GABA信號通路對膿毒癥大鼠急性肺損傷內質網應激和線粒體自噬的影響

鐘敏 施震 周勁松 李晉杰

基金項目：湖北省衛生健康委2019-2020年度科研立項項目（WJ2019F162）

作者單位：1湖北中醫藥大學第一臨床醫學院（郵編430000）；2湖北省中醫院（光谷院區）疼痛科

作者簡介：鐘敏（1994），女，碩士在讀，主要從事急慢性疼痛的中西醫臨床方面研究。E-mail：isk1ud4x@163.com

△通信作者 E-mail：anbair3359@163.com

摘要：目的 探討γ-氨基丁酸（GABA）信號通路對膿毒癥大鼠急性肺損傷（ALI）內質網應激（ERS）和線粒體自噬的影響。方法 SD大鼠分為CON組、Model組、GABA信號通路激活劑巴氯芬組（巴氯芬組）、GABA信號通路抑制劑荷包牡丹堿（BIC）組（BIC組），每組6只。巴氯芬組腹腔注射5 mg/kg的巴氯芬，BIC組腹腔注射1 mg/kg BIC，每日1次，連續處理2周。CON組、Model組腹腔注射等量生理鹽水。酶聯免疫吸附試驗檢測血清中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平及支氣管肺泡灌洗液（BALF）中細胞色素C（Cyt.C）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）水平；透射電子顯微鏡（TEM）觀察肺組織細胞超微形態；HE染色觀察肺組織病理形態；TUNEL染色觀察肺組織細胞凋亡；Western blot檢測肺組織GABAAR、GRP78、CHOP蛋白表達。結果 與Model組相比，巴氯芬組肺腫脹、充血、炎性細胞浸潤現象改善，肺損傷評分、MDA含量、凋亡指數、Cyt.C和NADPH水平、GRP78和CHOP蛋白水平降低（P＜0.05），吞噬線粒體的自噬性空泡數量、SOD含量、GABAAR蛋白水平增加（P＜0.05），而BIC組以上指標結果與巴氯芬組趨勢相反。結論 活化GABA信號通路可改善膿毒癥大鼠ALI。

關鍵詞：膿毒癥；急性肺損傷；內質網應激；線粒體自噬；γ-氨基丁酸

中圖分類號：R563文獻標志碼：ADOI：10.11958/20231352

Effects of GABA signaling pathway on endoplasmic reticulum stress and mitochondrial autophagy in septic rats with acute lung injury

ZHONG Min1， SHI Zhen2△， ZHOU Jinsong2， LI Jinjie2

1 The First Clinical College of Hubei University of Traditional Chinese Medicine， Wuhan 430000， China;

2 Department of Pain， Hubei Hospital of Traditional Chinese Medicine

△Corresponding Author E-mail： anbair3359@163.com

Abstract： Objective To investigate the effect of γ-aminobutyric acid （GABA） signaling pathway on endoplasmic reticulum （ER） stress and mitochondrial autophagy in septic rats with acute lung injury （ALI）. Methods SD rats were randomly grouped into the control （CON） group， the model group， the GABA signaling pathway activator Baclofen group （the Baclofen group）， the GABA signaling pathway inhibitor dicentrine group （the BIC group）， with 6 rats in each group. The Baclofen group received intraperitoneal injection of 5 mg/kg Baclofen， and the BIC group received intraperitoneal injection of 1 mg/kg BIC， once a day， for two consecutive weeks. The CON group and the model group were injected with an equal amount of physiological saline via intraperitoneal injection. Enzyme linked immunosorbent assay was applied to detect serum levels of superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA） and levels of cytochrome C （Cyt.C） and Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate （NADPH） in bronchoalveolar lavage fluid （BALF）. Transmission electron microscopy （TEM） was applied to observe the ultrastructure of lung tissue cells. HE staining was applied to observe the pathological morphology of lung tissue. TUNEL staining was applied to observe the apoptosis of lung tissue. Western blot assay was applied to detect expression levels of GABAAR， GRP78 and CHOP proteins in lung tissue. Results Compared with the model group， the lung swelling， congestion and inflammatory cell infiltration were improved in the Baclofen group， and the lung injury score， MDA content， apoptosis index， Cyt.C and NADPH levels， GRP78， and CHOP protein levels were reduced （P＜0.05）. The number of autophagic vacuoles in phagocytic mitochondria， SOD content and GABAAR protein level were increased （P＜0.05）， however， the trend of above indicators in the BIC group was opposite to that in the Baclofen group. Conclusion Up-regulation of GABA signaling pathway may have an improvement effect on ALI in sepsis rats.

Key words： sepsis; acute lung injury; endoplasmic reticulum stress; mitophagy; gamma-aminobutyric acid

膿毒癥是一種臨床常見的急性危重疾病，主要表現為持續性低血壓、代謝性酸中毒和全身炎癥反應綜合征，可導致患者多個器官功能損傷甚至死亡［1］。急性肺損傷（ALI）是膿毒癥常見的致死性并發癥［2］。目前，針對膿毒癥誘發ALI的治療方案仍然有限。一些研究顯示，降低膿毒癥誘導的內質網應激（ERS）可以改善肺部炎癥和ALI，同時抑制ERS能夠提高脂多糖（LPS）處理的肺泡上皮細胞活力，并抑制其凋亡［3-4］。因此，ERS可能是膿毒癥及其并發癥臨床治療的新靶點。也有研究顯示，增強線粒體自噬可以減輕膿毒癥誘導的ALI［5］。γ-氨基丁酸（GABA）是哺乳動物中樞神經系統中最重要的抑制性神經遞質，但在呼吸系統中GABA信號通路卻是抵抗外來損傷和炎性反應的興奮性介質，增加GABA A型受體（GABAAR）可降低ALI［6］。目前，鮮見有關GABA信號通路對于膿毒癥大鼠ALI影響的研究。本研究旨在探討GABA信號通路對膿毒癥大鼠ALI后ERS和線粒體自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 7周齡SPF級雄性SD大鼠33只，體質量250～270 g，購自湖北貝恩特生物科技有限公司，生產許可證號：SCXK（鄂）2021－0027。本實驗獲得湖北中醫藥大學第一臨床醫學院動物倫理委員會的批準。GABA信號通路抑制劑荷包牡丹堿（BIC）、GABA信號通路激活劑巴氯芬、兔抗鼠GABAAR抗體、兔抗鼠葡萄糖調節蛋白78（GRP78）抗體、兔抗鼠C/EBP環磷酸腺苷反應元件結合轉錄因子同源蛋白（CHOP）和兔抗鼠GAPDH抗體購自英國Abcam公司；大鼠超氧化物歧化酶（SOD）酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、大鼠丙二醛（MDA）ELISA試劑盒、大鼠細胞色素C（Cyt.C）ELISA試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）ELISA試劑盒購自上海韻泰信息科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 造模及分組 隨機抽取9只大鼠作為CON組，余大鼠參照文獻［7］，通過盲腸結扎和穿刺構建膿毒癥大鼠模型。戊巴比妥鈉麻醉大鼠，剃掉腹部毛發，通過腹部中線切口2 cm暴露盲腸。將盲腸分離并結扎在回盲瓣下方，使用21號針刺穿2次。將糞便擠出穿刺傷口。最后，將盲腸放回腹腔，縫合腹部切口。CON組和造模組各隨機抽取3只大鼠進行HE染色，參照文獻［8］模型評判標準，將剩余造模成功的18只大鼠隨機均分為Model組、巴氯芬組、BIC組。CON組大鼠僅接受剖腹手術和遠端盲腸分離。巴氯芬組腹腔注射5 mg/kg的巴氯芬［9］，每日1次，連續處理2周。BIC組腹腔注射1 mg/kg BIC［10］，CON組和Model組腹腔注射等量生理鹽水，每日1次，連續處理2周。

1.2.2 ELISA法檢測血清中氧化S因子 藥物治療結束后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈采血3 mL，? ? ? ?3 000 r/min離心10 min，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測大鼠血清SOD、MDA水平。

1.2.3 ELISA法檢測大鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中Cyt.C、NADPH水平 藥物治療結束后，收集BALF，并在4 ℃下以? 3 000 r/min離心10 min，按照ELISA試劑盒說明書檢測大鼠BALF中Cyt.C和NADPH水平。處死大鼠，分離肺組織，一部分肺組織透射電子顯微鏡（TEM）觀察及HE染色、TUNEL染色，余肺組織于-80 ℃中凍存。

1.2.4 TEM觀察肺組織細胞超微形態 3%戊二醛固定肺組織后，1%四氧化鋨再固定，丙酮脫水，Epon812包埋，半薄切片定位后制備70 nm超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，每組隨機讀取3個視野，觀察大鼠組織顯微照片。

1.2.5 HE染色觀察肺組織損傷情況 取肺組織，在4%多聚甲醛中浸泡24 h 并用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，制備石蠟切片4 μm并經蘇木精染色5 min，自來水沖洗3 s，1%鹽酸乙醇分化，5%伊紅染色3 min，二甲苯處理后中性樹脂封片，在光鏡下觀察肺組織病理變化。根據水腫、中性粒細胞浸潤、出血、細支氣管上皮脫屑和透明膜形成進行肺損傷評分。肺損傷嚴重程度評分參照文獻［11-12］，評分范圍為0～4分，評分越高損傷越重。

1.2.6 TUNEL染色檢測肺組織細胞凋亡情況 取固定在4%多聚甲醛中的肺組織切片，常規脫蠟、脫水，3%過氧化氫處理切片，蛋白酶K分離，放入濕盒中室溫標記2 h，在37 ℃與1% Tris緩沖鹽溶液（TBS）反應60 min。TUNEL標記后，用二氨基聯苯胺（DAB）作為顯色劑對肺組織進行復染。光學顯微鏡下凋亡細胞染色為深棕色和黃棕色。凋亡指數=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.2.7 Western blot檢測肺組織GABAAR、GRP78、CHOP蛋白表達 收集每組大鼠的肺組織樣品。使用RIPA裂解液從肺組織中提取總蛋白。蛋白質濃度通過BCA方法測定。將蛋白質樣品經8%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉移到硝酸纖維素膜上，分別加入GABAAR、GRP78、CHOP和GAPDH（均1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜，將膜與辣根過氧化物酶標記的IgG二抗（1∶5 000）在室溫孵育2 h。ECL化學發光試劑顯色，Image J軟件分析灰度值。

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料用[x] ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠氧化應激指標水平比較 與CON組比較，Model組大鼠SOD水平降低，MDA水平增加（P＜0.05）；與Model組比較，巴氯芬組SOD水平增加，MDA水平降低（P＜0.05），而BIC組SOD水平降低，MDA水平增加（P＜0.05），見表1。

2.2 各組大鼠BALF中Cyt.C和NADPH水平的比較 與CON組相比，Model組BALF中Cyt.C和NADPH水平增加（P＜0.05）；與Model組相比，巴氯芬組BALF中Cyt.C和NADPH水平降低，而BIC組BALF中Cyt.C和NADPH水平增加（P＜0.05），見表2。

2.3 各組大鼠肺損傷比較 CON組肺組織結構正常；與CON組相比，Model組肺組織炎性細胞浸潤嚴重，有明顯的肺泡充血、肺泡隔增厚、結構損傷和間質性中性粒細胞滲透現象，肺損傷評分增加（P＜0.05），吞噬線粒體的自噬性空泡數量降低；與Model組相比，巴氯芬組肺組織腫脹、充血、炎性細胞浸潤現象改善，肺損傷評分降低（P＜0.05），吞噬線粒體的自噬性空泡數量增加；而BIC組肺損傷加重，肺損傷評分增加（P＜0.05），吞噬線粒體的自噬性空泡數量降低，見圖1、2，表3。

2.4 各組大鼠肺組織細胞凋亡比較 與CON組相比，Model組大鼠細胞凋亡指數增加（P＜0.05）；與Model組相比，巴氯芬組細胞凋亡指數降低，BIC組細胞凋亡指數增加（P＜0.05），見表3、圖3。

2.5 各組大鼠肺組織GABAAR、GRP78、CHOP蛋白水平比較 與CON組相比，Model組GABAAR蛋白水平降低，GRP78、CHOP蛋白水平增加（P＜0.05）；與Model組相比，巴氯芬組GABAAR蛋白水平增加，GRP78、CHOP蛋白水平降低（P＜0.05），而BIC組GABAAR蛋白水平降低，GRP78、CHOP蛋白水平增加（P＜0.05），見圖4、表4。

3 討論

膿毒癥引發的ALI具有肺部炎癥反應和肺泡損傷等一系列病理特征［13-14］。本研究結果發現，Model組肺組織較CON組有明顯的肺泡充血、肺泡隔增厚、結構損傷和間質性中性粒細胞滲透現象，且肺損傷評分顯著高于CON組，具有ALI的典型表征。

研究顯示過度氧化應激和ERS在ALI發病機制中起關鍵作用［15］。氧化應激可以增強促炎基因的表達，炎性細胞可以誘導ROS的過度生成，從而形成惡性循環，促進包括ALI在內的多種疾病的發生和發展。本研究發現，ALI大鼠SOD水平顯著下降，MDA水平顯著增加，表明ALI大鼠存在氧化應激。ERS是由內質網（ER）中未折疊或錯誤折疊的蛋白質積累引起，是細胞對ER紊亂的適應性反應，但持續的ERS可能會誘發細胞損傷及凋亡［16］。GRP78在正常生理條件下可結合ERS傳感器，在增強的ERS過程中以更穩定的方式與錯誤折疊或未折疊的蛋白質相互作用。因此，GRP78的增加通常被用作ERS標志分子［17］。CHOP是評估ERS的另一個標記分子，在ERS中作為一種凋亡轉錄因子［18］。在本研究中，ALI大鼠凋亡指數、GRP78、CHOP蛋白水平相較CON組顯著增加，證實了ALI大鼠存在ERS和細胞凋亡。

當ALI發生后，線粒體受損會釋放出大量的氧化酶，由此會導致更嚴重的氧化應激和線粒體損傷［19］。當線粒體受損時，線粒體呼吸鏈產物，如Cyt.C和NADPH會被釋放出來。因此，Cyt.C和NADPH水平的增加反映了線粒體損傷［20］。線粒體自噬是線粒體損傷自我修復的機制。增加線粒體自噬會降低線粒體呼吸鏈產物（如Cyt.C和NADPH）的水平，而Cyt.C和NADPH是線粒體自噬的生物標志物［21］。Zhao等［22］發現，調節線粒體自噬來降低肺組織和肺泡上皮細胞的炎癥和線粒體損傷可以防止LPS誘導的ALI。本研究中，Model組的Cyt.C和NADPH水平較CON組顯著增加，且吞噬線粒體的自噬性空泡數量顯著降低，與上述研究一致，證實了ALI大鼠線粒體自噬被抑制。

GABA信號通路是研究ALI的常見通路，GABA僅由大鼠肺中的肺神經內分泌細胞產生［23］。激活GABA信號通路和增加GABAAR蛋白水平可改善肺功能，減輕肺損傷［6］。本研究結果亦顯示，Model組大鼠肺組織GABAAR蛋白低表達，推測降低GABA信號通路可能促進了膿毒癥大鼠ALI。為了驗證該推測，筆者團隊使用GABA信號通路激活劑巴氯芬以及抑制劑BIC處理ALI大鼠，結果發現，巴氯芬可促進線粒體自噬功能及降低ERS，改善ALI大鼠肺損傷，而BIC結果與巴氯芬組的相反，BIC加重了肺損傷。因此，筆者推測GABA信號通路可能為線粒體自噬與ERS的調控機制，GABA信號通路可通過調控ERS與線粒體自噬的平衡來減輕膿毒癥引發的ALI。

綜上所述，激活GABA信號通路可能通過促進線粒體自噬及降低ERS，進而對膿毒癥大鼠ALI起到治療作用。然而本研究缺少對藥物劑量的探究，這將是后續研究的重點。

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（2023-09-05收稿 2023-11-22修回）

（本文編輯 陸榮展）