血清4型禽腺病毒的檢測方法及疫苗研究進展

摘要 血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4）以感染3～6周齡的肉雞為特征，主要引起心包液-肝炎綜合征，其傳播范圍廣，給養(yǎng)禽業(yè)造成的損失較大。禽腺病毒有12種血清型，因血清型眾多，給血清4型禽腺病毒的診斷及防控帶來一定的困難。本文對血清4型禽腺病毒的分子生物學(xué)檢測方法（聚合酶鏈式反應(yīng)、實時熒光定量PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增）、血清學(xué)檢測方法及其他檢測技術(shù)，以及滅活疫苗、弱毒疫苗、基因工程疫苗及生物制品的最新研究進展進行了綜述，為血清4型禽腺病毒的檢測和疫苗的研究提供參考。

關(guān)鍵詞 血清4型禽腺病毒；檢測方法；疫苗；分子生物學(xué)；肉雞

中圖分類號 S852.65" "文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2024）12-0063-05

Research progress on detection methods and vaccines for fowl adenovirus serotype 4

ZHANG Ying

（Sichuan College of Traditional Chinese Medicine， Mianyang 621000， China）

Abstract Fowl adenovirus serotype 4 （FAdV-4） is characterized by infecting broilers aged 3-6 weeks， mainly causing pericardial effusion-hepatitis syndrome. It has a wide range of transmissions， causing significant losses to the poultry industry. There are 12 serotypes of fowl adenovirus， and due to the numerous serotypes， it brings certain difficulties to the diagnosis and prevention of fowl adenovirus serotype 4. This article reviewd the molecular biology detection methods （polymerase chain reaction， real-time fluorescence quantitative PCR， and loop-mediated isothermal amplification）， serological detection methods， and other detection techniques， as well as the latest research progress in inactivated vaccines， attenuated vaccines， genetically engineered vaccines， and biological products for fowl adenovirus serotype 4. It provided a reference for the detection and vaccine research of fowl adenovirus serotype 4.

Keywords fowl adenovirus serotype 4; detection method; vaccine; molecular biology; broiler chicken

禽腺病毒（Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV）屬腺病毒科禽腺病毒屬，為無囊膜的雙鏈DNA病毒，其基因組全長約45 kb。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)和序列可將其分為Ⅰ群（FAdV-Ⅰ）、Ⅱ群（FAdV-Ⅱ）和Ⅲ群（FAdV-Ⅲ）。FAdV-Ⅰ可通過血清交叉中和試驗細分為FAdV-1～7、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-9～11這12種血清型，也可根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)特征分為A、B、C、D和E共5種血清型[1]。禽腺病毒感染在家禽養(yǎng)殖場呈廣泛傳播，給養(yǎng)禽業(yè)造成較大經(jīng)濟損失。Chen等[2]對2015—2018年15個省市155株FAdV的流行血清型進行了研究，結(jié)果表明FAdV-4是主要血清型，其中FAdV-4占比79.4%、8a占比13.5%、8b占比3.9%。田甜等[3]對2015—2022年FAdV-Ⅰ感染流行病學(xué)調(diào)查顯示，流行的禽腺病毒感染情況主要為FAdV-4，占比92.1％。王泰龍[4]對2021—2022年收集的疑似FAdV感染的601份病例進行病原學(xué)檢測，結(jié)果顯示FAdV-4和FAdV-11血清型為優(yōu)勢流行毒株。血清4型禽腺病毒（FAdV-4）主要以感染3～6周齡的肉雞為特征，引起心包液-肝炎綜合征，且表現(xiàn)為急性死亡，病死率較高，威脅家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[5-6]。本文綜述了當前FAdV-4的分子生物學(xué)檢測方法、血清學(xué)檢測方法及疫苗的最新研究進展，為該病毒的防控提供參考。

1 FAdV-4分子生物學(xué)檢測方法分析

1.1 聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）

PCR是一種用于擴增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，其特點是可將微量的DNA片段進行大量的特異性擴增，該技術(shù)已成為診斷FAdV感染的主要手段之一。PCR方法具有靈敏度高、操作簡單和快速的優(yōu)點。張夢荷[7]根據(jù)GenBank已公布的Hexon保守序列，設(shè)計出檢測I群禽腺病毒的PCR鑒定引物，擴增FAdV-4進行特異性試驗，結(jié)果表明FAdV-4結(jié)果為陽性，雞傳染性喉氣管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）、雞傳染性貧血病毒（Chicken infection anemia virus，CIAV）、雞減蛋綜合征病毒（Egg drop syndrome virus，EDSV）和馬立克氏病毒（Mareks disease，MDV）結(jié)果均為陰性，表明該PCR方法的特異性較好。敏感性試驗結(jié)果顯示，該PCR方法最低可檢測出的病毒DNA含量為3.02×10-2 ng/μL。

1.2 實時熒光定量PCR（qPCR）

普通PCR技術(shù)不能測定FAdV-4的病毒載量，定量PCRC（qPCR）被廣泛用于多種病原體的檢測和定量，qPCR具有特異性強、靈敏度高、高效、快速、準確和操作簡單等優(yōu)點，可有效避免交叉污染。盧清俠等[8]建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法，可用于FAdV-4的臨床大規(guī)模早期快速診斷。吳雙等[9]建立了一種能特異性針對FAdV-4 Hexon基因的病原快速檢測及病毒載量測定的qPCR方法，并對180份疑似樣品進行檢測，檢出率51.1％，抽取測序成功的49份樣品序列，其結(jié)果與目的序列一致，該試驗結(jié)果證明，qPCR檢測方法較常規(guī)PCR方法具有更高的靈敏度、重復(fù)性和準確性。招麗嬋等[10]建立的血清4型禽腺病毒TaqMan熒光定量PCR方法，敏感度可達7.3×101 copies/μL，其檢測靈敏度約為普通PCR的1 000倍，并用該檢測方法對48份臨床疑似病例進行檢測，結(jié)果顯示，熒光定量PCR檢出陽性率為95.8%，而普通PCR檢測陽性率僅為75.0%，可見普通PCR可能存在一定漏檢的情況，TaqMan熒光定量PCR具有較好的特異性。

1.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）

LAMP是一種簡單、快速且特異的核酸篩選擴增方法。唐熠等[11]選擇Hexon基因的保守片段建立了檢測I群禽腺病毒的LAMP檢測方法。薛曉巖等[12]建立了針對FAdV-4的LAMP檢測方法。欒勇嬌[13]建立了鑒別診斷FAdV-4變異株和非變異株的二重熒光LAMP檢測方法，該方法可區(qū)分FAdV-4變異株、非變異株和二者混合感染。鐘鳴[14]采用巢式PCR和LAMP檢測方法，同時對102份臨床樣本進行檢測，結(jié)果顯示，LAMP檢測方法檢出的陽性率為34.3%，巢式PCR方法檢出的陽性率為20.5%，表明LAMP檢測方法特異靈敏性更高，有較好的應(yīng)用前景。

2 血清學(xué)檢測方法分析

近年來，血清學(xué)檢測技術(shù)大多集中在酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）方法的優(yōu)化與改進上。研究表明，F(xiàn)iber-1與Fiber-2蛋白與其他血清型的同源性較低，只與FAdV-10有較高的同源性[15]，而基于Fiber-1蛋白建立檢測方法的研究較少。武曉倩等[16]成功表達了fiber-1蛋白，建立了檢測FAdV-4抗體的間接ELISA方法。梁思敏等[17]以FAdV-4多抗作為捕獲抗體，F(xiàn)AdV-4 Penton蛋白單克隆抗體作為檢測抗體，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了檢測FAdV-4的夾心ELISA檢測方法，并對其進行了特異性、敏感性和重復(fù)性檢驗及臨床樣品檢測，結(jié)果表明，該方法可用于FAdV-4的大批量檢測。田開月等[18]成功制備了抗FAdV-4 Fiber-2蛋白的特異性單克隆抗體，獲得的單克隆抗體均為IgM亞型，可特異性識別FAdV-4及其Fiber-2蛋白，為FAdV-4的免疫檢測和Fiber-2蛋白功能研究提供了材料。謝麗基等[19]以100 K重組蛋白作為免疫原免疫小鼠，經(jīng)過ELISA篩選，成功研制了100 K重組蛋白單克隆抗體，為FAdV-4抗原和抗體檢測試劑的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

3 其他檢測技術(shù)分析

隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，越來越多的檢測技術(shù)不斷應(yīng)用于FAdV-4的診斷中。邵穎等[20]針對血清4型禽腺病毒特異性抗原的多克隆抗體，建立了即時檢驗熒光微球免疫層析檢測方法，對不同濃度的FAdV-4病毒液及臨床陽性樣本進行了檢測，該方法能在15 min內(nèi)觀察到結(jié)果，檢測時間短，且檢測出陽性結(jié)果與臨床診斷結(jié)果相符。謝松樺[21]創(chuàng)制了基于雙單抗的檢測FAdV-4病毒的試紙條，該試紙條能在10 min內(nèi)完成現(xiàn)場診斷，可檢出感染野毒后2～4 d的無特定病原雞肝組織樣品中的病毒，通過對75份臨床組織樣品及28株臨床分離毒株進行檢測，其結(jié)果與PCR檢測結(jié)果符合率分別為94.6%和100%。殷冬冬等[22]建立的重組酶輔助擴增結(jié)合CRISPR/Cas13a方法，可以在實驗室要求不高的情況下應(yīng)用于基層單位和現(xiàn)場使用的快速檢測。黃嬌玲等[23]采用多壁碳納米管-殼聚糖-鉑納米粒子復(fù)合材料（MWCNT-Chi-PtNP）修飾金電極（GE），并吸附血清4型禽腺病毒蛋白單克隆抗體（MAb/FAdV-4），構(gòu)建了一種新型的電阻型電化學(xué)免疫傳感器用于檢測FAdV-4，并對36份臨床樣品進行檢測，檢測結(jié)果與PCR方法和測序結(jié)果相符，該傳感器特異性高，穩(wěn)定性好，為FAdV-4的診斷提供了一種新型的快速檢測技術(shù)。陳樂樂等[24]制備的膠體金檢測卡可檢出含量為102.094 5 EID50的FAdV-4，其臨床樣本的檢測結(jié)果與PCR檢測結(jié)果的符合率達98%，該方法可用于FAdV-4感染的快速檢測。

4 血清4型禽腺病毒疫苗研究進展分析

4.1 滅活疫苗

滅活疫苗有著穩(wěn)定、安全、免疫應(yīng)激反應(yīng)小，以及便于運輸、儲存等眾多優(yōu)點。周玉雙[25]篩選出免疫原性好的FAdV-4 JH株，利用LMH細胞，結(jié)合激流式生物反應(yīng)器，對FAdV-4標準毒株JH株進行了高效大量擴增，制備了FAdV-4滅活疫苗，并對其免疫保護效果進行評價，研究結(jié)果確定FAdV-4滅活疫苗（JH株）免疫產(chǎn)生期為21 d、持續(xù)期為4個月；對14日齡SPF雞群接種滅活疫苗后的第21天，雞血清中和抗體效價在1∶75以上，并能提供對FAdV-4致死性接種劑量的100％保護，表明該滅活疫苗安全有效。侯文飛[26]基于表達傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）變異株VP2蛋白的重組病毒rFAdV4-IBDV/VP2制備了IBD-HHS二聯(lián)滅活疫苗，并對其免疫原性和免疫效力進行評價。結(jié)果顯示，滅活rFAdV4-IBDV/VP2油乳劑疫苗，免疫后21 d均可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高水平的抗IBDV和FAdV-4的特異性抗體，對IBDV強毒變異株和高致病性FAdV-4株的攻毒提供完全保護。目前，針對FAdV-4的商品化疫苗有雞新城疫、禽流感（H9亞型）、禽腺病毒（Ⅰ群，4型）三聯(lián)滅活苗以及禽腺病毒（Ⅰ群，4型）滅活疫苗（JH株）。

4.2 弱毒疫苗

弱毒疫苗是將自然的病毒或細菌強毒株通過理化和生物學(xué)等方法使其致病力喪失后仍然保留良好的免疫原性和遺傳特性，作為抗原制備的疫苗稱為弱毒活疫苗。Mansoor等[27]將FAdV-4在雞胚中連續(xù)傳16代，然后對14 d的肉雞進行免疫，并比較對照組免疫商品滅活疫苗的免疫效果。結(jié)果顯示，弱毒免疫的肉雞組在7、14和21 d，血清抗體效價明顯提升；攻毒保護試驗顯示，滅活疫苗與弱毒免疫組保護率分別為65%和100%，表明弱毒免疫效果良好。但弱毒苗可能存在毒力返強、免疫效果不穩(wěn)定等缺點，同時弱毒疫苗在保存和運輸上要求較高。

4.3 基因工程疫苗

基因工程疫苗是將病原的保護性抗原編碼的基因片段克隆至表達載體，用以轉(zhuǎn)染細胞或真核細胞微生物及原核細胞微生物后得到的產(chǎn)物，或?qū)⒉≡亩玖ο嚓P(guān)基因刪除，使其成為不帶毒力相關(guān)基因的基因缺失苗[28]。杜東穎等[29]比較研究了Ⅰ群禽腺病毒（4型）Fiber-2蛋白亞單位疫苗與全病毒滅活疫苗的免疫效果，結(jié)果表明，F(xiàn)iber-2蛋白具有良好的免疫原性，抗原含量AGP效價不低于1∶4，與全病毒滅活疫苗抗原含量為106.5 TCID50/0.1 mL免疫效力相當，可用于疫苗研制開發(fā)。郭珣[30]選擇FAdV-4衣殼蛋白的多肽片段，設(shè)計構(gòu)建多鏈融合重組蛋白，制備亞單位疫苗，并對其免疫保護效力進行了評價研究，結(jié)果表明，F(xiàn)AdV-4：F1-P-F2-H是最佳的亞單位疫苗抗原，能有效抵抗FAdV-4的感染，同時具有安全、穩(wěn)定，不含F(xiàn)AdV-4病毒的遺傳物質(zhì)核酸等特點。劉世佳等[31]用血清4型禽腺病毒Fiber-2蛋白和penton蛋白制備亞單位疫苗，并進行免疫效果評價，結(jié)果表明，利用禽腺病毒血清4型JLJ13株Fiber-2 Shaft2和penton蛋白混合配伍ISCOMs佐劑制備的亞單位疫苗免疫保護效果明顯。袁楓[32]用優(yōu)化的畢赤酵母表達的Fiber-2蛋白制備的亞單位疫苗免疫雛雞，可以誘導(dǎo)較高的抗體水平并提供高達100%的FAdV-4毒株（GD616）的攻擊保護。目前禽腺病毒-4型、11型基因工程疫苗二價苗已進入臨床試驗階段。

4.4 生物制品

目前，針對FAdV-4的商品化疫苗效果參差不齊。卵黃抗體在家禽傳染病的預(yù)防與控制方面應(yīng)用廣泛，因其敏感性好、特異性強且制作簡便、成本較低，有望成為一種FAdV感染的高效治療手段。匡虹迪[33]制備的FAdV-4免疫原和卵黃抗體均能有效抵御SPF雞對血清4型禽腺病毒的感染，其制備的卵黃抗體中和效價為1∶256，注射劑量為0.5 mL/只時，對預(yù)防SPF雞感染FAdV-4臨床保護率可達100%；在病毒感染后24和36 h，注射劑量中和效價為1∶256的卵黃抗體，仍然對感染FAdV-4的治療率可達100%。已經(jīng)有針對FAdV-4的商品化的卵黃抗體。

5 結(jié)語

禽腺病毒血清型較多，部分檢測方法如病毒分離鑒定、血清中和試驗和瓊脂擴散試驗等具有一定的優(yōu)勢，實踐中檢測時間較長、操作繁雜，在基層實驗條件有限的情況下，不適用于現(xiàn)場檢測。目前建立的檢測方法很多，應(yīng)根據(jù)實際感染情況和現(xiàn)場實驗條件以及檢測的規(guī)模等選擇適合的檢測方法，提高FAdV-4的防控效率。

在血清4型禽腺病毒感染防控方面，研究發(fā)現(xiàn)在血清4型禽腺病毒暴發(fā)初期，可將發(fā)病的動物肝臟制備成組織勻漿用于防疫該病，取得了很好的效果[34]。禽腺病毒有12種血清型，各血清型之間交叉保護性弱，目前商品化的禽腺病毒滅活疫苗主要針對血清4型，未來可以傾向于研發(fā)多價多聯(lián)禽腺病毒滅活疫苗，加強各血清型之間的交叉保護。基礎(chǔ)獸藥數(shù)據(jù)庫顯示，已有一些血清4型禽腺病毒多聯(lián)滅活苗進入臨床試驗階段。有研究將重組蛋白亞單位疫苗與滅活疫苗進行免疫效果比較，重組亞單位疫苗效果明顯，同時具有安全穩(wěn)定的特點，基因工程疫苗有望在未來加大對多價苗的研發(fā)力度[29]。對于一些生物制品，如禽腺病毒感染的商品化卵黃抗體主要是針對FAdV-4，針對其他血清型的卵黃抗體應(yīng)加大研發(fā)力度，因卵黃抗體制備流程簡單、成本較低、安全性好、保護期長且效果明顯等優(yōu)點突出，已在家禽傳染病的預(yù)防與控制方面得到廣泛應(yīng)用，有很好的應(yīng)用價值。

本文對血清4型禽腺病毒的分子生物學(xué)檢測方法、血清學(xué)檢測方法及疫苗的最新研究進展進行了綜述，為血清4型禽腺病毒的檢測和疫苗的研究提供參考。

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（責編：何 艷）