嵌合抗原受體T細胞治療在心肌纖維化中的研究進展

李好 鄭琦 楊琳 李雙秀 孫林

【摘要】嵌合抗原受體T（CAR-T）細胞治療是目前細胞免疫治療中最熱門的研究領域，在腫瘤治療中有著輝煌的成就。隨著研究的深入，CAR-T細胞治療在非腫瘤疾病中也有著重大的突破。CAR-T細胞作為過繼性T細胞的一種，結合了抗體的抗原結合特性和T細胞的效應功能，能靶向消除特定的細胞。對于尚無有效治療措施的心肌纖維化，CAR-T細胞治療可能是一個新的治療思路與方向。現就目前CAR-T細胞治療在心肌纖維化中的研究進展做一綜述。

【關鍵詞】嵌合抗原受體T細胞治療；細胞免疫治療；心肌纖維化

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2024.05.015

Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy in Myocardial Fibrosis

【Abstract】Chimeric antigen receptor T（CAR-T） cell therapy is currently the hottest research field in cellular immunotherapy，and has made brilliant achievements in tumor treatment.With the deepening of research，CAR-T cell therapy has also made a major breakthrough in non-tumor diseases.CAR-T cells，a type of adoptive T cell，combine the antigen-binding properties of antibodies with the effector function of T cells to target the elimination of specific cells.For myocardial fibrosis which there is no effective treatment，CAR-T cell therapy may be a new treatment idea and direction.This article reviews the current research progress of CAR-T cell therapy in myocardial fibrosis.

【Keywords】Chimeric antigen receptor T cell therapy;Cellular immunotherapy;Myocardial fibrosis

近年來，細胞治療作為一種安全有效的治療手段，在臨床治療中的作用越來越突出。細胞治療領域的范圍仍在不斷擴大，使用其他免疫細胞和基質細胞治療的新技術仍在研究中，而目前最火熱的細胞治療是嵌合抗原受體T（chimeric antigen receptor T，CAR-T）細胞治療。CAR-T細胞在腫瘤治療，尤其是血液腫瘤治療中療效顯著，成為發展最迅速的腫瘤免疫療法。自2017年美國食品藥品監督管理局批準Kymriah上市以來，截至2023年1月，共有7款CAR-T 細胞治療藥物獲得批準［1］。然而 CAR-T細胞治療遠不止于腫瘤治療，在心血管疾病中也有新的研究進展。

1 CAR-T細胞治療概述

嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）分子是一種采用抗體識別區替換T細胞受體（T cell receptor，TCR）胞外識別區的抗體-TCR嵌合分子，其不再依賴主要組織相容性復合體的限制性識別，并通過TCR-CD3復合體信號轉導通路發揮作用，產生強有力的T細胞活化效應。CAR-T細胞直接與靶細胞表面的特異性抗原相結合而被激活，CD3ζ鏈上的信號轉導結構域磷酸化后引發下游信號轉導，這個過程類似于TCR信號轉導［2］，激活的T細胞通過釋放穿孔素、顆粒酶B等直接殺傷靶細胞，同時還通過釋放細胞因子募集內源性免疫細胞殺傷靶細胞，從而達到治療目的。

CAR分子結構通常由胞外抗原結合域、鉸鏈區、跨膜區、T細胞激活結構域以及一個或多個胞內共刺激結構域組成。根據細胞內結構域可將CAR分子分為5代。第1代CAR分子由胞外抗原識別區即單鏈可變片段、融合跨膜區和TCR的CD3ζ鏈信號轉導結構組成，由于缺乏共刺激因子，第1代CAR-T細胞顯示出低增殖性，限制了其應用。第2代CAR分子添加了CD28或4-1BB等共刺激結構域，位于跨膜區和CD3信號轉導域之間［3］。美國食品藥品監督管理局批準上市的6款CAR-T產品均為第2代CAR-T細胞［4］。第3代CAR分子包含兩個共刺激分子，最常見的是同時添加了CD28和4-1BB兩個共刺激結構域，這一代CAR-T細胞增強了細胞內信號轉導，表現出更好的增殖能力、殺傷活性和持久性，但可能導致更嚴重的副作用和更快的T細胞耗竭［2］。在第2代CAR分子的基礎上添加共表達的細胞因子，比如白細胞介素（interleukin，IL）-2，這意味著第4代CAR-T細胞的誕生，這代CAR-T細胞的活化可促進所需細胞因子的產生和分泌，重塑免疫微環境，實現多功能治療［5］。第5代CAR-T細胞同樣基于第2代，添加了激活其他信號通路的共刺激結構域，比如插入了IL-2受體鏈，通過激活酪氨酸蛋白激酶-信號轉導子及轉錄激活因子途徑促進細胞因子的信號傳遞［6］。此外，還有許多新策略應用于CAR-T細胞治療，例如雙靶CAR-T細胞［7］、CAR-T細胞聯合免疫調節劑［8］及可循環CAR［9］等，這些新型的策略為CAR-T細胞治療提供了新思路。

CAR-T技術的發展歷程已有30余年，已在血液腫瘤治療中取得了輝煌成績。在實體瘤治療中也有研究［10］證明CAR-T細胞治療的有效性及安全性。而在非腫瘤適應證中（如感染性疾病［11］、自身免疫性疾病［12］、移植排斥［13］和衰老［14］等），CAR-T細胞治療也展開了初步的探討研究。

2 CAR-T細胞治療心肌纖維化

有數據［15］顯示，心血管疾病是中國居民的首位死因。而心肌纖維化是多種心血管疾病（如心肌梗死、高血壓、心肌炎和主動脈狹窄等）發展至一定階段的共同病理改變，能導致諸多不良后果［16］，也是引起終末期心力衰竭的關鍵因素。抑制心肌纖維化可改善心血管疾病患者的預后，但目前針對心肌纖維化的臨床干預和治療十分有限［17］。

心肌纖維化是缺血、缺氧、炎癥等損傷性因素造成的心臟細胞外基質（extracellular matrix，ECM）過量沉積為特征的一種病理過程［18］。成纖維細胞活化為肌成纖維細胞是心肌纖維化的中心事件，肌成纖維細胞產生和沉積ECM蛋白，為受損的心臟提供局部機械支持［19］，但 ECM的過度積聚也使心臟失去正常功能。由于肌成纖維細胞在心肌纖維化中的核心作用，許多研究將抑制肌成纖維細胞的功能作為心肌纖維化的治療方向［20-21］。

CAR-T細胞是一種特異T細胞，其靶向性、殺傷活性和持久性均優于機體自然產生的T細胞，利用CAR-T細胞特異性地消除肌成纖維細胞有望成為一種治療心肌纖維化的新方法。為研究CAR-T細胞在體內是否可靶向肌成纖維細胞，2019年美國賓夕法尼亞大學的 Aghajanian等［22］構建了心臟成纖維細胞上表達人工抗原卵清蛋白（ovalbumin，OVA）的小鼠，并使用靶向OVA肽的CAR-T細胞治療心肌纖維化的OVA小鼠，發現治療組小鼠的心肌纖維化顯著減少。該研究表明CAR-T細胞可靶向肌成纖維細胞，可能是一種治療心肌纖維化的有效方法，但還需進一步探索CAR-T細胞治療心肌纖維化的最佳靶標。

鑒于成纖維細胞活化蛋白（fibroblast activation protein，FAP）的表達是腫瘤相關成纖維細胞的重要特征，FAP靶向的CAR-T細胞已被改造用于治療各種實體瘤，如間皮瘤、肺癌和胰腺癌［23］，且具有一定的療效，說明FAP可作為一個CAR-T細胞識別的有效靶點。Aghajanian等［22］通過RNA序列數據庫，分析心臟病患者左心室組織樣本的基因表達數據，發現FAP在衰竭的肥厚型心肌病和擴張型心肌病樣本中的表達顯著上調。且發生纖維化的心臟中肌成纖維細胞高表達FAP，因此可設計一種靶向FAP的CAR-T細胞特異性消除肌成纖維細胞，延緩心肌纖維化的進程。Aghajanian等［22］通過逆轉錄病毒在體外將小鼠脾臟分離的T淋巴細胞改造為FAP CAR-T細胞后，轉移到心肌纖維化小鼠體內，發現在轉移治療組中小鼠心肌纖維化顯著減少，心臟功能得到改善，且無明顯的毒副作用。在此基礎上，2022年美國賓夕法尼亞大學的Rurik等［24］通過脂質納米顆粒（lipid nanoparticle，LNP）技術實現體內改造T淋巴細胞，LNP經血液循環可定向至T淋巴細胞表面并被胞吞至細胞內，LNP包裹的CAR-mRNAs在胞質中逃逸、翻譯及表達，最終在小鼠體內產生功能化的FAP CAR-T細胞。不同于慢病毒遞送CAR基因，LNP遞送的CAR-mRNAs未整合到T淋巴細胞基因組中，而是在胞質中翻譯產生CAR分子并表達至T淋巴細胞表面。這些CAR分子在T細胞分裂過程中自然缺失，在改善心肌纖維化的同時也規避了過度抑制纖維化的問題。基于以上研究，無論是在體外產生FAP CAR-T細胞再轉移至小鼠體內，還是直接在小鼠體內產生FAP CAR-T細胞都能有效抑制心肌纖維化，改善心臟功能，但這種CAR-T細胞治療心肌纖維化的方法仍處于試驗階段，未來需更多的研究證實其有效性和安全性。此外，CAR-T細胞治療是否能用于治療其他心血管疾病（如心肌病、心律失常及動脈粥樣硬化等）也需進一步的分析與探索。

3 CAR-T細胞治療心肌纖維化面臨的挑戰及對策

3.1 影響CAR-T細胞治療有效性的相關因素

CAR分子的結構對T淋巴細胞的增殖能力及作用時間至關重要。而CAR-T細胞在體內的增殖能力及作用時間是影響其治療效果的重要因素。目前具有CD28或4-1BB共刺激結構域的第2代CAR-T細胞是最常用的CAR分子結構。CD28共刺激分子會誘導出一種生命周期短但細胞殺傷活性較高且分泌大量IL-2等細胞因子的T細胞類型。對應的，設計有4-1BB共刺激分子的CAR-T細胞，雖然其細胞因子分泌水平較低，但其在體內的擴增和持續性更強。目前在有關CAR-T細胞治療心肌纖維化的研究中，所使用的均是CD28共刺激分子［22，24］，4-1BB二代CAR-T細胞靶向消除肌成纖維細胞的效能如何尚未可知。

CAR-T細胞耗竭影響其治療的有效性。當CAR-T細胞耗竭時將失去效應功能和自我更新能力，影響治療效果。在感染性疾病和腫瘤環境中存在許多促進耗竭的因素，如炎癥、調節性T細胞所衍生的細胞因子、代謝壓力和持續性抗原刺激等，調控這些因素可緩解耗竭，提升CAR-T細胞的療效［25］。然而在CAR-T細胞治療心肌纖維化方面暫無T細胞耗竭的相關研究，受損和發生纖維化的心臟中存在的促耗竭因素以及調控措施需進一步探索研究。不同靶點的CAR-T細胞作用時間有所差異，這與其生長半衰期的長短有重要關系。在一項使用FAP CAR-T細胞抗小鼠多種皮下移植瘤的研究中發現，FAP CAR-T細胞的生長半衰期很短［26］，治療心肌纖維化時二次注射FAP CAR-T細胞可延長其作用時間，治療第8周時仍可有效抑制纖維化［22］。因此，對于半衰期較短的CAR-T細胞可通過重復治療的手段達到持久治療的目的。

抗原逃逸及產生抗性將嚴重降低CAR-T細胞的治療效果。在CAR-T細胞治療中，腫瘤細胞上的靶抗原可能發生丟失，CAR-T細胞將無法有效識別和清除腫瘤細胞，稱為抗原逃逸。也有一些腫瘤細胞通過降低抗原密度、抗原編碼基因突變、譜系轉換［27］等逃避CAR-T細胞的攻擊，進而影響療效，使腫瘤患者不能獲得長期緩解。針對這些導致CAR-T細胞治療產生抗性的問題，發現新的靶抗原十分重要。有研究［28］表明，不同亞群的成纖維細胞可能以細胞特異性的方式對不同的損傷模型作出反應。例如，在心肌梗死等缺血性損傷中，心外膜來源的成纖維細胞可能在驅動左心室前壁區域性嚴重纖維化中發揮重要作用。而壓力超負荷后容易發生嚴重纖維化的區域，心內膜來源的成纖維細胞比心外膜來源的成纖維細胞增殖更明顯。成纖維細胞的遺傳清除可明顯減少其增殖，減輕心肌纖維化的嚴重程度，并減緩心臟功能下降的進程。因此，尋找不同亞群成纖維細胞表面的特異性表達抗原，設計更具特異性的CAR分子，可實現針對不同病因下心肌纖維化的CAR-T細胞治療，增強其治療的有效性。

3.2 CAR-T細胞治療的安全性

細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS）是CAR-T細胞治療時最常見的不良反應，是由于淋巴細胞活化導致的大量細胞因子（如IL-6、γ干擾素等）釋放而引起的全身炎癥反應，可導致血管擴張性休克、毛細血管滲漏等，進而導致器官受損，最終危及生命［29］。臨床上常用托珠單抗，阻斷IL-6受體及其相關信號轉導，從而緩解CRS。而CAR分子的結構與CRS的發生有重要的聯系，如CD28共刺激結構域較4-1BB更易引發CRS，設計細胞因子釋放較低的CAR分子，將是解決CRS最有潛力的方法。在CAR分子中引入IL-6短發夾RNA序列，可產生IL-6敲低的CAR-T細胞，從而減少了IL-6的釋放和CRS的發生，且不影響其治療效果［30］。在CAR-T細胞治療心肌纖維化的臨床前研究中，尚無對CAR分子的特殊設計，且在治療中并無CRS產生［22］，這奠定了CAR-T細胞治療心肌纖維化的安全基礎，但設計安全性更高的CAR分子對其向臨床研究及應用轉換十分重要。

脫靶效應是指CAR-T細胞在攻擊靶細胞時，誤傷了同樣表達靶抗原的正常組織細胞，從而引起正常組織損傷，是CAR-T細胞治療最主要的副作用來源之一。肌成纖維細胞表面的FAP已被作為CAR-T細胞治療心肌纖維化的靶點，但FAP在骨髓基質細胞和成骨細胞中同樣高表達，因此，通過CAR-T細胞系統性清除FAP表達陽性的細胞可能會導致嚴重的貧血、骨量減少及惡病質狀態［31］。基于此，尋找更有效、更安全的靶點是CAR-T細胞治療心肌纖維化實現臨床轉換的重要前提。

雖然通過CAR-T細胞可消除肌成纖維細胞，減輕心肌纖維化，但肌成纖維細胞產生的ECM對損傷部位的修復十分重要，纖維化不足會導致受損部位失去正常的機械支撐，在心臟中可能會發生心室擴張，甚至破裂的情況，在皮膚等其他器官中可能會導致愈合不良。因此在達到療效的同時也要避免過度地消除肌成纖維細胞。具有可控性的CAR-T治療策略是一個值得研究和發展的方向。通過在CAR分子中加入一個“開關”，可精確地調控治療的部位、持續的時間和強度［32］。其中，基于小分子的“開關”已成功應用于多項CAR分子設計［33］。基于異硫氰酸熒光素/葉酸的“開關”，可通過時空和劑量依賴性的方式充當CAR-T細胞和靶細胞之間的擬免疫突觸，將CAR-T細胞轉變為“開啟”狀態。利用雷帕霉素誘導FKBP12和FRB結合域的組裝可控制CAR-T細胞的激活。rimiducid可誘導胱天蛋白酶-9二聚化并促進過度活化的CAR-T細胞凋亡。因此，小分子有望通過人為地在“開”和“關”狀態之間切換，賦予CAR-T細胞功能靈活性。其次，使用非病毒技術可實現T細胞中CAR的瞬時表達，確保了CAR-T細胞治療的有限持久性。目前較為常見的非病毒技術包括轉座子和mRNA載體技術等［34］。2022年，賓夕法尼亞大學團隊利用LNP作為FAP CAR-mRNAs的載體在小鼠體內產生了瞬時表達CAR分子的T細胞，避免了過度抑制纖維化的問題［24］。

4 總結與展望

CAR-T細胞治療作為現階段最值得研究和發展的細胞免疫療法已在血液腫瘤的治療中發揮出了顯著的療效，并且在治療實體瘤及非腫瘤疾病中也有重大突破，而CAR-T細胞在心肌纖維化的治療中也有著巨大的潛力。雖然目前多數CAR-T細胞治療尚處于實驗室研究或臨床前試驗階段，而且在心肌纖維化中的研究尚少，但隨著mRNA載體、電穿孔、基因編輯和細胞制造等技術的不斷進步與完善，有望設計出兼顧高效性和安全性、更適用于心肌纖維化治療及能更加精準調控的CAR-T細胞，為治療心肌纖維化提供新的研究思路和方向。

參考文獻

［1］Saez-Ibanez AR，Upadhaya S，Partridge T，et al.Landscape of cancer cell therapies：trends and real-world data［J］.Nat Rev Drug Discov，2022，21（9）：631-632.

［2］Huang R，Li X，He Y，et al.Recent advances in CAR-T cell engineering［J］.J Hematol Oncol，2020，13（1）：86.

［3］Locke FL，Ghobadi A，Jacobson CA，et al.Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma （ZUMA-1）：a single-arm，multicentre，phase 1-2 trial［J］.Lancet Oncol，2019，20（1）：31-42.

［4］韋楠，陳天平，劉洪軍.嵌合抗原受體T細胞在兒童復發難治性急性淋巴細胞白血病中的研究進展［J］.中國當代兒科雜志，2023，25（2）：210-216.

［5］Chmielewski M，Abken H.TRUCKS，the fourth-generation CAR T cells：current developments and clinical translation［J］.Adv Cell Gene Ther，2020，3（3）：e84.

［6］Ragoonanan D，Sheikh IN，Gupta S，et al.The evolution of chimeric antigen receptor T-cell therapy in children，adolescents and young adults with acute lymphoblastic leukemia［J］.Biomedicines，2022，10（9）：2286.

［7］Xie B，Li Z，Zhou J，et al.Current status and perspectives of dual-targeting chimeric antigen receptor T-cell therapy for the treatment of hematological malignancies［J］.Cancers（Basel），2022，14（13）：3230.

［8］董佳藝，陳斯澤，邵麗娟，等.嵌合抗原受體T細胞療法聯合免疫調節劑治療實體瘤研究進展［J］.實用醫學雜志，2022，38（21）：2643-2648.

［9］Li W，Qiu S，Chen J，et al.Chimeric antigen receptor designed to prevent ubiquitination and downregulation showed durable antitumor efficacy［J］.Immunity，2020，53（2）：456-470.e6.

［10］Daei Sorkhabi A，Mohamed Khosroshahi L，Sarkesh A，et al.The current landscape of CAR T-cell therapy for solid tumors：mechanisms，research progress，challenges，and counterstrategies［J］.Front Immunol，2023，14：1113882.

［11］Maldini CR，Claiborne DT，Okawa K，et al.Dual CD4-based CAR T cells with distinct costimulatory domains mitigate HIV pathogenesis in vivo［J］.Nat Med，2020，26（11）：1776-1787.

［12］Zhang B，Wang Y，Yuan Y，et al.In vitro elimination of autoreactive B cells from rheumatoid arthritis patients by universal chimeric antigen receptor T cells［J］.Ann Rheum Dis，2021，80（2）：176-184.

［13］Sicard A，Lamarche C，Speck M，et al.Donor-specific chimeric antigen receptor Tregs limit rejection in naive but not sensitized allograft recipients［J］.Am J Transplant，2020，20（6）：1562-1573.

［14］Amor C，Feucht J，Leibold J，et al.Senolytic CAR T cells reverse senescence-associated pathologies［J］.Nature，2020，583（7814）：127-132.

［15］中國心血管健康與疾病報告編寫組，胡盛壽.中國心血管健康與疾病報告2021概要［J］.中國循環雜志，2022，37（6）：553-578.

［16］Lopez B，Ravassa S，Moreno MU，et al.Diffuse myocardial fibrosis：mechanisms，diagnosis and therapeutic approaches［J］.Nat Rev Cardiol，2021，18（7）：479-498.

［17］Webber M，Jackson SP，Moon JC，et al.Myocardial fibrosis in heart failure：anti-fibrotic therapies and the role of cardiovascular magnetic resonance in drug trials［J］.Cardiol Ther，2020，9（2）：363-376.

［18］Wang Y，Wang M，Samuel CS，et al.Preclinical rodent models of cardiac fibrosis［J］.Br J Pharmacol，2022，179（5）：882-899.

［19］de Boer RA，de Keulenaer G，Bauersachs J，et al.Towards better definition，quantification and treatment of fibrosis in heart failure.A scientific roadmap by the Committee of Translational Research of the Heart Failure Association （HFA） of the European Society of Cardiology［J］.Eur J Heart Fail，2019，21（3）：272-285.

［20］Liu M，López de Juan Abad B，Cheng K.Cardiac fibrosis：myofibroblast-mediated pathological regulation and drug delivery strategies［J］.Adv Drug Deliv Rev，2021，173：504-519.

［21］Bugg D，Bailey LRJ，Bretherton RC，et al.MBNL1 drives dynamic transitions between fibroblasts and myofibroblasts in cardiac wound healing［J］.Cell Stem Cell，2022，29（3）：419-433.e10.

［22］Aghajanian H，Kimura T，Rurik JG，et al.Targeting cardiac fibrosis with engineered T cells［J］.Nature，2019，573（7774）：430-433.

［23］Rodriguez Garcia A，Palazon A，Noguera-Ortega E，et al.CAR-T cells hit the tumor microenvironment：strategies to overcome tumor escape［J］.Front Immunol，2020，11：1109.

［24］Rurik JG，Tombacz I，Yadegari A，et al.CAR T cells produced in vivo to treat cardiac injury［J］.Science，2022，375（6576）：91-96.

［25］Franco F，Jaccard A，Romero P，et al.Metabolic and epigenetic regulation of T-cell exhaustion［J］.Nat Metab，2020，2（10）：1001-1012.

［26］Wang LC，Lo A，Scholler J，et al.Targeting fibroblast activation protein in tumor stroma with chimeric antigen receptor T cells can inhibit tumor growth and augment host immunity without severe toxicity［J］.Cancer Immunol Res，2014，2（2）：154-166.

［27］楊迪雅，孔祥輝，周秀梅.嵌合抗原受體療法在腫瘤免疫治療中的研究進展［J］.中國細胞生物學學報，2023，45（3）：557-568.

［28］Han MY，Liu ZX，Liu L，et al.Dual genetic tracing reveals a unique fibroblast subpopulation modulating cardiac fibrosis［J］.Nat Genet，2023，55（4）：665-678.

［29］Wang Z，Han W.Biomarkers of cytokine release syndrome and neurotoxicity related to CAR-T cell therapy［J］.Biomark Res，2018，6：4.

［30］Zhou JE，Sun L，Jia Y，et al.Lipid nanoparticles produce chimeric antigen receptor T cells with interleukin-6 knockdown in vivo［J］.J Control Release，2022，350：298-307.

［31］Sun Y，Ma M，Cao D，et al.Inhibition of fap promotes cardiac repair by stabilizing BNP［J］.Circ Res，2023，132（5）：586-600.

［32］Sun S，Hao H，Yang G，et al.Immunotherapy with CAR-modified T cells：toxicities and overcoming strategies［J］.J Immunol Res，2018，2018：2386187.

［33］Zheng Y，Nandakumar KS，Cheng KS.Optimization of CAR-T cell-based therapies using small-molecule-based safety switches［J］.J Med Chem，2021，64（14）：9577-9591.

［34］Moretti A，Ponzo M，Nicolette CA，et al.The past，present，and future of non-viral CAR T cells［J］.Front Immunol，2022，13：867013.