非洲豬瘟病毒O174L 蛋白的真核表達載體構建及分子特征分析

沙嘎那日·吉日木圖　林曉　沈兆基　郭肖蓉　李奎　賈紅　周榮

摘要：為分析非洲豬瘟病毒O174L 基因，通過同源重組方式將O174L 基因連接至pRK5M-C-2×Strep載體，構建重組質粒，經PCR擴增和測序鑒定正確后，將重組質粒轉染至豬小腸上皮細胞系（porcine intestinal columnarepithelial cells，IPEC-J2）中，通過免疫熒光和Western blot檢測O174L蛋白的表達情況。PCR及測序結果顯示，pRK5M-C-2×Strep-O174L 重組質粒構建成功。免疫熒光和Western blot檢測結果顯示，O174L蛋白能夠在IPEC-J2細胞中穩定表達。生物信息學分析結果顯示，基于O174L 基因和B646L（p72）基因序列構建各分離毒株的2個系統發育樹間排列高度相似。來自中國的16株分離株中，O174L 基因序列的相似性高達96.76%～100.00%。其中，與中國爆發的其他Ⅱ型分離株相比，China/2018/AnhuiXCGQ在O174L蛋白的第67、75及110位氨基酸存在差異，GZ201801在第110位氨基酸存在差異。Ⅰ型分離株 SD/DY-I/2021和 HeN/ZZ-P1/2021的O174L蛋白的氨基酸序列分別在第13、73、93、95、113和114位上與其他中國Ⅱ型分離株存在差異。O174L蛋白為穩定的親水蛋白，沒有信號肽和跨膜區；其二級結構由α螺旋、β折疊和無規則卷曲組成，三級結構預測結果與二級結構預測相符。以上結果為深入研究ASFV O174L蛋白與宿主間的相互作用和遺傳進化提供了基礎。

關鍵詞：非洲豬瘟病毒；O174L 基因；真核表達；分子特征

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0162

中圖分類號：S858.28；Q78 文獻標志碼：A 文章編號：10080864（2024）04011414

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種烈性、高度接觸性傳染病，可感染家豬、野豬，其天然宿主為軟蜱（Ornithodoros moubata）。ASFV通過空氣、食物、環境和蟲媒等多個途徑傳播。其強毒力株對生豬致病率高，致死率可高達100%，臨床表現主要為發熱、皮膚發紺及淋巴結、腎、胃腸粘膜明顯出血等[1]。ASF在全球的爆發和流行對養豬產業和食品安全產生了巨大威脅。自2018年傳入我國后，給我國養豬業造成了毀滅性打擊[1]。

ASFV 是非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，為一種大型的線性雙鏈DNA 病毒[2]。基因組大小約170～190 kb，編碼150多種蛋白質，參與ASFV 生命周期的不同階段，包括進入宿主細胞、抑制宿主免疫反應、病毒復制及病毒自身DNA 損傷修復等[3]。ASFV感染的主要靶細胞類型是單核-吞噬系統的細胞，包括特定組織巨噬細胞（macrophages，Mφ）和網狀細胞的特定譜系[4]。其中，巨噬細胞作為重要的固有免疫細胞之一，是機體抵御病原微生物入侵的第一道防線[5]。巨噬細胞的主要特點是能夠產生活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）和提高一氧化氮合成酶（nitric oxidesynthetase，iNOS）活性，使其清除胞內感染的能力增強[6-9]。

ASFV基因組DNA是ROS攻擊的重要靶分子之一。DNA受ROS氧化損傷的方式主要有2種：一種是DNA雙鏈中的堿基直接被氧化，如鏈斷裂和自發脫嘌呤/脫嘧啶；另一種是脫氧核苷三磷酸（dNTPs）池中的游離堿基被氧化。然而，包括病毒在內的所有生物體基本都無法避免來自外界和生物體自身內部的DNA損傷，若不及時修復這些損傷，將會對生物體產生災難性的后果，比如DNA復制和轉錄過程將不能正常進行，嚴重影響基因組的完整性和穩定性，進而引起病毒自身復制和組裝停止、突變以及死亡等一系列危害[10]。為了有效克服這些DNA損傷，ASFV 進化出了自己的修復系統。ASFV 修復系統包括由自身編碼的Ⅱ類AP內切酶（E269R）、修復性DNA 聚合酶（O174L）、DNA連接酶（NP419 L）3個修復酶參與的堿基切除修復通路[1112]。O174L 蛋白是一種類似細胞DNA聚合酶β（DNA polymerase beta，Pol β）的修復性DNA 聚合酶，能夠有效修復單核苷酸缺口DNA[1314]。O174L 蛋白的三維結構表明，與其他DNA聚合酶不同，O174L僅由1個具有催化位點的手掌結構域和參與脫氧核苷三磷酸（dNTP）選擇的C末端結構域組成，缺乏Pol β具有的帶有dRP裂解酶活性位點的N末端8-kD結構域[1516]。然而關于O174L 的保真度卻存在爭議，研究報道，O174L 錯誤插入核苷酸的頻率為10-4～10-5，與Pol β的值相當[1718]。相比之下，O174L在其他研究中的保真度值低40～700倍[19]。盡管對O174L蛋白有了一定的了解，但是ASFV整個DNA修復系統以及O174L蛋白在病毒自身DNA損傷修復中的作用機制仍未知。因此，本研究通過真核系統表達ASFV的DNA聚合酶O174L，進一步利用生物信息學方法分析O174L蛋白的分子特征，以期對該基因及其蛋白的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

pRK5M-C-2×Strep 載體、DH5α 感受態和IPEC-J2細胞由本實驗室保存。

1.2 試劑

高保真DNA聚合酶 2×Phanta Max Master Mix（P515）、快速克隆試劑盒 Clon Express Ⅱ OneStepCloning Kit（C112）、DNA 聚合酶2×Rapid TaqMaster Mix（P222）、小量提取質粒試劑盒 FastPure Plasmid Mini Kit（DC201）購自諾唯贊生物科技股份（南京）有限公司。限制性內切酶NotⅠ（R0189V）和BamHⅠ（R0136V）購自New EnglandBiolabs 公司（ 美國）。DNA 回收試劑盒（DR010250）購自浙江易思得生物科技有限公司（杭州）。聚乙烯亞胺（polyethylenimine， PEI）轉染試劑（23966）購自Polyscience 公司（美國）。抗Streptavidin標簽單克隆抗體（BE2076-100）購自柏奧易杰（北京）科技有限公司。辣根過氧化物酶標記羊抗兔&鼠IgG（M210035）購自艾比瑪特醫藥科技（上海）有限公司。蛋白顯色液ImmobilonWestern HRP（WBKLS0100）購自 Merck 公司（美國）。BCA蛋白質檢測試劑盒PierceTM BCA ProteinAssay Ki（t WL338065）購自Thermo公司（美國）。

1.3 試驗方法

1.3.1 生物信息學分析

查詢GeneBank數據庫中已有注釋的ASFV基因組數據，下載 O174L 基因序列以及相應分離株的B646L（p72）基因序列，利用 DNAstar7.1和DNAMAN7等分析軟件對其進行多序列比對。使用CLUSTALW程序進行核苷酸序列的多重比對。使用MEGAX 軟件采用鄰接（neighbor-joining，NJ）法基于O174L 和B646L 基因序列構建系統發育樹，通過1 000 個自展值（Bootstraps）確定統計學顯著性。從NCBI 下載ASFV分離株CADC_HN09中O174L蛋白的氨基酸序列，通過ExPASy在線分析蛋白質的理化性質，采用SignalP和TMHMM法分別預測蛋白質的信號肽和跨膜區，采用PSIPRED法在線分析蛋白質的二級結構，通過同源建模SWISS-MODEL法在線預測蛋白質的三級結構。

1.3.2 引物設計及合成

根據NCBI GenBank 中ASFV CADC_HN09 基因組（GenBank ID：MZ614662.1）的核苷酸序列合成O174L 基因，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。并設計含有載體和O174L 基因同源序列的特異性引物O174L-F（5-TGAATTAAGCTTGGTGGATCCATGTTAACGCTTATTCAAGGAAAA-3，下劃線部分為Not Ⅰ酶切位點）和 O174L-R（ 5-TGCGGGTGGCTCCATGCGGCCGCTTATAAACGTTTCTTAGGTATGCG-3，下劃線部分為BamH Ⅰ酶切位點），并加入保護性堿基，擴增片段大小為525 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.3 O174L 基因的擴增

以合成的O174L 基因為模板進行PCR 擴增目的基因。PCR 體系：2×Phanta Max Master Mix 10 μL，ddH2O 5 μL，上、下游引物各1 μL，模板3 μL，共20 μL。PCR程序：95 ℃3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，35個循環；72 ℃ 7 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用DNA回收試劑盒純化PCR產物。

1.3.4 重組質粒的構建

用限制性內切酶Not Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切pRK5M-C-2×Strep 載體，用快速克隆試劑盒將純化回收的O174L 基因PCR產物及雙酶切載體pRK5M-C-2×Strep 進行連接，連接產物轉化至DH5α感受態細胞內。挑取單菌落置于LB液體培養基中，在37 ℃恒溫搖床內振蕩培養12 h，再進行菌液PCR鑒定及質粒小量提取，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序鑒定。

1.3.5 細胞培養及轉染

用含有10% 的胎牛血和1%的青霉素、鏈霉素雙抗的DMEM培養基培養IPEC-J2 細胞，待細胞長至約80%密度時使用PEI轉染試劑將重組質粒轉染至IPEC-J2細胞中，加入無血清、無抗性DMEM培養基培養4～6 h后，更換新的完全培養基繼續培養24 h。

1.3.6 免疫熒光試驗

使用12 孔細胞培養板接種細胞，轉染重組質粒并培養24 h后收取細胞。采用4% 多聚甲醛室溫固定細胞20 min，加入0.5% Triton X-100對細胞通透15 min，隨后使用3% BSA室溫封閉1 h。4 ℃條件下加入Strep標簽抗體（1∶8 000）孵育過夜，隨后加入熒光二抗，室溫避光孵育1 h，最后加入4，6-二脒基-2-苯基吲哚[2-（4-amidinophenyl）-6-indole‐carbamidine dihydrochloride，DAPI]進行避光染色，在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.7 Western blot 檢測

用添加蛋白酶抑制劑的RIPA（radio immunoprecipitation assay）裂解緩沖液提取細胞蛋白，并使用BCA蛋白質檢測試劑盒測定蛋白質含量。將蛋白質樣品與1×SDSloading buffer 混合并煮沸10 min。取上清進行SDS-PAGE 凝膠電泳，然后轉印至PVDF 膜（Merck，美國）。將膜在室溫下用5%脫脂牛奶溶液封閉2 h，加入一抗（1∶10 000）4 ℃孵育過夜；隨后加入二抗（1∶5 000）室溫孵育45 min；最后通過化學發光試劑和成像系統檢測目的蛋白信號。使用Image J（v.1.53k）對結果進行灰度值分析。

1.4 數據分析

采用GraphPad Prism 處理數據并作圖，采用獨立樣本t 檢驗進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 O174L 系統發育分析

在GeneBank 數據庫檢索ASFV 分離株基因組，共獲得92 個不同分離株的O174L 基因序列和相應分離株的B646L（p72）基因序列，包括完整的分離時間、地點、宿主和p72 基因型等相關信息，如表1所示。參考NCBI，獲得的分離株有7 個不同的p72 基因型，分別是Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅷ、Ⅸ、ⅩⅩ和ⅩⅫ型。

系統發育樹結果（圖1）顯示，基于O174L 和B646L 基因序列的2 個系統發育樹中各分離株的排列和基因型分型高度吻合。基因型Ⅰ（除LIV_5_40外）、Ⅱ和Ⅸ的ASFV分離株在2個系統發育樹中相同的基因型均聚類在同一個進化枝上。基因型為Ⅳ、Ⅷ、XX和XXII 的分離株聚類在同一個大進化枝上，說明這幾個基因型分離株相互之間的遺傳關系與Ⅰ、Ⅱ和Ⅸ型更近。贊比亞分離株（LIV_5_40，MN318203）雖然是Ⅰ型，但基于O174L 和B646L 基因序列的2個系統發育樹中均與其他Ⅰ 型分離株的距離較遠。

基于O174L 基因和B646L（p72）基因的2個系統發育樹存在2個細微差異。首先是基于O174L基因的系統發育樹中（圖1A），相同的基因型大進化枝下面出現了子進化枝，其中子進化支上的Ⅰ型分離株為Liv13/33 （OmLF2）（MN913970）、K49（MZ202520）、NHV（KM262845）、OURT 88/3（AM712240）、Arm/07/CBM/c4（LR881473）、Pig/HeN/ZZ-P1/2021（MZ945536）和Pig/SD/DY-I/2021（MZ945537）；Ⅱ 型分離株為ASFV/Ulyanovsk 19/WB-5699（MW306192）、GZ201801（MT496893） 和China/2018/AnhuiXCGQ（MK128995）。雖然基于O174L 基因序列的系統發育樹Ⅰ型和Ⅱ型分支也出現了子進化枝，但這些子進化枝上的分離株O174L 基因序列與其他大進化枝上的分離株O174L 基因序列相比有著99%以上的序列一致性，而基于B646L（p72）基因序列構建的系統發育樹上沒有出現類似的子進化枝（圖1B）。

由圖2可知，來自中國的16個ASFV分離株包括2個基因Ⅰ型和14個基因Ⅱ型，通過多序列比對，各分離株間的O174L 基因序列相似性高達96.76%～100.00%。在氨基酸序列比對中，與中國爆發的其他Ⅱ型分離株相比，China/2018/AnhuiXCGQ在O174L蛋白的第67、75以及110位氨基酸上存在差異，GZ201801在第110位氨基酸上存在差異；基因Ⅰ型分離株SD/DY-I/2021 和HeN/ZZ-P1/2021 的O174L蛋白氨基酸序列分別在第13、73、93、95、113和114位上與其他中國Ⅱ型分離株存在差異。

2.2 O174L蛋白質的理化性質、信號肽與跨膜區預測

ExPASy在線預測分析顯示，O174L 基因編碼蛋白長度為174 aa，理論分子量為20.33 kD，預估半衰期為30 h，不穩定指數為25.44，表明O174L蛋白為穩定蛋白。親水性平均值為-0.101，為親水蛋白。經SignalP 和TMHMM 法預測（圖3）顯示，O174L蛋白質不存在信號肽和跨膜區。

2.3 O174L 蛋白質二級和三級結構預測

分析蛋白的二級結構（圖4）顯示，O174L蛋白由8 個α 螺旋（α helix）、7 個β 折疊（β strand）和16 個無規則卷曲（random coil）組成（圖4A）。蛋白三級結構預測（圖4B）顯示，依然是α螺旋、β折疊和無規則卷曲為該蛋白質的主要組成結構，與二級結構預測相符。

2.4 O174L 基因擴增產物的鑒定

以合成的O174L 基因為模板，通過PCR擴增目的基因，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在525 bp處有明亮的特異性條帶，條帶大小與預期一致（圖5A）。

2.5 重組表達質粒的鑒定

將O174L 基因連接至線性化載體pRK5M-C2×Strep 中（圖5B）。重組表達質粒pRK5M-C-2×Strep-O174L 經菌液PCR鑒定，可見525 bp的目的基因片段（圖5C），測序結果正確，表明重組質粒構建成功。

2.6 O174L 蛋白在IPEC-2 細胞中的表達

用PEI轉染試劑將重組表達質粒pRK5M-C-2×Strep-O174L 轉染至IPEC-J2 細胞。通過免疫熒光和Western blot 檢測O174L 蛋白的表達，結果顯示，轉染試驗組在熒光顯微鏡下顯示大量綠色熒光，而未轉染重組質粒的對照組細胞未見綠色熒光（圖6A）。Western blot 分析IPEC-J2細胞出現大小為20.33 kD的特異性條帶，與重組蛋白O174L 的預期大小相符。灰度值結果顯示，對照組無特異性條帶（圖6B和C），進一步證明目的蛋白O174L 能在IPEC-J2 細胞系中穩定表達。

3 討論

1921年肯尼亞首次報道ASF疫情，隨后蔓延到歐洲，又傳播到南美洲和加勒比地區[20]；2007年，進入格魯吉亞，逐步影響東歐等國家[21]；2018年，我國沈陽地區首次爆發[22]，并逐漸向其他國家蔓延，如巴布亞新幾內亞、印度[23]、德國[24]、多米尼加[25]和海地[26]。因ASFV基因組復雜、編碼蛋白較多，很多蛋白功能未知以及交叉保護免疫力差等因素嚴重阻礙了ASF疫苗的研發，到目前為止，還沒有有效的治療措施。

本研究根據ASFV 分離株CADC_HN09 基因組序列合成O174L基因，成功構建了O174L基因的真核表達載體，通過免疫熒光與Western blot驗證了O174L基因能夠在豬小腸上皮細胞（IPEC-J2）中穩定表達。O174L 是聚合酶PolX 家族成員[13]。PolX家族顯示出一種典型的聚合酶結構，因為它與人手相似，被稱為拇指、手掌和手指。枯草芽孢桿菌PolX（BsPolX）、嗜熱細菌PolX（TtPolX）、大鼠PolX（RatPolβ）和人類Polβ（HsPolβ）中8-kD結構域和拇指結構域在同源蛋白中高度保守，但O174L與這些同源蛋白的序列相似性非常低，約為30%，一致性更低，僅約10%[2728]，且O174L缺少8-kD結構域和拇指結構域，但多了1個專門與受損傷DNA堿基缺口位點下游5端寡核苷酸上的磷酸基團（5-P）結合的口袋結構域。當堿基缺口位點的下游具有5-P時，O174L的催化效率會比沒有5-P時高出約14倍，由此表明，與5-P結合的口袋結構域在O174L的DNA修復過程中發揮著重要作用[29]。但目前O174L 的DNA 修復機制還未知，因此研究O174L的DNA修復機制，對研制ASFV疫苗以及抗病育種具有很大的理論指導作用。

本研究對O174L 基因進行了生物信息學分析，發現基于O174L 基因序列構建的系統發育樹的分支和分離株的排列與基于B646L 基因序列構建的系統發育樹結果高度相似，來自中國的16株分離株中，各分離株間的O174L 基因序列相似性高達96.76%～100.00%。其中，與中國爆發的其他Ⅱ 型分離株相比，China/2018/AnhuiXCGQ 在O174L 的第67、75以及110位氨基酸上存在差異，GZ201801 在第110 位氨基酸上存在差異。Ⅰ型分離株SD/DY-I/2021和HeN/ZZ-P1/2021的O174L氨基酸序列分別在第13、73、93、95、113和114位上與其他中國Ⅱ型分離株存在差異。O174L蛋白為穩定的親水蛋白，無信號肽和跨膜區，其二級結構由α螺旋、β折疊和無規卷曲組成，三級結構預測結果與二級結構預測相符。對ASFV進行基因分型對于揭示病毒的起源和快速鑒定同源性毒株非常重要。隨著基因克隆、PCR和測序技術的迅速發展，ASFV 的基因組研究也得到了進一步的發展。1984年，含有98% ASFV基因組信息的文庫被成功建立[30]，之后，關于ASFV基因組文庫建設的文章數量逐漸增加。目前幾個特定的基因已被用來評估ASFV 基因型，包括B646L（p72）、E183L（p54）、CP204L（p30）、EP402（CD2v）、O174L、KP86R 等[31]。迄今為止，基于C-末端p72編碼基因（B646L）已經描述了24種基因型[32]，然而，公開可用的完整基因組序列僅代表基因型Ⅰ至Ⅴ、Ⅶ至Ⅹ和XX，絕大多數序列對應于基因型Ⅰ、Ⅱ和Ⅸ[33-37]，從而限制了對地理起源和爆發模式的理解。隨著對ASFV基因組和分型技術，特別是全基因組測序和交叉保護試驗數據的不斷深入研究，對進化和選擇過程將會有更好的理解，對不同DNA病毒和單獨病毒基因的分化時間和起源也會有更準確的估計[38]。

贊比亞分離株LIV_5_40在B646L（p72）基因型分類中雖然屬于Ⅰ型，但無論是在基于O174L和B646L 基因的系統發育樹中還是在ASFV全基因組發育樹中，與其他Ⅰ型分離株均不在同一個進化枝上，而是與Ⅲ和XXII 型聚在一起，且與Ⅳ和XX 型也較為接近[38]。通過DNAMAN7堿基序列比對，LIV_5_40分離株的O174L 和B646L 基因序列與本研究中的其他Ⅰ型分離株序列相比存在43～45 和102～109 個單核苷酸多態性（singlenucleotide polymorphisms，SNP）。這種數量較多的堿基突變可能是由于不同分離株間的基因重組。當不同亞種的毒株感染同一宿主，均需要利用宿主細胞的復制系統進行復制，不同毒株間雖然各有一些特殊基因片段，但很多基因片段非常相似，導致宿主細胞復制系統有時會將兩者弄混，在復制不同毒株的相同基因片段時，連帶把一種毒株的特殊基因片段重組到了另一種毒株上，形成“雜交”毒株。ASFV在贊比亞地區叢林中反復感染軟蜱、疣豬、叢林豬等多種宿主，因此其面臨的選擇壓力和環境壓力導致贊比亞地區的ASFV毒株易發生基因重組，因此猜測贊比亞ASF 流行病學中可能存在叢林作用[39]。

研究表明，ASFV 聚合酶Ⅹ基因的缺失導致豬巨噬細胞內ASFV的DNA損傷積累和突變頻率增加[40]，表明該基因對維持ASFV基因的穩定必不可少。然而，O174L 基因序列的突變和缺失對其蛋白功能的影響仍是未知。本研究構建O174L 在豬消化道細胞（IPEC-J2）內表達的重組質粒，為今后O174L蛋白與宿主細胞內蛋白質的相互作用研究提供了工具。

參考文獻

［1］ CHAPMAN D A G， TCHEREPANOV V， UPTON C， et al ..Comparison of the genome sequences of non-pathogenic andpathogenic African swine fever virus isolates [J]. J. Gen. Virol，2008， 89（Pt2）：397-408.

［2］ NDLOVU S， WILLIAMSON A L， HEATH L， et al .. Genomesequences of three African swine fever viruses of genotypes IV andXX from zaire and south africa， isolated from a domestic pig （susscrofa domesticus）， a warthog （phacochoerus africanus）， and aEuropean wild boar （sus scrofa） [J/OL]. Microbiol. Resour.Announc.， 2020， 932： e00341-20 [2023-02-15]. https：//doi. org/10.1128/MRA.00341-20.

［3］ P?REZ-N??EZ D， GARC?A-URDIALES E， MART?NEZ-BONETM， et al.. CD2v interacts with adaptor protein AP-1 during Africanswine fever infection [J/OL]. PLoS One， 2015， 104： e0123714[2023-02-15]. https：//doi.org/10.1371/journal.pone.0123714.

［4］ SáNCHEZ E G， PéREZ-N??EZ D， REVILLA Y. Mechanisms ofentry and endosomal pathway of African swine fever virus [J/OL].Vaccines （Basel）， 2017， 54：42 [2023-02-15]. https：//doi.org/10.3390/vaccines5040042.

［5］ MILLS C D. M1 and M2 macrophages： oracles of health anddisease [J]. Crit. Rev. Immunol.， 2012， 32（6）：463-488.

［6］ BILITY M T， CHENG L， ZHANG Z， et al.. Hepatitis B virusinfection and immunopathogenesis in a humanized mouse model：induction of human-specific liver fibrosis and M2-like macrophages[J/OL]. PLoS Pathog.， 2014， 103：e1004032 [2023-02-15]. https：//doi.org/10.1371/journal.ppat.1004032.

［7］ MARTINEZ F O， GORDON S. The M1 and M2 paradigm ofmacrophage activation： time for reassessment [J/OL]. F1000PrimeRep.， 2014， 6： 13 [2023-02-15]. https：//doi. org/10.12703/P6-13.eCollection 2014.

［8］ MARTINEZ F O， GORDON S， LOCATI M， et al.. Transcriptionalprofiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation andpolarization： new molecules and patterns of gene expression [J]. J.Immunol.， 2006， 177（10）：7303-7311.

［9］ VOGEL D Y， VEREYKEN E J， GLIM J E， et al .. Macrophagesin inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediateactivation status [J/OL]. J. Neuroinflamm.， 2013， 10：35 [2023-02-15]. https：//doi.org/10.1186/1742-2094-10-35.

［10］ FORMAN H J， TORRES M. Redox signaling in macrophages [J].Mol. Aspects Med.， 2001， 224（5）：189-216.

［11］ PEI D S， STRAUSS P R. Zebrafish as a model system to study DNAdamage and repair [J]. Mutatation Res.， 2013， 743-744：151-159.

［12］ PRZYBYLOWSKA K， KABZINSKI J， SYGUT A， et al .. Anassociation selected polymorphisms of XRCC1， OGG1 andMUTYH gene and the level of efficiency oxidative DNA damagerepair with a risk of colorectal cancer [J]. Mutatant Res.， 2013，745-746：6-15.

［13］ OLIVEROS M， Y??EZ R J， SALAS M L， et al .. Characterizationof an African swine fever virus 20-kDa DNA polymerase involvedin DNA repair [J]. J. Biol. Chem.， 1997， 272（49）：30899-30910.

［14］ SHOWALTER A K， TSAI M D. A DNA polymerase withspecificity for five base pairs [J]. J. Am. Chem. Soc.， 2001， 123（8）：1776-1777.

［15］ SHOWALTER A K， BYEON I J， SU M I， et al .. Solutionstructure of a viral DNA polymerase X and evidence for amutagenic function [J]. Nat. Struct. Biol.， 2001， 81（1）：942-946.

［16］ MACIEJEWSKI M W， SHIN R， PAN B， et al .. Solutionstructure of a viral DNA repair polymerase [J]. Nat. Struct.Biol.， 2001， 81（1）：936-941.

［17］ AHN J， KRAYNOV V S， ZHONG X， et al .. DNA polymerasebeta： effects of gapped DNA substrates on dNTP specificity，fidelity， processivity and conformational changes [J]. Biochem.J.， 1998， 331（Pt1）：79-87.

［18］ CHAGOVETZ A M， SWEASY J B， PRESTON B D. Increasedactivity and fidelity of DNA polymerase beta on singlenucleotidegapped DNA [J]. J. Biol. Chem.， 1997， 272（44）：27501-27504.

［19］ LAMARCHE B J， KUMAR S， TSAI M D. ASFV DNA polymerseX is extremely error-prone under diverse assay conditions andwithin multiple DNA sequence contexts [J]. Biochemistry， 2006，454（9）：14826-14833.

［20］ COSTARD S， WIELAND B， DE GLANVILLE W， et al .. Africanswine fever： how can global spread be prevented ？ [J]. PhilosTrans. R Soc. Lond B Biol. Sci.， 2009， 3641（530）：2683-2696.

［21］ ROWLANDS R J， MICHAUD V， HEATH L， et al .. Africanswine fever virus isolate， Georgia， 2007 [J]. Emerg. Infect. Dis.，2008， 141（2）：1870-1874.

［22］ ZHOU X， LI N， LUO Y， et al .. Emergence of African swinefever in china， 2018 [J]. Transbound Emerg. Dis.， 2018， 65（6）：1482-1484.

［23］ RAJUKUMAR K， SENTHILKUMAR D， VENKATESH G， et al..Genetic characterization of African swine fever virus from domesticpigs in India [J]. Transbound Emerg. Dis.， 2021， 68（5）：2687-2692.

［24］ SAUTER-LOUIS C， FORTH J H， PROBST C， et al .. Joiningthe club： first detection of African swine fever in wild boar inGermany [J]. Transbound Emerg. Dis.， 2021， 68（4）：1744-1752.

［25］ GONZALES W， MORENO C， DURAN U， et al .. African swinefever in the Dominican Republic [J]. Transbound Emerg. Dis.，2021， 68（6）：3018-3019.

［26］ BLOME S， FRANZKE K， BEER M. African swine fever - areview of current knowledge [J/OL]. Virus Res.， 2020， 287：198099[2023-02-15]. https：//doi.org/10.1016/j.virusres.2020.198099.

［27］ LINDAHL T， WOOD R D. Quality control by DNA repair [J].Science， 1999， 2865（446）：1897-1905.

［28］ BEARD W A， WILSON S H. Structural design of a eukaryoticDNA repair polymerase： DNA polymerase beta [J]. MutatantRes.， 2000， 4603（4）：231-244.

［29］ CHEN Y， ZHANG J， LIU H， et al .. Unique 5-P recognitionand basis for dG： dGTP misincorporation of ASFV DNApolymerase X [J/OL]. PLoS Biol.， 2017， 152： e1002599[2023-02-15]. https：//doi.org/10.1371/journal.pbio.1002599.

［30］ LEY V， ALMENDRAL J M， CARBONERO P， et al .. Molecularcloning of African swine fever virus DNA [J]. Virology， 1984，133（2）：249-257.

［31］ MAZUR-PANASIUK N， WO?NIAKOWSKI G. The uniquegenetic variation within the O174L gene of polish strains ofAfrican swine fever virus facilitates tracking virus origin [J].Arch. Virol.， 2019， 164（6）：1667-1672.

［32］ QU H， GE S， ZHANG Y， et al .. A systematic review of genotypesand serogroups of African swine fever virus [J]. Virus Genes，2022， 58（2）：77-87.

［33］ BISHOP R P， FLEISCHAUER C， DE VILLIERS E P， et al ..Comparative analysis of the complete genome sequences ofkenyan African swine fever virus isolates within p72 genotypesⅨ and Ⅹ [J]. Virus Genes， 2015， 50（2）：303-309.

［34］ CHAPMAN D A， DARBY A C， SILVA M D A， et al .. Genomicanalysis of highly virulent Georgia 2007/1 isolate of Africanswine fever virus [J]. Emerg. Infect. Dis.， 2011， 17（4）：599-605.

［35］ DE VILLIERS E P， GALLARDO C， ARIAS M， et al ..Phylogenomic analysis of 11 complete African swine fever virusgenome sequences [J]. Virology， 2010， 400（1）：128-136.

［36］ MASEMBE C， SREENU V B， SILVA FILIPE A D A， et al ..Genome sequences of five African swine fever virus genotypeIX isolates from domestic pigs in Uganda [J/OL]. Microbiol.Resour. Announc.， 2018， 713：e01018-18 [2023-02-15]. https：//doi.org/10.1128/MRA.01018-18.

［37］ RODR?GUEZ J M， MORENO L T， ALEJO A， et al .. Genomesequence of African swine fever virus BA71， the virulentparental strain of the nonpathogenic and tissue-culture adaptedBA71V [J/OL]. PLoS One， 2015， 1011：e0142889 [2023-02-15].https：//doi.org/10.1371/journal.pone.0142889.

［38］ ASLANYAN L， AVAGYAN H， KARALYAN Z. Whole-genomebasedphylogeny of African swine fever virus [J]. Vet. World，2020， 13（10）：2118-2125.

［39］ SIMULUNDU E， LUBABA C H， VAN HEERDEN J， et al .. Theepidemiology of African swine fever in "nonendemic" regionsof Zambia （1989—2015）： implications for disease preventionand control [J/OL]. Viruses， 2017， 99： 236 [2023-02-15].https：//doi.org/10.3390/v9090236.

［40］ REDREJO-RODRíGUEZ M， RODR?GUEZ J M， SU?REZ C，et al .. Involvement of the reparative DNA polymerase pol Ⅹ ofAfrican swine fever virus in the maintenance of viral genomestability in vivo [J]. J. Virol.， 2013， 871（7）：9780-9787.

（責任編輯：張冬玲）

基金項目：中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（Y2021XK20）；國家自然科學基金項目（31972541）；六安市產學合作重大專項。