鋅指蛋白281抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞上皮間質轉化和細胞外基質合成

侯維玲 喬云陽 吳小蕓 施會敏 曲高婷 張愛青

基金項目：江蘇省醫學會兒科醫學科研專項基金項目（SYH-32034-0073）；南京市衛生科技發展專項資金項目（YKK23209）

作者單位：1南京醫科大學附屬江寧醫院兒科（郵編211100）；2南京醫科大學第二附屬醫院兒科；3南京醫科大學第四附屬醫院兒科

作者簡介：侯維玲（1983），女，碩士在讀，主要從事兒科學方面研究。E-mail：13770698345@163.com

△通信作者 E-mail：njaiqing@njmu.edu.cn

摘要：目的 探討鋅指蛋白281（ZNF281）在高糖（HG）誘導的腎小管上皮細胞（RTECs）上皮間質轉化（EMT）和細胞外基質（ECM）合成中的作用及機制。方法 使用HG誘導RTECs以構建糖尿病腎病模型，分為Control組、HG組和Mannitol組，使用CCK-8檢測細胞增殖活力。使用小干擾RNA（siRNA）在HG誘導的RTECs中敲低ZNF281的表達水平，分為Control組、HG組、HG+ZNF281 siRNA組和HG+ZNF281 vector組。使用腺苷單磷酸活化蛋白激酶（AMPK）激動劑阿卡地新（AICAR）活化AMPK，分為Control組、HG組、HG+AICAR組和HG+二甲基亞砜組。實時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測ZNF281、EMT和ECM合成相關指標表達水平。結果 與Control組相比，HG組ZNF281、波形蛋白（vimentin）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、纖維連接蛋白（FN）和Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）的蛋白和mRNA表達水平升高，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達水平降低；與HG組相比，HG+ZNF281 siRNA組和HG+AICAR組的EMT和ECM合成相關指標的蛋白和mRNA表達水平發生明顯變化，同時HG+AICAR組ZNF281的蛋白和mRNA表達水平較HG組降低；在使用AICAR和轉染ZNF281過表達質粒共處理的細胞中，AICAR+ZNF281組vimentin、α-SMA、FN、ColⅠ的表達水平較空載組升高，E-cadherin表達水平降低。結論 AMPK通過負向調控ZNF281的表達水平進而抑制HG誘導的RTECs中EMT和ECM合成。

關鍵詞：糖尿病腎??；Tristetraprolin蛋白；上皮-間質轉化；細胞外基質；AMP活化蛋白激酶類；腎小管間質纖維化；鋅指蛋白281

中圖分類號：R587.24，R34文獻標志碼：ADOI：10.11958/20240031

Zinc finger protein 281 inhibits high glucose-induced epithelial-mesenchymal transition and extracellular matrix synthesis in renal tubular epithelial cells

HOU Weiling1， QIAO Yunyang2， WU Xiaoyun2， SHI Huimin2， QU Gaoting2， ZHANG Aiqing3△

1 Department of Pediatrics， the Affiliated Jiangning Hospital of Nanjing Medical University， Nanjing 211100， China;

2 Department of Pediatrics， the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University; 3 Department of Pediatrics，

the Fourth Affiliated Hospital of Nanjing Medical University

△Corresponding Author E-mail： njaiqing@njmu.edu.cn

Abstract： Objective To investigate the role and mechanism of zinc finger protein 281 （ZNF281） in high glucose （HG）-induced epithelial-mesenchymal transition （EMT） and extracellular matrix （ECM） synthesis in renal tubular epithelial cells （RTECs）. Methods HG induced RTECs were used to construct a diabetic kidney disease cell model， and cells were divided into the control group， the HG group and the mannitol group. Cell proliferation viability was detected by CCK-8. The expression of ZNF281 was knocked down in HG-treated RTECs using small interfering RNA （siRNA）. HG-induced RTECs after knockdown of ZNF281 were divided into the control group， the HG group， the HG+ZNF281 siRNA group and the HG+ZNF281 vector group. Adenosine monophosphate-activated protein kinase （AMPK） was activated using AMPK agonist， acadexin （AICAR）， and then cells were divided into the control group， the HG group， the HG+AICAR group and the HG+dimethyl sulfoxide group. The expression levels of ZNF281， EMT and ECM synthesis-related indexes were detected by qPCR and Western blot assay. Results Compared with the control group， the protein and mRNA expression levels of vimentin， α-smooth muscle actin （α-SMA）， fibronectin （FN） and collagen Ⅰ （Col Ⅰ） were significantly higher， and the expression of E-cadherin was significantly lower in the HG group. Compared with the HG group， the protein and mRNA expression levels of EMT and ECM synthesis-related indexes were significantly changed in the HG+ZNF281 siRNA group and the HG+AICAR group. The protein and mRNA expression levels of ZNF281 were significantly reduced in the HG+AICAR group compared with the HG group. In cells co-treated with AICAR and transfected with ZNF281 plasmid， the expression levels of vimentin， α-SMA， FN and Col Ⅰ were significantly higher in the AICAR+ZNF281 group， and E-cadherin was significantly lower compared with that of the vector group. Conclusion AMPK inhibits EMT and ECM synthesis in HG-treated RTECs by negatively regulating the expression level of ZNF281.

Key words： diabetic nephropathies; tristetraprolin; epithelial-mesenchymal transition; extracellular matrix; AMP-activated protein kinases; tubulointerstitial fibrosis; zinc finger protein 281

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最常見的并發癥之一，以大量蛋白尿和腎小球濾過率降低為特征，是終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD）的主要原因之一，已經成為全球性的公共衛生問題［1-2］。腎臟纖維化是公認的DKD的病理路徑，也是進展至ESRD的必經階段，其病理基礎包括細胞外基質（extracellular matrix，ECM）合成增多并沉積［3］。腎小管上皮細胞（renal tubular epithelial cells，RTECs）作為腎臟纖維化主要的效應細胞之一，在DKD發病早期可異?；罨驮鲋?，促進腎小管間質纖維化（tubular interstitial fibrosis，TIF）及ECM合成，是DKD病理改變的關鍵環節［4］，而上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是TIF發生和發展的重要機制［5］，確定DKD的發病機制并找尋新的治療靶點是目前亟待解決的問題［6］。EMT和ECM合成相關蛋白包括E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、纖維連接蛋白（fibronectin，FN）和Ⅰ型膠原蛋白（collagenⅠ，ColⅠ）。鋅指蛋白（zinc finger protein，ZNF）是一類轉錄因子，能與多種基因啟動子中的GC區域結合，在基因調控中發揮關鍵作用［7-8］。ZNF是組織發育的關鍵調控因子，在腫瘤相關疾病中更多是以高水平表達［9-10］。ZNF281可能與EMT相關，在炎癥性腸病中沉默ZNF281可明顯減少炎性因子釋放，降低纖維化相關基因的表達水平，并緩解由炎癥引起的組織細胞形態變化［11］。生物信息學分析發現，在糖尿病和DKD患者血清測序表達譜中腺苷單磷酸活化蛋白激酶（AMPK）明顯富集［12］，通過激活AMPK可以保護細胞免受炎癥、凋亡、各類應激及EMT的影響［13］。AMPK可進一步磷酸化多種下游轉錄因子，參與調控糖代謝、脂代謝及細胞增殖等過程［14-15］。本研究從AMPK出發，通過高糖（high glucose，HG）誘導RTECs建立DKD細胞模型，探討ZNF281在DKD中的調控機制，為DKD的臨床診治提供新策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 小鼠RTECs由東南大學附屬中大醫院腎臟病中心饋贈。

1.1.2 主要試劑和儀器 細胞培養所用培養基、胰酶、胎牛血清和磷酸鹽緩沖液均購自美國Gibco公司；AMPK激動劑阿卡地新（AICAR）購自MCE；細胞總蛋白提取及樣本制備所需的裂解液和蛋白上樣緩沖液購自上海碧云天生物技術有限公司；蛋白免疫印跡法（Western blot）所使用的凝膠、電泳緩沖液、快速轉膜液及電泳設備均購自賽維爾生物科技有限公司，凝膠成像儀購自Bio-Rad公司，聚偏氟乙烯（PVDF）膜購自美國密理博公司，ZNF281抗體購自武漢bioswamp公司，FN、ColⅠ、AMPK及磷酸化AMPK（p-AMPK）抗體購自英國Abcam公司，E-cadherin、vimentin、α-SMA、GAPDH抗體以及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗均購自Affinity公司；TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司，逆轉錄實時熒光定量PCR（qPCR）相關試劑盒、CCK-8細胞增殖檢測試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，PCR儀為Roche LightCycler 480；ZNF281小干擾RNA（siRNA）及相應的空載對照（vector）由廣州銳博生物技術有限公司構建，同時配合使用該公司提供的細胞轉染試劑盒；ZNF281過表達質粒由南京科瑞斯生物科技有限公司構建。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8檢測細胞增殖 為篩選構建DKD細胞模型的最適干預方案，使用5.5、30、50、80 mmol/L葡萄糖干預細胞并設置12、24、36、48 h 4個時間點。取對數生長期的RTECs并接種于96孔板中，預留空白對照孔，每孔的終體積為100 μL，當干預達到實驗需要后每孔加入10 μL CCK-8溶液并置于細胞培養箱中孵育4 h，使用酶標儀測定各孔450 nm處光密度（OD450）值，檢測細胞增殖情況。

1.2.2 細胞處理及分組 RTECs培養于37 ℃、含5%CO2的細胞培養箱中，在細胞密度達到80%時接種于6孔板或12孔板中，并在適當時間依實驗需要處理細胞。對于DKD細胞模型的建立，將細胞分為3組：（1）對照（Control）組。使用低濃度（5.5 mmol/L）葡萄糖培養基培養。（2）HG組。使用葡萄糖配置HG培養基（30 mmol/L）干預細胞作為DKD模型。（3）甘露醇（Mannitol）組。使用5.5 mmol/L葡萄糖和24.5 mmol/L甘露醇配置與HG組相同滲透壓的培養基，以排除HG的高滲透壓對細胞的影響。ZNF281的轉染實驗中將RTECs分為以下4組：（1）Control組為5.5 mmol/L葡萄糖培養細胞。（2）HG組為30 mmol/L葡萄糖培養細胞。（3）HG+ZNF281 siRNA組為在HG誘導的RTECs中轉染ZNF281 siRNA。（4）HG+ZNF281 vector組為在HG誘導的RTECs中轉染ZNF281 siRNA相應的陰性對照。AICAR對細胞的處理實驗中將RTECs分為以下4組：（1）Control組為5.5 mmol/L葡萄糖培養。（2）HG組為30 mmol/L葡萄糖培養細胞。（3）HG+AICAR組使用AICAR處理HG干預的RTECs。（4）HG+二甲基亞砜（DMSO）組在HG誘導的細胞中加入與配置AICAR所需的DMSO相應濃度和劑量以排除AICAR配置液對細胞的影響。對于AICAR和轉染ZNF281過表達質粒共處理實驗中將RTECs分為2組：（1）AICAR+ZNF281 vector組為使用AICAR處理細胞并共轉染ZNF281過表達質粒的相應空載。（2）AICAR+ZNF281組為使用AICAR處理細胞并轉染ZNF281過表達質粒。在干預24 h后收集細胞并用于后續實驗。

1.2.3 細胞轉染 在6孔板或12孔板中，當細胞生長的密度達到約70%時進行細胞轉染，使用銳博生物提供的細胞轉染試劑盒并依據說明書進行操作。使用緩沖液及siRNA、陰性參照或質粒配制終濃度為20 nmol/L的轉染混合物，期間需輕柔震蕩并混勻，室溫孵育15 min后，依據實驗分組進行轉染，通過qPCR和Western blot驗證轉染效率。用于轉染的ZNF281 siRNA的序列：5′-GTACTCTGGCAAATCAGAA-3′，其陰性參照序列為廣州銳博生物技術有限公司專利。

1.2.4 qPCR檢測ZNF281、EMT和ECM合成相關基因表達水平 使用TRIzol裂解細胞并提取總RNA，測定RNA濃度后，依據逆轉錄檢測試劑盒說明書將總RNA定量并逆轉錄為cDNA，使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒進行后續的擴增，以β-actin作為內參。PCR反應程序為：95 ℃ 30 s預變性；95 ℃ 10 s，69 ℃ 30 s，循環40次。95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s以構建熔解曲線。采用2-ΔΔCt法計算各組細胞目的基因的相對表達水平。引物均由上海捷瑞生物工程有限公司構建并進行了驗證，引物序列見表1。[Tab.1 Primer sequences for qPCR

1.2.5 Western blot檢測ZNF281、AMPK、EMT和ECM相關蛋白表達 細胞總蛋白的提取全程于冰上進行，使用加入蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解細胞，刮下細胞并收集細胞懸浮液，隨后在4 ℃下以12 500×g高速離心20 min，收集上清液，測定蛋白濃度。制備好蛋白樣品并保存于-80 ℃冰箱內或加載至預制好的凝膠中，調節電壓為160 V進行電泳分離蛋白，約40 min后，使用快速免冰浴轉膜液將凝膠上的蛋白在300 mA恒定電流下轉移到PVDF膜上，使用脫脂奶粉配置封閉液并在室溫下封閉1 h，封閉結束后洗膜并加入配置好的一抗（配置比例均為1∶1 000），在4 ℃冰箱中孵育過夜。次日，復溫并洗膜后加入相應二抗（配置比例為1∶10 000），于室溫下孵育1 h，再次洗膜，加入增強型化學發光液并置于Bio-Rad凝膠成像儀下，使用Image Lab 4.0曝光并記錄蛋白條帶。使用ImageJ 1.53t分析蛋白條帶的灰度值，以GAPDH作為內參，將對照組歸一化后計算目的蛋白的相對表達量，每組實驗重復至少3次并合并分析蛋白表達量。

1.3 統計學方法 使用GraphPad Prism 9.3軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（[x] ±s）表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較采用Sidak法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ZNF281在HG誘導的RTECs中高表達 CCK-8結果顯示，當葡萄糖濃度為30 mmol/L時，干預24 h的RTECs增殖活力高于其他干預方案，見圖1。HG組RTECs中ZNF281、vimentin、α-SMA、FN、ColⅠ的mRNA和蛋白表達量較Control組升高，E-cadherin表達水平降低（均P＜0.05），Mannitol組相關指標表達水平較Control組無明顯變化，見圖2、表2。

2.2 敲低ZNF281可抑制HG誘導RTECs的EMT和ECM合成 與HG組相比，HG+ZNF281 siRNA組細胞中ZNF281表達水平降低，vimentin、α-SMA、FN、ColⅠ的mRNA和蛋白表達水平降低，E-cadherin表達水平升高（均P＜0.05），HG+ZNF281 vector組相關指標表達水平與HG組比較均無統計學意義，見圖3、表3。CCK-8結果顯示，Control組、HG組、HG+ZNF281 siRNA組、HG+ZNF281 vector組OD450分別為0.64±0.06、1.78±0.03、1.37±0.07、1.85±0.09（F=269.400，P＜0.01），與HG組比較，HG+ZNF281 siRNA組細胞增殖活力降低（P＜0.05）。

2.3 激活AMPK可抑制HG誘導RTECs的EMT和ECM合成 Control組、HG組、Mannitol組p-AMPK/AMPK蛋白表達水平分別為1.00±0.05、0.66±0.13、1.02±0.14（F=9.025，P＜0.05）；與Control組比較，HG組p-AMPK/AMPK明顯下調（P＜0.05），AMPK失活，見圖4。進一步在HG誘導的RTECs中使用AMPK激動劑AICAR干預細胞，CCK-8結果顯示，Control組、HG組、HG+AICAR組、HG+DMSO組細胞OD450分別為0.57±0.04、1.64±0.08、1.22±0.12、1.66±0.19，其差異有統計學意義（F=71.470，P＜0.05）；與HG組相比，HG+AICAR組細胞增殖活力明顯降低（P＜0.05）；與HG組相比，HG+AICAR組p-AMPK/AMPK蛋白表達水平升高（P＜0.05），AMPK活化；與HG組相比，HG+AICAR組vimentin、α-SMA、FN、ColⅠ的mRNA和蛋白表達水平降低（P＜0.05），E-cadherin表達水平升高（P＜0.05），HG+DMSO組相關指標較HG組差異無統計學意義，見表4、圖5。

2.4 AMPK通過調控ZNF281抑制HG誘導RTECs的EMT和ECM合成 HG+AICAR組ZNF281的mRNA和蛋白表達水平較HG組降低（P＜0.05），見圖6、表4。進一步在AICAR處理的RTECs中共轉染ZNF281，結果顯示，共處理組ZNF281表達水平較AICAR+ZNF281 vector升高，vimentin、α-SMA、FN、ColⅠ的mRNA和蛋白表達水平升高，E-cadherin表達水平降低（均P＜0.05），見表5、圖7；

CCK-8結果顯示，AICAR+ZNF281 vector細胞OD450為1.34±0.07，而共處理組的OD450為2.19±0.12，細胞增殖活力顯著升高（t=12.050，P＜0.05）。

3 討論

目前DKD在全球糖尿病患者中的發病率逐年上升［2］。TIF是各類慢性腎臟病進展到ESRD的共同階段，早期并有效地減輕炎癥反應，抑制EMT和減少ECM過度沉積，對于改善患者預后具有重要意義。有關ZNF281在腎臟病理中作用的研究報道尚少，其與TIF的發生發展關系不明確，本研究評估并確定了ZNF281在DKD模型中的表達水平及其敲低對DKD的影響，并初步探討了調控機制，結果發現ZNF281表達受AMPK控制，AMPK激活導致ZNF281表達下調，抑制了HG誘導的RTECs中EMT的發生和ECM過度沉積，并與細胞增殖活力降低相關。

ZNF281屬于Krüppel樣鋅指轉錄因子家族，具有轉錄因子活性，因含有指狀結構域得名，廣泛分布于全身多個組織［16］。研究表明其與胚胎干細胞多能性、DNA損傷修復有關［9，17］。在DKD病理基礎中，上皮細胞獲得間充質特征，運動性和侵襲性明顯增強，加速DKD進展。目前為止轉錄因子Snail、Slug等被廣泛認為是EMT調節的核心因子。研究證實原發性結直腸癌樣本中ZNF281的表達明顯上調，其失活可明顯抑制原癌基因誘導的EMT［18］。在小鼠纖維化結腸和經轉化生長因子-β1誘導的人源性結腸成纖維細胞中，ZNF281的表達明顯增加，且與成纖維細胞活化、分化相關途徑的基因表達存在關聯［19］。在炎癥性腸病中，ZNF281的表達與疾病嚴重程度呈正相關，沉默ZNF281可以明顯降低纖維化相關蛋白的表達，并抑制炎癥因子釋放，緩解由炎癥引起的形態學改變［11］；而腎小管間質炎癥是DKD病理改變的關鍵環節［20］，因此筆者推測ZNF281可能是EMT調控網絡的一個重要組成部分，在慢性腎臟病中同樣發揮重要的調節作用，具有成為DKD臨床診治新靶點的潛力。本研究結果顯示ZNF281在HG誘導的RTECs中表達水平明顯上調，進一步探究ZNF281在HG誘導的RTECs中EMT和ECM合成的作用，在HG誘導的RTECs中敲低ZNF281可以明顯抑制EMT和ECM的合成，并與細胞增殖活力的降低密切相關。本研究為ZNF281在腎臟病領域作為EMT相關分子提供了新的證據。

高濃度的葡萄糖具有內在毒性，可引發腎小管間質纖維化和腎小球系膜細胞增殖［21-22］。本研究使用HG誘導RTECs，通過CCK-8檢測細胞增殖，確定糖濃度為30 mmol/L并干預24 h作為DKD細胞模型誘導方案，成功建立了DKD細胞模型。AMPK作為代謝應激中高度保守的能量平衡調節因子，在溶酶體表面感知葡萄糖，并進一步磷酸化下游轉錄因子，參與調控糖代謝、脂代謝及細胞增殖等過程［23］。AICAR是一種腺苷類似物，作為AMPK激動劑可以調節葡萄糖和脂質代謝，保護細胞免受活性氧刺激和EMT的影響，并抑制促炎細胞因子的產生［24］。本研究結果顯示，在HG誘導的RTECs中，AICAR和ZNF281 siRNA的處理對于DKD細胞模型中的EMT和ECM合成存在類似的效應。AMPK可以通過磷酸化下游轉錄因子發揮效應，因此筆者提出假設：AMPK通過調控ZNF281的表達進而抑制EMT和ECM合成。在HG誘導的RTECs中使用AICAR處理后，ZNF281的表達水平明顯下調，確定AMPK對ZNF281的調控關系；在使用ZNF281過表達質粒共處理后，AICAR對DKD細胞模型中EMT和ECM沉積的治療作用發生了逆轉，進一步表明AMPK通過ZNF281調節EMT的發生和ECM合成。

綜上，本研究提供了ZNF281作為腎臟纖維化誘導因子的證據，確定AMPK與ZNF281的相互調控關系，AMPK通過負向調控ZNF281的表達來抑制HG誘導的RTECs中EMT的發生和ECM合成。上述結論加深了對TIF發展機制的理解，并為DKD臨床診治提供了理論依據。然而本研究仍存在一定不足，如ZNF281在DKD動物模型中介導的效應，以及ZNF281的下游作用靶點尚不清楚，期望能夠在后續的研究中有更多的發現。

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（2024-01-04收稿 2024-02-26修回）

（本文編輯 李國琪）