2株甘蔗內生菌功能特性研究

羅艷菊 謝林艷 劉涵 劉魯峰 何麗蓮 李富生

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.10.037

摘要：K5菌株和ZM菌株是在30% PEG-6000脅迫下具有較強活性的2株甘蔗內生菌，對其溶無機磷、分泌嗜鐵素、羧甲基纖維素酶、ACC脫氨酶、胞外多糖（EPS）的能力進行探究，并通過發芽試驗評價2株菌株對玉米種子萌發和幼苗生長的促進作用。結果表明，2株甘蔗內生菌均具備上述測定的多種功能特性。其中K5菌株具有較強的分泌嗜鐵素和ACC脫氨酶的能力，其嗜鐵素相對含量為0.209（培養3 d），ACC脫氨酶活性為3.302 U/mg；ZM菌株具有較強的分泌胞外多糖和溶無機磷能力，其胞外多糖分泌量為0.157 mg/mL，溶無機磷量為407.454 mg/L。此外，與清水處理的對照相比，2株菌株均能提高玉米種子的發芽勢，并且表現出一定的促生長效果，其中K5菌株的促生效果較好。表明2株甘蔗內生菌均是具有促生、抗旱和產羧甲基纖維素酶潛力的多功能菌株，有良好的開發潛力，可為植物抗旱性的研究及生物菌肥的研制提供一定的理論依據及菌株資源。

關鍵詞：甘蔗；內生菌；功能特性；定性；定量；發芽試驗

中圖分類號：S566.101；S182? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）10-0268-06

收稿日期：2023-07-06

基金項目：云南省重大科技專項（編號：202202AE090021）；云南省教育廳科學研究基金（編號：2022J0286）；云南省作物生產與智慧農業重點實驗室專項（編號：202105AG070007）。

作者簡介：羅艷菊（1998—），女，云南硯山人，碩士研究生，研究方向為甘蔗種質資源評價與利用。E-mail：1833912990@qq.com。

通信作者：李富生，博士，教授，主要從事甘蔗資源研究與利用工作。E-mail：Lfs810@sina.com。

甘蔗（Saccharum officinarum L.）屬于禾本科甘蔗屬多年生的無性繁殖作物［1］，是世界上重要的糖料和能源作物。我國是重要的甘蔗種植國，蔗糖產量占食糖總產量的90%以上［2］。目前，有130多個國家進行甘蔗的種植，占地約2 600萬hm2［3］。近年來，我國甘蔗種植的大部分區域逐漸向土地貧瘠、灌溉條件差、養分水分保持能力弱的旱坡地發展，旱地甘蔗種植面積約占甘蔗種植總面積的80%［4-5］。在這樣的條件下甘蔗種植受養分不足及干旱脅迫就更為嚴重，而甘蔗在其生育期內對水肥需求大，但過多的水肥投入會使產投比降低，不利于甘蔗產業的可持續發展。如何提高甘蔗對土壤養分的利用率和增強甘蔗作物自身抗逆性來增加產投比以實現甘蔗產業可持續發展，目前已成為甘蔗栽培研究領域急需解決的問題。

眾多研究表明，植物內生菌能夠促進植物的生長并提高植物的抗旱性［6-7］，而且一些菌株還能產羧甲基纖維素酶，具有重要的工業應用價值［8］。植物內生菌能通過溶磷、分泌生長素、嗜鐵素等促生長特性來促進植物的營養吸收和健康生長，提高植物適應外界不利的條件，從而提高植物的抗逆性［9-10］。Arshad等認為，含ACC脫氨酶的微生物有助于平衡非生物脅迫下植物中產生的乙烯水平，從而有利于植物的生長和發育［11］。有學者認為，接種分泌ACC脫氨酶的菌株有助于植物對N、P、K的吸收，有助于消除外界脅迫對植物生長的抑制作用［12］。谷書杰等接種分泌ACC脫氨酶的內生菌，提高了甘蔗的抗旱性［13］。此外，楊苗研究發現，胞外多糖（EPS）具有獨特的保水性，具有保持土壤團聚體穩定性的功能，接種分泌EPS和ACC脫氨酶的促生菌能提高植物的抗旱性［14］；魏宏宇等也認為，分泌EPS的微生物可以用來提高逆境脅迫下農作物的抗逆能力［15］。目前國內外對甘蔗多功能內生菌的報道較少，篩選具有促生和抗旱潛力等多功能的內生菌對甘蔗內生菌的研究及甘蔗產業的發展具有重要的意義。

本研究以前期在30% PEG-6000處理下具有較強活性的2株甘蔗內生菌為目標菌株，探究菌株溶無機磷，分泌嗜鐵素、羧甲基纖維素酶、ACC脫氨酶、EPS，促發芽和促生長等能力，以期挖掘甘蔗內生菌潛在的功能特性，豐富甘蔗的內生菌資源，為后期大田試驗的研究及生物菌肥的開發利用提供一定的理論基礎。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

供試菌株：由云南農業大學甘蔗研究所前期分離保存的甘蔗內生菌，其中編號為K5的菌株是從甘蔗栽培種崖城89的根部分離所得，經前期鑒定為考克氏菌（Kocuria），菌株登錄號為OP737815；編號為ZM的菌株是從甘蔗野生種蔗茅的根部分離所得，前期鑒定為芽孢桿菌（Bacillus），菌株登錄號為OP740361。

植物材料：玉米種子（師單8號），由云南農業大學植物保護學院提供。

培養基：LB培養基，NBRIP培養基［16］，CAS培養基，MKB培養基［17］，TSB液體培養基，DF液體培養［18］，基礎培養基［19］，羧甲基纖維素酶鑒別培養基［20］。

1.2? 試驗時間和地點

試驗于2023年2—6月在云南農業大學農學與生物技術學院作物生產與智慧農業重點實驗室進行。

1.3? 試驗方法

1.3.1? 菌株溶無機磷能力的測定

定性測定：采用平板透明圈法對菌株的溶磷能力進行測定。將 50 μL 菌株種子液接種于用打孔器打好孔（打孔器直徑0.3 cm）的NBRIP固體培養基中，每株菌株3個重復，于28 ℃培養箱中培養10 d后根據培養基中透明圈的大小及可溶性指數D/d（D為透明圈大小，d為菌落直徑）來初步確定菌株的溶磷能力［21］。

定量測定：首先建立磷標準曲線，然后將菌株接種于NBRIP無機磷液體培養基中，于搖床30 ℃、160 r/min培養12 d后采用鉬銻抗比色法于波長700 nm處進行吸光度的測定，并計算菌株的溶磷量K（mg/L）=（c×V×T）/V0［22-23］。其中：c表示通過標準曲線計算得到的磷濃度，mg/L；V表示定容體積，此處為50 mL；T為分取倍數，為10倍；V0表示加入發酵液的體積，為5 mL。

1.3.2? 菌株分泌嗜鐵素能力的測定

定性測定：菌株分泌嗜鐵素的定性測定參照陳佳亮等的方法［17，24］，將50 μL菌株種子液接種于打好孔（打孔器直徑0.6 cm）的CAS固體培養基上，于 28 ℃ 的恒溫培養中培養10 d后觀察培養基中菌落周圍若有橘黃色透明圈產生，即該菌株能分泌嗜鐵素。測定橘黃色透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），計算可溶性指數（D/d），根據可溶性指數的大小判斷菌株分泌嗜鐵素的能力。

定量測定：采用CAS檢測法進行菌株分泌嗜鐵素的定量測定，將菌株以1%的接種量接種于MKB液體培養基中，于30 ℃、160 r/min的搖床中分別培養2、3 d，參照趙微等的方法［25-26］于630 nm的分光光度計下測定其吸光度。用去離子水調零；菌株的光密度值記為Ds，對照記為Dr，最后計算嗜鐵素的相對含量（Ds/Dr）。

1.3.3? 菌株產羧甲基纖維素酶能力的測定

將菌株接種于羧甲基纖維素酶鑒別培養基中，28 ℃恒溫培養7 d后，1 mg/mL剛果紅染色60 min，1 mol/L氯化鈉溶液脫色2 min，根據透明圈的大小及可溶性指數判斷菌株產羧甲基纖維素酶能力的強弱［8，20］。

1.3.4? 菌株分泌ACC脫氨酶能力的測定

菌株接種于TSB液體培養基中，于28 ℃、160 r/min搖床培養12 h后，4 ℃，8 000 r/min離心10 min，收集菌體重懸于7.5 mL的DF液體培養基中，加入0.5 mol/L的ACC，28 ℃、160 r/min培養24 h后參照張國壯等的方法［18，27］進行ACC脫氨酶的測定和計算。

1.3.5? 菌株產EPS能力的測定

利用苯酚-硫酸法和DNS法繪制葡萄糖標準曲線，將菌株種子液以4%的接種量接種于基礎培養基中，于30 ℃、140 r/min 搖床培養48 h后參照王琪的方法［19］測定菌株分泌總糖和還原糖的量，然后根據EPS含量=總糖含量-還原糖含量，計算出菌株分泌EPS的量。

1.3.6? 菌株對玉米發芽和幼苗生長的影響

選擇粒大飽滿的玉米種子，先用75%的乙醇浸泡1 min，再用2%的次氯酸鈉溶液浸泡10 min對種子進行表面消毒［28］，后用無菌水沖洗3次，最后用吸水紙將種子表面的水分吸干備用。將目標菌株于搖床 28 ℃、160 r/min，培養48 h后離心去除上清，將菌體用無菌水進行重懸后并稀釋成濃度為1.0×107 CFU/mL 的菌液用于浸種處理，其中CK為清水浸種。對玉米種子采用不同菌液和清水分別浸種 4 h 后，放于鋪有濕潤濾紙的培養皿中，并于28 ℃恒溫箱中培養，期間每天觀察種子發芽情況，并適當補充水分。第3天計算種子發芽勢，第7天計算其發芽率，第10天對玉米幼苗的株高、莖粗和主根長等農藝性狀進行測定。

種子發芽勢=（3 d內種子萌發數/供試種子數）×100%；種子發芽率=（7 d內種子萌發數/供試種子數）×100%。

1.4? 數據分析

采用Excel 2019和SPSS 25.0對數據進行統計分析及圖表繪制。

2? 結果與分析

2.1? 菌株的溶磷能力

2.1.1? 定性測定

從圖1可見，2株菌株在溶無機磷固體培養基上均能產生明顯的透明圈，說明2株菌株均具備一定的溶無機磷能力。根據表1中可溶性指數的大小判斷菌株溶無機磷的能力，其中ZM菌株的可溶性指數為3.75±0.32，大于K5的可溶性指數（3.58±0.17），可初步判斷ZM菌株溶無機磷的能力強于K5菌株。

2.1.2? 定量測定

圖2為菌株溶無機磷能力的定量分析（其中磷標準曲線的回歸方程為 y=0.048 4x-0.000 4，r2=0.999 5），K5、ZM菌株有效溶無機磷的量分別為398.383、407.454 mg/L，其中ZM菌株溶無機磷能力強于K5菌株，與定性測定結果一致。

2.2? 菌株分泌嗜鐵素的能力

2.2.1? 定性測定

CAS固體檢測培養基上2株甘蔗內生菌周圍均存在橘黃色暈圈，可初步認為其均具備嗜鐵素合成的能力（圖3）。在相同培養條件和時間下，可溶性指數的值越大則說明該試驗菌株分泌嗜鐵素的能力越強，可以用來初步分析菌株分泌嗜鐵素能力的強弱。根據表2可知，K5菌株的可溶性指數顯著大于ZM菌株，初步判斷K5菌株分泌嗜鐵素的能力強于ZM菌株。

2.2.2? 定量測定

采用紫外分光光度法，以分光光度計波長630 nm下的顏色反應對2株菌株分泌嗜鐵素的能力進行定量測定。根據As/Ar的大小來判斷菌株分泌嗜鐵素的能力，As/Ar越小，表明菌株產嗜鐵素量越多。從圖4可知，菌株培養2 d和 3 d 后嗜鐵素的相對含量（As/Ar）均為K5＜ZM且差異顯著，表明K5菌株分泌嗜鐵素的能力強于ZM，測定結果與定性測定結果一致。此外，在一定的時間范圍內菌株隨著培養時間的延長，其嗜鐵素的分泌量增加。培養3 d后嗜鐵素相對含量為0.209。

2.3? 菌株產羧甲基纖維素酶的能力

圖5為菌株產纖維素酶的定性測定結果。經過計算菌株可溶性指數可知，ZM菌株產羧甲基纖維素酶的能力微強于K5菌株，但差異不顯著（表3）。

2.4? 菌株分泌ACC脫氨酶的能力

2株菌株測得的ACC脫氨酶活性如圖6所示，K5、ZM菌株的ACC脫氨酶活性分別為3.302、1.520 U/mg，K5菌株的ACC脫氨酶活性顯著高于ZM菌株。

2.5? 菌株分泌EPS的能力

根據總糖和還原糖標準曲線的回歸方程（總糖 y=0.441 1x-0.002 3，r2=0.996；還原糖y= 0.009 8x +0.006 4，r2=0.992），計算得菌株產總糖、還原糖及EPS的含量。從表4可知，ZM菌株分泌EPS的能力較強，為0.157±0.002 mg/mL，而K5菌株EPS的分泌量僅為0.086±0.002 mg/mL，2株菌株分泌EPS的能力為ZM菌株顯著強于K5菌株。

2.6? 菌株對玉米種子萌發及幼苗生長的影響

由表5可知，相比于CK，K5菌株處理顯著提高了玉米種子的發芽勢、株高和主根長，ZM菌株處理也提高了玉米種子發芽勢和株高，但效果不顯著；CK、K5、ZM這3個處理對玉米的發芽率、莖粗、根冠比和鮮重無顯著影響。綜上可知，K5、ZM菌株相比于CK具有促進玉米種子發芽勢的提高和玉米植株生長的作用，且K5菌株的促進作用強于ZM菌株。圖7為玉米種子恒溫培養10 d后的植株生長情況，從中可以看出，經過ZM、K5菌株處理的玉米株高明顯高于CK處理，且根系也較CK更為發達。因此認為K5、ZM菌株具有促進玉米種子早發芽和促進玉米植株生長的作用。

3? 討論與結論

本研究對2株菌株溶無機磷能力進行了定性和定量分析，結果表明，2株菌株均具有溶無機磷的能力，菌株培養12 d后其溶無機磷量分別為398.383、473.905 mg/L；低于尚曉靜等藍莓溶磷菌搖瓶培養5 d的最大溶磷量（587.31 mg/L）［22］；高于李云海等搖瓶培養12 d后溶磷菌的最大溶磷量（362.60 mg/L）［16］；遠高于普鳳雅等的薏苡溶磷菌搖瓶培養5 d的最大溶磷量（62.93 mg/L）［29］。推測菌株溶磷能力的強弱與菌株培養時間的長短、 宿主植物及菌株類型等因素均有一定的關系。呂嬌嬌對菌株溶磷機制進行了相關的研究［30］，但菌株的溶磷機理較為復雜，本試驗未進行深入研究。此外，本研究中菌株溶磷能力的定量測定結果與定性測定結果具有一致性，但在定性測定中會因培養基厚度不同而影響菌株溶磷速度及效率，從而影響其透明圈的大小和溶磷能力的定性測定結果。

鐵在植物生長發育中起著重要的作用，地殼中有豐富的鐵，但可被植物利用的可溶性游離鐵離子較少，植物需要從自身或微生物合成的嗜鐵素中攝取鐵離子［31］。通常認為Ds/Dr低于0.5的菌株分泌嗜鐵素的能力較強［32］，本研究的2株甘蔗內生菌培養3 d的Ds/Dr分別為0.21和0.23，因此認為本研究的2株甘蔗內生菌具有較強的分泌嗜鐵素能力。此外，K5、ZM菌株培養2 d的Ds/Dr分別為0.29和0.37，高于培養3 d的Ds/Dr，表明在一定的時間范圍內菌株分泌嗜鐵素的能力隨培養時間的延長而增強。狄義寧等從甘蔗內生菌中篩選得到12株功能菌可分泌異羥肟酸類、兒茶酚類、有羧酸類的嗜鐵素［23］，而本研究中2株甘蔗內生菌分泌嗜鐵素的類型還有待進一步研究和驗證。

ACC脫氨酶在微生物促進植物生長及提高植物抗旱性方面有重要的作用。張丹對細菌菌株中AcdS基因進行敲除發現，ACC與脫氨酶直接負責脅迫條件下的植物生長，細菌中存在高含量的ACC脫氨酶，能夠保護作物免受多種脅迫的傷害［26］。研究表明，當ACC脫氨酶活性高于0.020 U/mg時，即可促進植物的生長［33］。本研究的2株菌株分泌ACC脫氨酶的活性分別為1.520、3.302 U/mg，低于辛樹權等從燕麥根際菌株中發現ACC脫氨酶的活性（8.893 U/mg）［34］，又高于黃天姿等從大豆根際土壤中分離的菌株分泌，ACC脫氨酶的最高活性 （0.097 8 U/mg）［35］，推測酶活性的強弱可能與菌株的種類及其宿主植物的類型等因素有關。此外，Arshad等認為，產ACC脫氨酶的微生物可以有效地部分或完全消除干旱脅迫對豌豆生長、產量和成熟的影響［11］。而且有學者認為，ACC脫氨酶活性的大小可作為抗逆能力強弱的標準［36］。所以菌株分泌ACC脫氨酶的能力強弱可以作為該菌株是否能提高植物抗旱性的參考。

此外，分泌EPS的微生物在提高植物抗旱性方面也具有重要的作用。魏宏宇等認為，產EPS的微生物提高植物抗旱性的原因是EPS具有獨特的保水性，一方面能夠穩定土壤團聚體結構，另一方面能夠調節植物根系的水分［15］。Sandhya等研究發現，產EPS的內生有益菌，可以通過改善土壤結構和促進植物生長來減輕向日葵植物的干旱脅迫［37］。據Ghosh等報道，細菌分泌EPS更有助于它們定殖于根部并形成生物膜，保護它們在滲透脅迫下免于干燥［38］。Naseem等用產EPS的細菌對玉米種子進行浸種處理，發現改善了土壤的水分含量及植物生物量，并提高了玉米的抗旱性［39］。不難發現，提高植物抗旱性的基礎是改善土壤環境并促進植物的健康生長。此外，有學者認為菌株功能的多樣性與其宿主植物生活的環境及其生態競爭力具有相關性［24］。所以，功能菌株的尋求可以選擇生態競爭力強的宿主植物進行探究。

綜上可知，本研究中K5菌株的促生作用略強于ZM菌株，可能是由于K5菌株分泌嗜鐵素、ACC脫氨酶的能力顯著高于ZM菌株。菌株的作用機制較為復雜，后期有待結合分子層面及多組學分析、溫室試驗等進行探究。

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