銀耳多糖的純化及其生物活性

摘 " "要： 為了得到純度更高的銀耳多糖（TFPS），采用AB-8大孔樹脂吸附法、酶法、三氯乙酸（TCA）法、D-葡萄糖？啄-內(nèi)脂（GDL）法和聚酰胺法對(duì)粗制銀耳多糖（CTFPS）進(jìn)行純化即脫蛋白處理。以多糖損失率和蛋白質(zhì)脫除率為依據(jù)選取脫蛋白效果最佳的方法，并通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化銀耳多糖脫蛋白工藝條件。利用紅外和 SEM 對(duì)脫蛋白前后的銀耳多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，并結(jié)合抗氧化活性和吸濕保濕性能測(cè)試，對(duì)脫蛋白前后的銀耳多糖進(jìn)行生物活性對(duì)比。結(jié)果表明：AB-8 大孔樹脂吸附法的脫蛋白效果最佳，最優(yōu)工藝條件為CTFPS水溶液質(zhì)量濃度 5 mg/mL、AB-8 大孔樹脂用量 100 mg/mL、吸附時(shí)間 5 h、吸附溫度 20 ℃；在此條件下，蛋白質(zhì)脫除率為 82.47%，多糖損失率為 18.24%，且銀耳多糖脫蛋白純化后的抗氧化活性和吸濕保濕性能均優(yōu)于未脫蛋白銀耳多糖。

關(guān)鍵詞： 銀耳多糖（TFPS）；脫蛋白；結(jié)構(gòu)分析；抗氧化活性

中圖分類號(hào)： TS201.2 " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A " " " " " " " "文章編號(hào)： "１51１－０２４Ｘ（２０24）０2－００60－08

Purification and biological activity of Tremella fuciformis polysaccharides

HOU Yanhui1，2， LI Xige1，2， ZHANG Fengyi1，2， JIANG Chaoxian1，2， ZHANG Jiawei1，2

（1. School of Material Science and Engineering， Tiangong University， Tianjin 300387， China； 2. State Key Laboratory of Separation Membranes and Membrane Processes， Tiangong University， Tianjin 300387， China）

Abstract： In order to obtain a purer Tremella fuciformis polysaccharide （TFPS）， the crude Tremella fuciformis polysaccharide （CTFPS） is purified with AB-8 macroporous resin method， enzymatic method， trichloroacetic acid （TCA） method， and glucono-delta-lactone（GDL） method， respectively. Based on the loss rate of polysaccharide and re-moval rate of protein， the method with the best deproteinization effect was selected from five different deproteinization methods， and the process conditions for deproteinization of TFPS were optimized through single factor experiments. The structure of TFPS before and after deproteinization was analyzed using IR and SEM. Meanwhile， the bioactivity of TFPS before and after deproteinization was compared through the antioxidant activity and moisture absorption and moisturizing property tests. The results showed that adsorption method with AB-8 macroporous resin was the best for protein removal， and the optimal process conditions were aqueous concentration of CTFPS of 5 mg/mL， dosage of AB-8 macroporous resin of 100 mg/mL， adsorption time of 5 h， and adsorption temperature of 20 ℃. Under these conditions， the removal rate of protein was 82.47% and the loss rate of polysaccharide was 18.24%. Moreover， the antioxidant activity， moisture-absorbing and moisturizing properties of TFPS after deproteinization were stronger than those without deproteinization.

Key words： Tremella fuciformis polysaccharide（TFPS）； deproteinization； structural analysis； antioxidant activity

銀耳是擔(dān)子菌門真菌的子實(shí)體，既是一種具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的食用菌，又是中醫(yī)學(xué)中久負(fù)盛名的良藥[1]。銀耳子實(shí)體中的主要活性成分是銀耳多糖 （Tremella fuciformis polysaccharide，TFPS）[2- 3]。相關(guān)研究表明，銀耳多糖具有抗腫瘤、抗氧化、保濕、降血脂和抗炎抑菌等功能，可應(yīng)用在藥品、化妝品和食品等多個(gè)領(lǐng)域[4-8]。常用的 TFPS提取方法是水提醇沉法[9]。

水提醇沉法制得的粗制銀耳多糖 （CTFPS） 中含有很多的雜質(zhì)，包括色素、蛋白質(zhì)和少量的無機(jī)鹽，而蛋白質(zhì)的存在可能會(huì)影響多糖的生物活性。因此，為了得到更高純度的銀耳多糖，需要對(duì) CTFPS 進(jìn)行純化處理，即脫蛋白處理。常見的蛋白質(zhì)脫除方法有 Sevage 法、酶法、鹽酸法、鹽析法、聚酰胺法、大孔樹脂吸附法和三氯乙酸 （TCA） 法等[10-11]。其中，鹽酸法和 TCA 法蛋白質(zhì)脫除的效率最高[12]，但是多糖的保留率也低；而 Sevage 法不適用于食品工業(yè)加工。

蛋白質(zhì)脫除方法的不同會(huì)導(dǎo)致多糖的糖含量、得率和活性的不同。目前，大多數(shù)學(xué)者都聚焦于銀耳多糖的提取優(yōu)化，并對(duì) CTFPS 進(jìn)行抗氧化測(cè)試及藥理學(xué)研究，對(duì)有關(guān)脫除蛋白前后對(duì)銀耳多糖活性的研究較少。本研究對(duì) CTFPS 進(jìn)行不同的脫蛋白處理，以多糖損失率和蛋白質(zhì)脫除率為指標(biāo)找出最佳脫蛋白方法，對(duì)該方法進(jìn)行工藝優(yōu)化，并比較銀耳多糖脫蛋白前后的抗氧化活性和吸濕保濕性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

材料：銀耳子實(shí)體，市售福建古田銀耳；無水乙醇，山東博城化學(xué)有限公司產(chǎn)品；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （DPPH），上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品；苯酚，天津市永大化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；硫酸、氫氧化鈉，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司產(chǎn)品；剛果紅、TCA、考馬斯亮藍(lán) G250、牛血清白蛋白、D-葡萄糖酸δ-內(nèi)酯 （GDL），上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品。以上試劑均為分析純。

儀器：HJ-3 型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；TU-1810 型紫外-可見分光光度計(jì) （UV），上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；Nicolet-iS50 型傅里葉紅外光譜儀（FI-IR），德國(guó) ThermoFisher 公司產(chǎn)品；SU3500 型掃描電子顯微（SEM），日本 Hitachi 公司產(chǎn)品。

1.2 CTFPS 提取工藝

取 3 g 銀耳子實(shí)體粉碎，過 200 目篩，以質(zhì)量濃度 1/60 g/mL，濕法均質(zhì)打漿 4 min，在 90 ℃ 下水提 7 h，之后用 200 目濾袋抽濾 20 min，濾渣后再次水提 2 h，合并兩次濾液。濾液濃縮后，以 4 倍體積的 95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇沉淀 12 h。將醇沉溶液在 8 000 r/min 下離心 3 min，去除上清液，沉淀復(fù)溶于 10 mL 水中，凍干 12 h 后得到 CTFPS 粉末。

1.3 CTFPS 脫蛋白工藝

配制質(zhì)量濃度 5 mg/mL 的 CTFPS 水溶液，采用不同工藝進(jìn)行蛋白質(zhì)脫除。

（1） AB-8大孔樹脂吸附法（AB-8吸附法）[13]。AB-8 大孔樹脂在使用前需要進(jìn)行預(yù)處理，除去合成過程中的部分雜質(zhì)和致孔劑。預(yù)處理過程為：先用乙醇浸泡 6 h，抽濾后洗至無醇味，用 1 mol/L 的 HCl 溶液浸泡 2 h，抽濾后用 1 mol/L 的 NaOH 溶液浸泡 2 h，抽濾后用蒸餾水洗至 pH 中性，用蒸餾水浸泡保存至 4 ℃ 冰箱中備用。將預(yù)處理后的 AB-8 大孔樹脂進(jìn)行抽濾，稱取 2 g 濕重的大孔樹脂加入 20 mL CTFPS 水溶液中，封口，于 30 ℃ 水浴鍋中靜態(tài)吸附 3 h，抽濾后凍干得到脫蛋白銀耳多糖。探究 CTFPS 水溶液質(zhì)量濃度、AB-8 大孔樹脂用量、吸附時(shí)間、吸附溫度對(duì)蛋白質(zhì)脫除率的影響，平行試驗(yàn)3組，取其平均值，以獲得 AB-8 吸附法脫蛋白得到純化多糖 TFPS的優(yōu)化工藝。

（2） 酶法[14]。取 CTFPS 水溶液 20 mL，加入 20 mg/mL 木瓜蛋白酶（活力值為6 萬 U/g）， 50 ℃ 水浴鍋中酶解 1 h 后，升高溫度至 90 ℃ 滅酶 10 min，冷卻至室溫。在 8 000 r/min 下離心5 min，除去沉淀后凍干得到脫蛋白銀耳多糖。

（3） TCA法[15]。取 CTFPS 水溶液 20 mL，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的 TCA溶液將其 pH 值調(diào)至 3.0，于4 ℃ 下放置 12 h，抽濾除去沉淀后凍干得到脫蛋白銀耳多糖。

（4） GDL法[16]。取 CTFPS 水溶液 20 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為2%的 GDL 溶液，使 GDL 的最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到 0.5%，45 ℃ 水浴鍋中反應(yīng) 2 h 后，在 8 000 r/min 下離心 5 min，除去沉淀后凍干得到脫蛋白銀耳多糖。

（5） 聚酰胺法[17]。選用 60～100 目的聚酰胺粉，使用前進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理過程為：先用乙醇浸泡 6 h，抽濾后洗至無醇味，用 1 mol/L 的 HCl 溶液浸泡 2 h，抽濾后用 1 mol/L 的 NaOH 溶液浸泡 2 h，抽濾后用蒸餾水洗至 pH 中性，60 ℃ 烘箱中烘干備用。取 CTFPS 水溶液 20 mL，加入已處理好的聚酰胺 2 g，30 ℃ 水浴鍋中靜態(tài)吸附 3 h，抽濾后凍干得到脫蛋白銀耳多糖。

1.4 性能測(cè)定與結(jié)構(gòu)表征

1.4.1 不同工藝的脫蛋白效果分析

不同工藝的脫蛋白效果通過多糖損失率和蛋白質(zhì)脫除率來評(píng)價(jià)。

（1） 多糖損失率的測(cè)定：銀耳多糖的總糖含量按照苯酚-硫酸法進(jìn)行測(cè)試[18]。以無水葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線為： Y=9.495 2X+ 0.009 9，R2 = 0.992，適用范圍為 0～0.1 mg/mL。按照式 （1） 計(jì)算多糖損失率：

式中：W1 為多糖損失率（%）；ρ1 為脫蛋白前溶液中的多糖含量；ρ2 為脫蛋白后溶液中的多糖含量。

（2） 蛋白質(zhì)脫除率的測(cè)定：銀耳多糖的蛋白質(zhì)含量按照考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)試[19]。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y = 0.514 6X + 0.012 8，R2 = 0.997，適用范圍為0.1～0.9 mg/mL。按照式（2）計(jì)算蛋白脫除率：

式中：W2 "為蛋白質(zhì)脫除率 （%）；ρ3 為脫蛋白前溶液中的蛋白質(zhì)含量；ρ4 為脫蛋白后溶液中的蛋白質(zhì)含量。

1.4.2 樣品的結(jié)構(gòu)表征

（1） FT-IR 測(cè)試[20]：取5 mg 多糖樣品，用100 mg KBr 壓片，使用紅外光譜儀通過紅外檢查 CTFPS 和 TFPS 的官能團(tuán)，波長(zhǎng)范圍為4 000～600 cm-1。

（2） SEM 測(cè)試[21]：使用導(dǎo)電膠將 CTFPS 和 TFPS 連接到樣品臺(tái)上，然后噴涂薄金層。將噴金樣品置于SEM 中，在100 倍放大倍數(shù)下觀察2個(gè)多糖樣品的形態(tài)。

1.4.3 體外抗氧化性測(cè)定

將CTFPS 和 TFPS 樣品分別配制為2 mg/mL 的溶液，并稀釋為 0.1、0.2、0.5、1.0、1.5 mg/mL 的樣品待測(cè)液。

（1） 還原力：參考文獻(xiàn)[22]，取不同濃度的樣品待測(cè)液1 mL，分別加入0.2 mol/L pH值為6.6 的磷酸鹽緩沖液2.5 mL 及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混勻；于50 ℃ 水浴鍋中反應(yīng)20 min 后，加入2.5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% 的TCA 溶液，于 4 000 r/min 離心10 min；取上清液2.5 mL，加入2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% 的FeCl3 溶液混勻，靜置10 min；于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度 Ax，以蒸餾水代替 FeCl3 溶液作為空白調(diào)零 A0。通過式 （3） 計(jì)算還原力 A1，該值越高說明樣品的還原性越高：

A1 = Ax - A0（3）

（2） DPPH 自由基清除能力：參考文獻(xiàn)[23]，取不同濃度的樣品待測(cè)液3 mL，加入1 mL DPPH（0.1 mmol/mL）的無水乙醇溶液充分混勻震蕩，室溫下避光反應(yīng)1 h，取上清液于517 nm 處測(cè)定吸光度，記為 As；用等體積的無水乙醇代替樣品待測(cè)液測(cè)定吸光度，記為 Ab；用等體積的無水乙醇代替 DPPH 溶液測(cè)定吸光度，記為 Ac。通過式 （4） 計(jì)算DPPH清除活性 A2：

（3） 羥基自由基清除能力：參考文獻(xiàn)[24]，取不同濃度的樣品待測(cè)液1 mL，分別加入1 mL的9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液、9 mmol/L FeSO4 溶液、8.8 mmol/L H2O2 溶液混勻，在37 ℃ 下水浴鍋中反應(yīng) 1 h，冷卻至室溫后于510 nm 處測(cè)定吸光度 Ai；用蒸餾水代替多糖溶液，在相同條件下測(cè)定空白對(duì)照組吸光度 Ad；測(cè)本底吸光度 Aj。通過式（5）計(jì)算羥基自由基清除活性 A3：

1.4.4 吸濕保濕性能測(cè)定

以 CTFPS、TFPS 和丙三醇為樣品，比較3組樣品的吸濕保濕性能。

（1） 吸濕性能測(cè)定[25]：將飽和碳酸鈉溶液、硫酸銨溶液分別置于2個(gè)干燥器中，在室溫下預(yù)飽和 12 h ，形成相對(duì)濕度分別為43% 和81% 的環(huán)境。準(zhǔn)確稱取5種樣品各0.1 g 于培養(yǎng)皿中，放置在干燥器中，于1、3、6、12、24、36、48 h取出稱其質(zhì)量，通過式（6） 計(jì)算吸濕率M1：

式中：ma 為特定時(shí)間總質(zhì)量（g）；mb 為初始總質(zhì)量 （g）；mc 為樣品初始質(zhì)量（g）。

（2） 保濕性能測(cè)定[5]：將干燥變色硅膠于室溫下放置在干燥器中預(yù)干燥12 h，形成相對(duì)濕度為0 的環(huán)境。準(zhǔn)確稱取5種樣品各0.1 g 于培養(yǎng)皿中，并分別加入0.5 g 水，之后將培養(yǎng)皿放置在干燥器中，于1、3、6、12、24、36、48 "h取出稱其質(zhì)量，通過式（7） 計(jì)算保濕率M2：

2 結(jié)果與分析

2.1 CTFPS 脫蛋白方法比較

選用不同方法對(duì)銀耳粗多糖進(jìn)行蛋白脫除，經(jīng)過不同脫蛋白工藝得到的蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率如圖1所示。

由圖1可以看出：TCA 法的蛋白質(zhì)脫除效果最好，多糖的損失也最高，AB-8 吸附法對(duì)蛋白質(zhì)脫除效果次之。按照蛋白質(zhì)脫除效果對(duì)脫蛋白方法進(jìn)行排序： TCA 法 gt; AB-8 吸附法 gt; GDL 法 gt;酶法 gt; 聚酰胺法，蛋白質(zhì)脫除率分別為：87.85%、71.9%、58.88%、52.07%、42%。按照多糖損失率大小對(duì)脫蛋白方法進(jìn)行排序：TCA 法gt; GDL 法gt;聚酰胺法gt;酶法gt; AB-8 吸附法。多糖損失率分別為：58.85%、54.56%、50%、36.73%、19.3%。綜上所述，雖然AB-8 吸附法對(duì)蛋白質(zhì)脫除效果比TCA法稍差，但是此方法多糖損失最少。綜合來看，AB-8 吸附法對(duì) CTFPS 脫蛋白效果最好，操作簡(jiǎn)單，且 AB-8 大孔吸附樹脂再生處理簡(jiǎn)便，使用周期長(zhǎng)，適合在工業(yè)生產(chǎn)中使用。

2.2 AB-8吸附法脫蛋白工藝優(yōu)化

2.2.1 CTFPS 水溶液質(zhì)量濃度的影響

選取CTFPS 水溶液質(zhì)量濃度分別為 1、2、5、10 mg/mL，在固定 AB-8 大孔樹脂用量100 mg/mL、吸附溫度 30 ℃、吸附時(shí)間為 3 h 的條件下，考察 AB-8 吸附法的脫蛋白效果，結(jié)果如圖 2 所示。

由圖 2 可以看出，隨著CTFPS 水溶液濃度的升高，蛋白質(zhì)脫除率的趨勢(shì)呈現(xiàn)先上升后下降，而多糖損失率隨著濃度的升高而降低。在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到最高值72.97%，多糖損失率為15.42%。在CTFPS 水溶液為低濃度時(shí)，大孔樹脂對(duì)多糖和蛋白質(zhì)都有較強(qiáng)的吸附能力，這是由于濃度較低時(shí)多糖分子和蛋白質(zhì)分子有較多的機(jī)會(huì)在大孔樹脂內(nèi)部接觸。而CTFPS 水溶液質(zhì)量濃度大于5 mg/mL 時(shí)，多糖和蛋白質(zhì)的濃度均升高，二者的分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)受到限制，大孔樹脂對(duì)二者的吸附能力也降低。故 CTFPS 水溶液最佳質(zhì)量濃度為5 mg/mL。

2.2.2 AB-8 大孔樹脂用量的影響

選取AB-8 大孔樹脂用量分別為50、100、150、200、250 mg/mL，在固定CTFPS 水溶液質(zhì)量濃度為5 mg/mL、吸附溫度為30 ℃、吸附時(shí)間為 3 h 的條件下，考察 AB-8 吸附法的脫蛋白效果，結(jié)果如圖 3 所示。

由圖3可以明顯看出，隨著 AB-8 大孔樹脂用量的增加，蛋白質(zhì)脫除率先上升后平緩，而多糖損失率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在AB-8 大孔樹脂用量達(dá)到100 mg/mL時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到最大值80.26%，多糖損失率為14.79%。這可能是由于在AB-8 大孔樹脂用量達(dá)到100 mg/mL 時(shí)，樹脂的吸附與解析達(dá)到平衡，隨著大孔樹脂用量的增加，多糖分子和蛋白質(zhì)分子有較多的機(jī)會(huì)在大孔樹脂內(nèi)部接觸，大孔樹脂對(duì)多糖的吸附能力增加，多糖的損失率增大，而蛋白質(zhì)脫除率反而減小。故AB-8 大孔樹脂最佳用量為100 mg/mL。

2.2.3 吸附時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)吸附效果的影響

選取吸附時(shí)間分別為2、3、4、5、6 h，在固定CTFPS 水溶液質(zhì)量濃度5 mg/mL、AB-8 大孔樹脂用量100 mg/mL、吸附溫度20 ℃ 的條件下，考察AB-8 吸附法的脫蛋白效果，結(jié)果如圖 4 所示。

由圖4 可以看出，隨著吸附時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)脫除率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，而多糖損失率的變化較為平緩。吸附時(shí)間達(dá)到5 h 時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到最高值82.47%，多糖損失率為18.24%。隨著吸附時(shí)間的增加，多糖分子和蛋白質(zhì)分子有較多的機(jī)會(huì)在大孔樹脂內(nèi)部接觸，在吸附時(shí)間為5 h 時(shí)，吸附與解析達(dá)到平衡，在吸附時(shí)間大于5 h 時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率不再增加。故最佳吸附時(shí)間為5 h。

2.2.4 反應(yīng)溫度對(duì)蛋白質(zhì)吸附效果的影響

選取吸附溫度分別為20、30、40、50 ℃，在固定 CTFPS 水溶液質(zhì)量濃度5 mg/mL、 AB-8 大孔樹脂用量100 mg/mL、吸附時(shí)間為2 h 的條件下，考察AB-8 吸附法的脫蛋白效果 ，結(jié)果如圖5 所示。

由圖5可以明顯看出，隨著反應(yīng)溫度的升高，蛋白質(zhì)脫除率呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，而多糖損失率隨反應(yīng)溫度的升高先緩慢升高再下降。在反應(yīng)溫度20 ℃ 時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率為72.49%，多糖損失率為20.8%。這可能是由于升高溫度，多糖分子的擴(kuò)散增加，大孔樹脂對(duì)多糖的吸附能力增加，多糖的損失率增大，蛋白質(zhì)脫除率反而減小。故最佳反應(yīng)溫度為20 ℃。

2.3 結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 FTIR分析

由于銀耳多糖中的官能團(tuán)具有高度的紅外吸收特性，本文對(duì)CTFPS 和 TFPS 分別進(jìn)行了紅外吸收表征，如圖6 所示。

由圖6可知，波數(shù)3 284 cm-1 附近的寬峰是由糖分子中的O—H 拉伸振動(dòng)引起的，表明多糖中存在分子間或分子內(nèi)氫鍵[26]；波數(shù)2 974 和2 901 cm-1 處的特征峰代表甲基或亞甲基的C—H 伸縮振動(dòng)[27]；波數(shù) 1 398 cm-1 處的特征峰顯示羧基的C—H 伸縮振動(dòng)和 C—H 的可變角度振動(dòng)。通過與張力凡[9]和張黎君[28]的研究結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，由波數(shù)3 284、2 974、1 398 cm-1 處附近的特征峰可判斷出CTFPS和TFPS均為多糖類物質(zhì)。此外，波數(shù)1 596 和1 719 cm-1 附近的特征峰為COO—的CO 不對(duì)稱拉伸振動(dòng)和對(duì)稱拉伸振動(dòng)，表明多糖中存在糖醛酸。而波數(shù)1 237 cm-1 處的特征峰表明SO 的收縮振動(dòng)，表明多糖含有硫酸根[29]。1 039 cm-1 處的吸收峰對(duì)應(yīng)于由吡喃糖環(huán)的C—O—H 和C—O—C 形成的拉伸振動(dòng)的吸收峰。947和844 cm-1 之間的吸收峰可能代表2個(gè)多糖中存在 β-糖苷鍵[30]；800 cm-1 附近的吸收峰證明了α-D-甘露糖的存在[31]。因此，CTFPS 和 TFPS 均具有 α 型和β 型糖苷鍵。

2.3.2 SEM 分析

通過 SEM 研究了 CTFPS 和 TFPS 的微觀結(jié)構(gòu)，如圖7所示。

由圖 7 可以看出， CTFPS 和TFPS 呈現(xiàn)為片狀堆積的無定形固體，表面有許多不規(guī)則排列的孔洞，結(jié)構(gòu)較為疏松。

2.4 抗氧化性能分析

2.4.1 還原能力

銀耳多糖可以將 K3[Fe（CN）6]中的 Fe3+ 還原為 K4Fe（CN）6 中的 Fe2+，并且 K4Fe（CN）6 進(jìn)一步與 FeCl3 反應(yīng)形成 Fe4[Fe（CN）6]3，該物質(zhì)在 700 nm 處具有最大吸光度[32]。因此，對(duì)于 TFPS-Fe3+反應(yīng)溶液，通常在 700 nm 處測(cè)量吸光度。吸光度越高，說明銀耳多糖的還原能力越強(qiáng)。脫蛋白前后銀耳多糖的還原力結(jié)果如圖 8 所示。

由圖8可以看出，CTFPS 和TFPS 均有明顯的還原力，在一定濃度范圍內(nèi)還原力與多糖濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系，還原力隨著濃度的升高而增大，且脫蛋白后的 TFPS 的還原能力明顯強(qiáng)于未脫蛋白的CTFPS。

2.4.2 DPPH 自由基清除

無水乙醇溶液的最大吸收波長(zhǎng)為517 nm，多糖可以清除DPPH·并降低DPPH·的吸光度，由此評(píng)估銀耳多糖對(duì)DPPH·自由基的清除率[33]。脫蛋白前后的銀耳多糖對(duì)DPPH·自由基的清除能力結(jié)果如圖9 所示。

由圖9可知，CTFPS和TFPS均有明顯的DPPH 自由基清除能力，其DPPH·清除能力隨著多糖濃度的增加而增加，且脫蛋白后TFPS的DPPH·清除能力明顯強(qiáng)于未脫蛋白的CTFPS。在0.1～2 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，TFPS和CTFPS的DPPH·清除能力均在1.5 mg/mL達(dá)到最高值，DPPH·清除率分別為75.54% 和37.99%。

2.4.3 羥基自由基清除能力

H2O2 和 Fe2+ 產(chǎn)生羥基自由基，可以與水楊酸反應(yīng)生成2，3-二羥基苯甲酸和2，5-二羥基苯酸，形成的2種酸在510 nm 處具有最大吸收波長(zhǎng)。當(dāng)多糖清除羥基自由基時(shí)，510 nm 處的吸光度應(yīng)降低，由此可以評(píng)估銀耳多糖的羥基自由基清除能力[34]。脫蛋白前后銀耳多糖的羥基自由基清除能力如圖10 所示。

由圖10可以看出，CTFPS 和 TFPS 均有明顯的羥基自由基清除能力，其羥基自由基清除能力隨著多糖濃度的增加而增加。質(zhì)量濃度在0.5 mg/mL 時(shí)，CTFPS和TFPS的羥基自由基清除率相同；隨著濃度的增加，TFPS的羥基自由基清除能力逐漸強(qiáng)于CTFPS。在 0.1～2 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，CTFPS和TFPS 的羥基自由基清除能力均在2 mg/mL 達(dá)到最高值，羥基自由基清除率分別為44.72% 和41.78%。

2.5 吸濕保濕性能分析

2.5.1 吸濕性能

對(duì)CTFPS和TFPS的吸濕性能進(jìn)行測(cè)定，并與丙三醇進(jìn)行比較，結(jié)果如圖11 和圖12 所示。

由圖11和圖12可以看出，在相對(duì)濕度 43% 和81% 的環(huán)境下，3個(gè)樣品的吸濕率在最初的 24 h 內(nèi)顯著增加，且在 24 h 左右吸濕效果幾乎達(dá)到飽和。丙三醇的吸濕效果最好，TFPS 的吸濕效果次之，CTFPS 的最差。同時(shí)，在相對(duì)濕度81% 的環(huán)境下吸濕率高于相對(duì)濕度43%。在相對(duì)濕度81% 的環(huán)境下，3個(gè)樣品的吸濕率大小順序?yàn)楸迹?TFPS gt; CTFPS，吸濕時(shí)間為 48 h 時(shí)，吸濕率分別為170%、40% 和30%。

2.5.2 保濕性能

丙三醇、CTFPS 和 TFPS 的保濕效果如圖 13 所示。

由圖13可以看出，在相對(duì)濕度為0的環(huán)境下，3個(gè)樣品的水分含量快速降低，隨著時(shí)間的增加，其保濕效果不斷減小。在 3 h 內(nèi)，丙三醇的保濕率高于其它2個(gè)樣品，在 3 h 后，TFPS 的保濕效果優(yōu)于丙三醇，且 CTFPS 的保濕效果與丙三醇相差甚微，說明 CTFPS 和 TFPS 都具有顯著的保濕效果。在 48 h 時(shí)，3個(gè)樣品的保濕效果為 CTFPS gt; TFPS gt;丙三醇，其保濕率分別為8.11%、5.41% 和 4.17%。

3 結(jié) 論

為了得到更高純度的銀耳多糖，對(duì) CTFPS 進(jìn)行純化處理。研究結(jié)果表明：

（1） 以多糖損失率和蛋白質(zhì)脫除率為依據(jù)，對(duì)比 AB-8 吸附法、酶法、TCA 法、GDL 法和聚酰胺法對(duì) CTFPS 的脫蛋白效果發(fā)現(xiàn)，AB-8 吸附法的脫蛋白效果最佳。

（2） 通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝條件，得出最優(yōu)工藝條件為： CTFPS 水溶液質(zhì)量濃度 5 mg/mL，AB-8大孔樹脂用量 100 mg/mL，吸附時(shí)間 5 h，吸附溫度 20 ℃。在最優(yōu)條件下，蛋白質(zhì)脫除率為 82.47%，多糖損失率為 18.24%。

（3） 比較脫蛋白后的TFPS與CTFPS的紅外特征峰和SEM譜圖發(fā)現(xiàn)，脫蛋白工藝不會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)。

（4） TFPS的抗氧化活性和吸濕保濕性能強(qiáng)于 CTFPS。而且，AB-8大孔吸附樹脂再生簡(jiǎn)便，使用周期長(zhǎng)，操作簡(jiǎn)單，更適用于銀耳多糖的工業(yè)化生產(chǎn)。

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本文引文格式：

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