內，平均回收率在100%±6%以內（表2），符合《生物制品質量控制分析方法驗證技術審評一般原則》的要求，表明該方法的準確性良好。

2.5 重復性

取含量為10 μg/mL的10個標準品溶液進行測定，每個標準品溶液做2個重復，結果顯示均符合《生物制品質量控制分析方法驗證技術審評一般原則》中的要求（表3）。

2.6 耐用性

時間的影響考察：根據試劑盒說明書操作，向96孔板中加入待測樣品后室溫孵育2 h，加入酶標二抗后再次室溫孵育2 h，加入底物顯色液后室溫孵育20 min。考慮到因加樣量導致每孔的孵育時間差異，以及孵育溫度差異是否會影響到該方法的檢測結果，因此設計本實驗。

孵育時間的影響：在加入樣品及酶標二抗時的孵育時間設為120 min上下浮動30 min，底物顯色時間為20 min上下浮動3 min，即試驗時間分別為：90→90→17 min；120→120→20 min；150→150→23 min。

孵育溫度的影響考察：置于22、25、28 ℃恒溫箱中反應。

結果顯示，在此檢測方法規定的孵育時間、顯色時間及溫度在一定范圍內浮動對檢測結果影響較小，回收率均符合《生物制品質量控制分析方法驗證技術審評一般原則》的要求（表4、5），結果相對穩定，表明該檢測方法可靠，耐用性良好。

2.7 rhEGF滴眼液樣品檢測

采用該方法分別檢測3批濃度為10 μg/mL的rhEGF滴眼液中rhEGF的含量，結果顯示測定的含量在標示值的85%～115%（表6），表明該方法能夠準確測定樣品中rhEGF含量。

3 討論

本研究建立的測定方法可在6～8 h內完成測定，達到快速準確檢測的目的。經專屬性、準確度、精密度、線性、耐用性的驗證，rhEGF含量的測定方法均符合《生物制品質量控制分析方法驗證技術審評一般原則》的要求。經驗證，本研究建立的方法適合rhEGF含量測定，并為類似生長因子類制品的含量檢測方法提供了研究方向。

采用ELISA檢測藥品中rhEGF的含量的優勢在于檢測更快速，相比于細胞增殖法檢測時間縮短了6 d以上。細胞增殖法測定的結果范圍達到標示值的70%～200%，而本方法準確度達到85%～115%之內，本方法的準確度更高。采用ELISA的方法相對于3T3細胞增殖法，在快速檢測的效率，以及精準檢測的準確度上都具有明顯的優勢，其檢測受溫度及時間的干擾較小。在實驗中發現，當藥品中含有黏性物質如玻璃酸鈉、殼聚糖等成分時，可能干擾檢測結果的準確性，今后需要進一步優化，或可將藥品進行預處理后采用本方法進行更為準確的測定。

參考文獻

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[9] Human EGF Quantikine ELISA Kit[EB/OL]. [2023-03-07]. https：//www.rndsystems.com/cn/products/human-egfquantikine-elisa-kit_deg00#assay-procedure.