富血小板血漿-80 ℃深低溫短期保存后細胞因子的變化

藺錫桐 劉加秀 張樹超

［摘要］ 目的

分析富血小板血漿（PRP）-80 ℃深低溫短期保存以后，其內P-選擇素、血管內皮生長因子（VEGF）、血小板源生長因子（PDGF）濃度及其pH值等重要指標的變化，為PRP低溫儲存提供理論依據。

方法

取30例健康供者血液制備的PRP，每份樣本分裝成5份，每份留取0.5 mL，分別為A組（新鮮組）和B～E組（分別凍存5、10、15、20 d）。測定各組PRP的pH值；ELISA法測定各組PRP中P-選擇素、PDGF和VEGF的水平；血管形成實驗檢測A組和E組對HUVEC細胞血管形成能力的影響。

結果 各組pH值比較差異無顯著性（P＞0.05）；各組PRP中P-選擇素、PDGF、VEGF的濃度比較，差異均無顯著性（P＞0.05）；A組和E組中HUVEC血管形成數量比較差異無顯著意義（P＞0.05）。

結論 -80 ℃深低溫保存PRP對其pH值、P-選擇素、VEGF和PDGF濃度變化無顯著影響，可延長PRP臨床應用時間。

［關鍵詞］ 富血小板血漿；低溫保存；P選擇素；血管內皮生長因子類；血小板源性生長因子；氫離子濃度

［中圖分類號］ R457.14;R318.52??? ［文獻標志碼］ A

富血小板血漿（PRP）是自體全血經由離心濃縮制得的血液制品，其主要成分為濃縮后的血小板[1]。血小板內含有多種細胞器，包括α-顆粒、致密顆粒和溶酶體等，其中α-顆粒中包含大量生長因子。PRP受刺激后會脫顆粒釋放大量的生長因子，如P-選擇素、血管內皮生長因子（VEGF）、血小板源生長因子（PDGF）等[2]，這些因子通過相互介導，可形成廣泛且多層次的信號分子調控網絡，促進成纖維細胞、神經膠質細胞、上皮以及內皮細胞的增殖，加速傷口愈合和組織修復[3]。目前PRP多用于退行性疾病、難愈性創面修復、急慢性損傷、燒傷和角膜損傷等多種臨床疾病的治療，已被廣泛應用于運動醫學科、康復醫學科、心臟外科、婦科、整形外科和眼科等多個學科領域[4]。PRP治療的一個療程多為1～3周，但其常規保存期只有5 d，超過保存期以后的PRP由于理化性質等方面的改變會導致PRP失活，致血液浪費。因此，如何長期保存PRP是目前臨床的一大難題。本研究通過將PRP在-80 ℃深低溫短期保存后，比較冷凍前后其pH值的變化，以及其內P-選擇素、血管內皮生長因子（VEGF）、血小板源生長因子（PDGF）等重要生長因子濃度的變化，為PRP低溫儲存提供理論依據。 現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

多功能酶標分析儀、-80 ℃冰箱（美國Thermo Fisher Scientific公司），正置倒置一體熒光顯微鏡（美國Discover Echo公司），筆式pH計（上海般特儀器有限公司），凝血酶（批號No.721N031，北京索萊寶公司，終濃度為1×105 U/L）；ABW基質膠（批號20223019ZHA，上海諾娃醫藥科技有限公司）；VEGF-ELISA試劑盒（批號25319591007，武漢博士德生物工程有限公司）；PDGF-ELISA試劑盒（批號7WKTNPQ1JD）和P-選擇素-ELISA試劑盒（批號KL048RN06998）均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 對象及其分組

選取30例自愿獻血者的PRP樣本。納入標準：①均符合我國國家標準中對獻血者的體檢以及血液檢查的要求；②年齡18～55歲者；③體質量50～82 kg者；④身體健康無傳染病，并在1周內未服用過干擾血小板的藥物者；⑤PRP的計數納入標準約為（1 081.30±115.66）×109/L者。將每例PRP分裝成5份，每份0.5 mL，分別為A～E組。A組為新鮮PRP，B～E組分別置于-80 ℃凍存5、10、15、20 d的PRB。

1.3 研究方法

1.3.1 各組PRP的pH值測定 使用筆式pH計測定A～E組PRP的pH值。其中B～E組PRP在從冰箱取出以后，需要先解凍至室溫狀態，再進行測量。

1.3.2 ELISA方法測定各組PRP中P-選擇素、PDGF和VEGF的水平 將凝血酶用生理鹽水配成濃度為1×105 U/L的溶液，加入無水氯化鈣溶解，按照Ca2＋∶凝血酶為40 g/L∶1×105 U/L的比例配置激活溶液。分別取A～E組PRP樣品，按照1 mL的PRP中加入40 μL激活溶液配比激活PRP，靜置2 h后，以15 000 r/min離心10 min，取上層血清。嚴格按照各細胞因子的ELISA試劑盒說明書中的要求進行操作，在加入終止液后立即用多功能酶標儀測量波長450 nm處的吸光度值，并根據各自標準曲線，帶入所測得吸光度值，計算血清中P-選擇素、PDGF和VEGF水平。

1.3.3 細胞培養 將HUVEC細胞置于含有10%的FBS的DMEM培養基中，于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的細胞培養箱中進行常規培養，待細胞密度達70%～80%時進行換液傳代，傳至第三代的細胞用于后續實驗。

1.3.4 HUVEC細胞血管形成實驗 ①將ABW基質膠和不含胎牛血清的DMEM培養液按照1∶2比例稀釋，取24孔板，每孔加入200 μL基質膠稀釋液，置于37 ℃恒溫培養箱中45 min使其凝固；②取A組與E組PRP血清分別加入到含10%胎牛血清的DMEM培養基中混勻，留待備用；③將生長狀態良好的第三代HUVEC細胞以胰酶消化，分為兩份，以1 000 r/min離心5 min后棄上清液，分別用配制好的含有A組與E組PRP血清的混合培養基重懸，調整HUVEC細胞濃度為1×106個/mL，待基質膠凝固后于24孔板中每孔中加入200 μL細胞重懸液，使得每孔中細胞數量約為2×105個，置于37 ℃細胞培養箱中培養3 h，使用正置顯微鏡觀察HUVEC細胞血管形成的數量。

1.4 統計學處理

采用GraphPad Prism 9.0對數據進行統計分析和圖像處理，計量資料以[AKx-D]±s表示，各組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗。A組和E組HUVEC細胞的血管形成數量比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結? 果

2.1 各組PRP的pH值以及PDGF、P-選擇素、VEGF水平比較

A～E組PRP的pH值比較差異無顯著意義（P＞0.05），各組中P-選擇素、PDGF和VEGF的水平比較差異無顯著性（P＞0.05）。見表1。

2.2 PRP中的生長因子對于HUVEC血管形成的影響

A組和E組中HUVEC的血管形成數量分別為（49.67±3.79）、（50.00±1.00）個，兩組比較差異無顯著性（P＞0.05）。見圖1。

3 討? 論

PRP中血小板的濃度遠高于生理基線，在受到刺激后血小板會釋放大量與創傷愈合相關的生長因子和黏附蛋白，從而啟動細胞和組織的修復并加快其進程[5-7]。PRP釋放的大量生長因子能通過自分泌、旁分泌和內分泌等機制啟動損傷修復級聯反應，通過刺激細胞的遷移和增殖、血管生成和基質的合成等途徑，啟動和促進傷口的愈合和修復[8]。

近些年來PRP已被開發應用于臨床中的多個學科[9-14]。PRP治療每療程多不超過3次，時間間隔多為1～3周。據此，本研究探索-80 ℃凍存5、10、15、20 d后PRP的pH值及其內各種細胞因子的變化，研究結果可為臨床應用提供依據。

離體后的血小板失去細胞內環境的保護作用會變得極其脆弱，容易受劇烈震蕩、溫度和pH值變化等影響而引起血小板的聚集和碎裂，從而影響其生物學功能。常規在臨床上PRP多在（22±2）℃的恒溫振蕩箱中保存，并且保存時間不超過5 d[13]。依靠這種常溫振蕩保存方法，PRP保存時間短、易污染和功效易降低或失活等缺點給臨床治療帶來諸多不便，還需要對患者進行頻繁血液樣本采集，為患者帶來巨大精神和經濟壓力。因此，在不損害PRP功能的前提下對其進行凍存也已成為關注熱點之一。隨著深低溫冰箱的推廣，本研究分析PRP儲存在-80 ℃冰箱后其pH值及各種因子水平的變化，以探索延長PRP臨床應用時間的方法。

PRP發揮生理功能的最適pH值約為6.5～7.2，在常溫保存過程中，PRP仍會進行有氧代謝和糖酵解等新陳代謝，糖酵解產生的乳酸和氫離子積累到一定濃度時會使得PRP的pH值迅速下降，當pH值下降至6.0～6.1時，血小板形態由圓盤狀變為圓球狀，并且此不可逆的形態變化伴隨血小板數量下降和釋放的各類生長因子生物學功能的完全喪失[15]。低溫能夠減慢其新陳代謝進程，降低乳酸的生成和積累，維持血漿緩沖作用。本研究結果顯示，新鮮PRP及-80 ℃凍存5、10、15、20 d的PRP比較，各組的pH值不存在顯著差異，說明在-80 ℃凍存條件下能夠延緩PRP糖酵解作用引起的乳酸堆積，延緩pH下降的速度，延長保存時間。

血小板釋放的各種生長因子中，PDGF是一種刺激組織細胞生長的肽類調節分子，生理狀態下存在于血小板α顆粒中[16]。有研究表明，PDGF在早期發育階段能通過結合PI3K/Akt、JAK/STAT和Src等多條跨膜酪氨酸通路促進細胞有絲分裂和趨化，從而刺激傷口處成纖維細胞、平滑肌細胞和其他細胞的分裂增殖[17-18]。在后期成熟期，PDGF則可促進組織重塑以及特殊細胞的分化[19]。本研究結果顯示，新鮮PRP及-80 ℃凍存5、10、15、20 d的PRP比較，各組中PDGF含量無顯著差異，提示凍存的PRP在PDGF水平釋放上可以滿足臨床應用需求。

VEGF是一類重要的具有促血管生成活性的生長因子，對內皮細胞有促進有絲分裂和抗凋亡作用，能夠增加血管通透性，促進細胞遷移[20]。既往研究顯示，VEGF可以通過PLCγ-ERK和PLCγ-PKC通路來調節細胞增殖，從而促進創面愈合[21]。同時，VEGF是促進血管和淋巴管形成的重要因子，新生的血管和淋巴管可為創面組織的新生和修復供應充足的養分，促進傷口的愈合[22-23]。本研究中，新鮮PRP及-80 ℃凍存5、10、15、20 d的PRP比較，各組中VEGF含量比較無顯著差異；同時新鮮PRP和-80 ℃凍存20 d的PRP對HUVEC血管形成能力的影響也無顯著差異。提示凍存5、10、15、20 d并不會對PRP的VEGF濃度造成影響，在促進新生血管的生成中的作用與新鮮PRP相近。

另外，血小板中的P-選擇素作為黏附分子家族一員，能夠介導粒細胞和單核細胞在內皮細胞表面的滾動以及血小板之間的黏附作用，不僅能夠參與細胞間和細胞-細胞外基質的相互作用，調節參與信號轉導途徑和炎癥的發生發展[24]，而且是在血栓形成和凝血過程中發揮有重要作用[25]。P-選擇素能夠易位到活化后的血小板表面，支持血小板-血小板之間的相互作用，促進血栓形成和凝血[26]。不僅如此，P-選擇素還能夠促進損傷部位對白細胞的募集，此行為能夠加速炎癥的早期進程[27]。本研究中，PRP在-80 ℃凍存5、10、15、20 d后，與新鮮PRP釋放的P-選擇素比較，并無顯著差異。可見，P-選擇素在冰凍20 d后仍能發揮其正常生物學功能。

綜上所述，-80 ℃凍存5、10、15、20 d均不影響PRP中PDGF、P-選擇素和VEGF等重要生長因子的含量及其生物學功能，同時能夠顯著延緩其pH值下降的速度，較長時間維持PRP功能。該研究結果為臨床長時間保存PRP提供了一定的理論依據。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學附屬醫院醫學倫理委員會的審核批準（文件號QYFYWZLL28419）。所有試驗過程均遵照《實驗室安全管理守則》的條例進行。受試對象或其親屬已經簽署知情同意書。

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