柵藻多糖的復合酶法提取工藝、化學組成及其抗氧化活性研究

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.07.027

引文格式：劉浩文，王川林，李佳瑩，等.柵藻多糖的復合酶法提取工藝、化學組成及其抗氧化活性研究.中國調味品，2024，49（7）：176-183.

LIU H W， WANG C L， LI J Y， et al.Study on extraction process of complex enzyme method， chemical composition and antioxidant activity of polysaccharide from Tetranephris brasiliensis.China Condiment，2024，49（7）：176-183.

摘要：以柵藻粉為研究對象，研究柵藻多糖（TBP）的復合酶法提取工藝、化學組成及抗氧化活性。采用復合酶法提取TBP，考察酶解pH、復合酶（纖維素酶和木瓜蛋白酶按1∶1復配）添加量、酶解溫度、酶解時間對TBP提取率的影響，并通過響應面模型優化TBP的提取工藝。對TBP的化學成分含量、單糖組成、官能團結構和體外抗氧化活性進行了分析研究。實驗結果表明，TBP的復合酶法最佳提取工藝參數為酶解pH 6.1、復合酶添加量5.35%、酶解溫度53.1 ℃和酶解時間84.2 min，在最佳提取條件下，TBP提取率可達（8.86±0.13）%；經化學組成分析，發現TBP的總糖含量為（57.59±1.06）%、蛋白質含量為（5.14±0.88）%、糖醛酸含量為（3.16±0.42）%，TBP具備典型的糖類化合物特征峰，含有吡喃糖和硫酸基團，其單糖共計10種類型，主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖組成；對TBP的抗氧化活性進行研究，發現TBP對ABTS自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基具有較好的清除能力。該研究可對柵藻多糖的提取及其在食品工業中的應用提供相應參考。

關鍵詞：柵藻多糖；復合酶法；工藝優化；抗氧化

中圖分類號：TS201.2""""" 文獻標志碼：A""""" 文章編號：1000-9973（2024）07-0176-08

Study on Extraction Process of Complex Enzyme Method， Chemical Composition

and Antioxidant Activity of Polysaccharide from Tetranephris brasiliensis

LIU Hao-wen， WANG Chuan-lin， LI Jia-ying， LIU Ping-huai*

（School of Chemistry and Chemical Engineering， Hainan University， Haikou 570228， China）

Abstract： With Tetranephris brasiliensis powder as the research object， the extraction process of complex enzyme method， chemical composition and antioxidant activity of Tetranephris brasiliensis polysaccharide （TBP） are studied. TBP is extracted by complex enzyme method. The effects of enzymatic hydrolysis pH， the addition amount of complex enzymes （the ratio of cellulase to papain of 1∶1）， enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis time on the extraction rate of TBP are investigated， and response surface model is used to optimize the extraction process of TBP. The content of chemical components， monosaccharide composition， functional group structure and in vitro antioxidant activity of TBP are analyzed and studied. The results show that the optimal extraction process parameters of TBP by complex enzyme method are enzymatic hydrolysis pH of 6.1， addition amount of complex enzymes of 5.35%， enzymatic hydrolysis temperature of 53.1 ℃ and enzymatic hydrolysis time of 84.2 min. The extraction rate of TBP can reach （8.86±0.13）% under the optimal extraction conditions. Through chemical composition analysis， it is found that the total sugar content of TBP is （57.59±1.06）%， protein content is （5.14±0.88）%， and glucuronic acid content is （3.16±0.42）%. TBP has typical characteristic peaks of carbohydrates， and it contains pyranose and sulfate groups， with a total of ten types of monosaccharides， mainly including glucose， galactose and mannose. The antioxidant activity of TBP is studied， and it is found

收稿日期：2024-03-01

基金項目：國家重點研發計劃項目（2021YFA0909604）；海南省重點研發項目（ZDYF2024XDNY268）

作者簡介：劉浩文（1998—），男，碩士，研究方向：微藻代謝產物的生物和化學特性、提取和利用。

*通信作者：劉平懷（1967—），男，教授，碩士，研究方向：微藻細胞培養、發酵工藝優化與放大及其產業化開發。

that TBP has good scavenging capacity on ABTS radicals， superoxide anion radicals and hydroxyl radicals. This study can provide references for the extraction of Tetranephris brasiliensis polysaccharide and its application in food industry.

Key words： Tetranephris brasiliensis polysaccharide; complex enzyme method; process optimization; antioxidation

微藻是存在于眾多生態系統中的各種真核光合自養單細胞微生物，生存環境包括水域、空氣和陸地。它們能夠在艱苦的條件下生存，并將捕獲的太陽能、水和二氧化碳等無機營養物質轉化成生物質，其效率超過大多數陸生植物，符合國家的雙碳理念。微藻富含多種生物活性分子，在化妝品、食品和動物飼料等領域有著廣闊的應用前景。

柵藻屬綠藻門綠球藻目柵藻科，個體微小，藻體呈柵狀或橢圓形，是常見的淡水藻之一，因具有易培養收集的特性而成為微藻生物技術研究中較常見的微藻種類。目前對微藻多糖的研究主要集中在一些優勢微藻，如螺旋藻多糖等，而對柵藻多糖的相關報道較少。

多糖作為微藻重要的活性成分之一，其復雜且特殊的結構不僅使其具有多種生物活性，包括抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、抗病毒、抗炎等，而且使其具備特殊的功能特性，如Mishra等報道的杜氏鹽藻多糖的乳化性高于市售表面活性劑，是潛在的多糖乳化劑；Cosenza等報道的紫球藻多糖具有高黏性，表現出假塑性和剪切稀釋特性，是潛在的多糖增稠劑；Roohinejad 等報道的微藻硫酸化多糖部分替代食品中的脂質不僅可以降低脂肪的含量，而且可以提供更高的黏度、更長的熔化時間和更好的感官特性。在調味品方面，Camacho等報道的鈍頂螺旋藻多糖應用于乳制品中不僅具有增稠特性，而且可以作為益生元選擇性地促進發酵酸奶中益生菌的生長并提高其活性，提高乳制品的風味；龐庭才等以小球藻粉為原料，提取藻多糖和藻蛋白后合并提取液，按一定比例添加蜂蜜、白糖、檸檬酸直接配制澄清型小球藻保健飲料，產品營養豐富、風味獨特。因此，微藻多糖在功能性食品、食品添加劑及食品調味劑中具有豐富的開發潛力。

多糖的提取技術直接影響多糖的得率，目前常見的提取方法有水熱法、超聲波輔助法、微波輔助法等，各種方法的優勢存在差異。復合酶法是利用不同酶的單一性，多種酶復合后可高效破壞細胞壁等結構，提高細胞膜、細胞壁的通透性，促進多糖、蛋白質等內容物的溶解和釋放，進而增加產物的提取率，提高整體效率。酶法提取條件溫和，不破壞活性成分結構，且環境友好，任曉莉等采用復合酶法提取的槐花多糖得率為10.71%，而趙慶友等采用單一纖維素酶提取的泰山槐花多糖得率為4.93%，表明多種酶復合后可以更高效地破壞細胞結構，提高多糖得率。

本研究采用復合酶法提取TBP，通過單因素實驗結合響應面法優化提取工藝，分析TBP的3種化學成分含量，并采用紅外光譜、離子色譜對TBP的官能團結構與單糖組成展開分析，同時評估了TBP的抗氧化活性，旨在為TBP的深入開發提供實驗參考。

1" 材料與方法

1.1" 材料

柵藻藻種分離于海南省陵水河，經過BG-11培養基擴培后，收集藻液，離心后冷凍干燥得到柵藻粉。

1.2" 試劑

纖維素酶（1 000 U/g）、木瓜蛋白酶（3 000 U/g）：上海玻爾化學試劑有限公司；正丁醇、三氯甲烷、乙醇、苯酚、硫酸：西亞化學科技（山東）有限公司；間羥基聯苯、ABTS：上海安耐吉化學有限公司；單糖標準品、牛血清蛋白：上海源葉生物科技有限公司；過硫酸鉀、硫酸亞鐵、水楊酸、Tris-HCl、鄰苯三酚：上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.3" 主要儀器和設備

CR-22GⅡ冷凍離心機" 日本日立公司；RV10 Plus旋轉蒸發儀" 德國IKA公司；Scientz-10N真空冷凍干燥機" 寧波新芝生物科技股份有限公司；xMark全波長酶標儀" 美國Bio-Rad公司；ICS5000型離子色譜儀、Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀" 美國賽默飛世爾科技公司。

1.4" 實驗方法

1.4.1" 復合酶法提取工藝流程

參考王天怡等的方法并稍作修改，提取工藝流程見圖1。

1.4.2" TBP提取率

TBP提取率按公式（1）計算。

TBP提取率（%）=mM×100%。（1）

式中：m為TBP的質量（g）；M為柵藻粉的質量（g）。

1.4.3" 單因素實驗

按照圖1中的提取工藝，考察不同酶解pH（4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5）、復合酶添加量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）、酶解溫度（40，45，50，55，60，65 ℃）和酶解時間（30，60，90，120，150，180 min）對TBP提取率的影響。

1.4.4" 響應面實驗設計

根據1.4.3中的實驗最優水平，使用Design-Expert 13軟件進行響應面實驗設計，見表1。

1.4.5" TBP的化學組分測定

TBP總糖含量的測定參考DuBois等的方法；蛋白質含量的測定參考徐天等的方法；糖醛酸含量的測定參考李玲的方法。

1.4.6" TBP的單糖組成分析

參考劉智鈞的實驗方法，稱取5 mg TBP放入具塞試管內，添加2 mL三氟乙酸（3 mmol/L），將氮氣充入具塞試管內，在110 ℃高溫下酸水解4 h。取適量TBP的酸水解液置于10 mL試管中，氮吹至干，加入5 mL超純水復溶，取150 μL復溶液，向其中加入850 μL超純水，離心后取上清液，過濾膜后，進行離子色譜儀上樣分析。

1.4.7" TBP的紅外光譜分析

取適量溴化鉀（KBr）、5 mg TBP研磨均勻，壓片處理，進行紅外光譜上機掃描分析（4 000～400 cm－1）。

1.4.8" TBP的體外抗氧化活性評價

1.4.8.1" ABTS自由基清除能力

參考李知弦的實驗方法，通過渦旋儀將配制好的K2S2O8（2.45 mmol/L）和ABTS（7 mmol/L）溶液按1∶1充分混合后作為后續實驗的儲備液，室溫下暗處理16 h，通過無水乙醇稀釋儲備液的吸光度至7.0備用。分別配制濃度為0.5，1，1.5，2，3，4，5 mg/mL的TBP溶液，取100 μL TBP溶液并添加稀釋儲備液3 mL，在黑暗中反應6 min，使用全波長酶標儀對吸光度A734 nm進行測定，陽性對照采用抗壞血酸，ABTS自由基清除率按公式（2）計算。

ABTS自由基清除率（%）=A空白-A樣品A空白×100%。（2）

式中：A空白為超純水替代TBP溶液在734 mm處的吸光度。

1.4.8.2" 羥自由基清除能力

參考Tang等的實驗方法，吸取1 mL FeSO4（6 mmol/L）溶液、2 mL H2O2（0.1%）溶液和1 mL TBP樣品溶液添加到10 mL試管內，渦旋混合，在室溫下反應25 min后添加2 mL C7H6O3（6 mmol/L）溶液，渦旋混合，在室溫下反應30 min，通過全波長酶標儀對吸光度A510 nm進行測定，陽性對照采用抗壞血酸，羥自由基清除率按公式（3）計算。

羥自由基清除率（%）=A空白-A樣品+A對照A空白×100%。（3）

式中：A對照為超純水替代H2O2溶液在510 nm處的吸光度。

1.4.8.3" 超氧陰離子自由基清除能力

參考唐婷的實驗方法，配制30 mmol/L的鄰苯三酚溶液、0.05 mol/L 的Tris-HCl緩沖液。在試管中加入3 mL Tris-HCl緩沖液、0.2 mL TBP樣品溶液，在室溫條件下黑暗處理20 min，添加12 μL鄰苯三酚溶液，渦旋混合后黑暗處理5 min，隨后添加0.5 mL濃硫酸，使用全波長酶標儀對吸光度A320 nm進行測定，陽性對照采用抗壞血酸，超氧陰離子自由基清除率按公式（4）計算。

超氧陰離子自由基清除率（%）=（1－A樣品-A對照A空白）×100%。（4）

式中：A對照為超純水替代鄰苯三酚溶液的TBP樣品在320 nm處的吸光度。

2" 結果與分析

2.1" 單因素實驗結果分析

2.1.1" 酶解pH對TBP提取率的影響

extraction rate of TBP

環境中的酸堿度會影響酶蛋白的構象，使酶的活性受到影響。由圖2可知，當pH在4～6時，隨著pH的上升，復合酶活性顯著提高。酶活性較高，可以加快內容物的釋放，當pH為6.0時，TBP提取率達到最大值8.06%，但隨著pH繼續升高，復合酶活性逐漸降低，TBP提取率呈現降低的趨勢。

2.1.2" 復合酶添加量對TBP提取率的影響

由圖3可知，隨著體系中復合酶添加量的增加，底物柵藻粉能夠與酶更充分地反應，釋放柵藻粉內容物的速度也相應提升。在復合酶添加量為5%時，酶和柵藻粉可以得到完全接觸和反應，TBP提取率達到最大值8.43%，但隨著復合酶添加量的繼續增加，TBP提取率呈下降趨勢，推測是過高的復合酶添加量使部分多糖被降解，導致TBP提取率下降。

2.1.3" 酶解溫度對TBP提取率的影響

溫度對酶有雙重影響，一方面影響酶和底物的反應速度，另一方面影響酶蛋白的構象。由圖4可知，酶解溫度在40～55 ℃之間時，隨著酶解溫度的上升，復合酶活性逐漸增加，酶解效率大幅提高，可以有效促進內容物的析出，因此提高了TBP提取率，但隨著酶解溫度的進一步上升，TBP提取率呈下降趨勢，推測是酶蛋白在高溫下變性，給酶蛋白構象帶來一定影響，大幅降低了酶的活性和酶解效率，內容物析出減少，使得多糖提取率相應降低。

2.1.4" 酶解時間對TBP提取率的影響

酶解時間過短會導致酶和底物反應不完全，內容物析出較少；酶解時間過長會導致部分多糖被酶降解，影響提取率。由圖5可知，當酶解時間為30～90 min時，酶和底物反應的時間越來越充分，TBP提取率上升，但隨著酶解時間的繼續增加，TBP提取率呈下降趨勢，這可能是由于酶解時間過長，部分多糖被酶降解成溶于水的物質，導致TBP提取率降低。

2.2" 響應面分析

2.2.1" 響應面實驗方案及結果

注：“*”表示差異顯著（0.01lt;Plt;0.05），“**”表示差異極顯著（Plt;0.01），“#”表示差異不顯著（Pgt;0.05）。

由表2中數據分析得到，TBP提取率（Y）的二次多項回歸方程為Y=8.68+0.475 8A+0.340 8B－0.187 5C+0.145 8D－0.300 0AB+0.150AC+0.147 5AD－0.162 5BC－0.450 0BD－0.040 0CD－0.605 9A2－0.398 4B2－0.425 9C2－1.31D2。

由表3可知，回歸方程模型的Plt;0.01，表明此模型極顯著，該模型失擬項的P=0.301 1gt;0.05，失擬項差異不顯著，表明模型具備可靠性，可用于實驗結果的分析。該模型的相關系數R2=0.970 1，RAdj2=0.940 2，兩者均大于0.9，表明模型的擬合度良好。因此，該模型可以很好地反映TBP提取過程中各因素和響應值的內在聯系。由F值可知，酶解pH對TBP提取率的影響較大，酶解時間對TBP提取率的影響較小。

2.2.2" 響應面分析

響應面圖能反映不同因素的交互效果，由圖6可知，6個響應面圖呈現不同的陡峭程度，表明不同單因素的交互效果呈現差異性，其中AB、BD的陡峭程度明顯大于CD、BC、AC，表明A（酶解pH）、B（復合酶添加量）和B（復合酶添加量）、D（酶解時間）的交互作用效果較好，對TBP提取率有較大影響，符合表3中的方差分析結果。

2.2.3" TBP提取工藝的最佳條件及其驗證實驗

根據構建的響應面模型，通過Design-Expert 13軟件獲得的最佳工藝為酶解pH 6.1、復合酶添加量5.35%、酶解溫度53.1 ℃和酶解時間84.2 min，TBP的理想提取率為（8.94±0.13）%。對這一參數進行實驗驗證，TBP提取率為（8.86±0.13）%，與理論預測值偏差較小，在誤差范圍內，表明所得模型與結果相匹配，具備一定的可行性。

2.3" TBP的化學組成分析

2.3.1" TBP的化學成分含量分析

根據1.4.5的實驗方法繪制的標準曲線換算，TBP的總糖含量為（57.59±1.06）%，純度較低的原因可能是TBP是未經純化的粗多糖，存在一些雜質。蛋白質含量為（5.14±0.88）%，蛋白質的含量偏高，可能是由于提取工藝中沒有脫蛋白工藝。糖醛酸含量為（3.16±0.42）%，表明酶法提取的TBP可能是一種酸性多糖。

2.3.2" TBP的單糖組成分析

由圖7中a可知，16種混合單糖標準品的出峰效果較好，可對比性強。根據圖7中b的出峰時間和峰面積可知TBP由10種單糖組成，表明柵藻多糖是一種復雜的雜多糖，這與Capek等報道的小球藻胞外多糖結果一致，主要組成包括葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、甘露糖（Man）等，并且包含微量的核糖（Rib）、阿拉伯糖（Ara）、鹽酸氨基葡萄糖（GlcN）等；各單糖的摩爾比Fuc∶Rha∶Ara∶GlcN∶Gal∶Glc∶Xyl∶Man∶Rib∶GlcA為0.05∶0.22∶0.2∶0.33∶2.24∶5.30∶0.2∶0.75∶0.85∶0.1。核糖（Rib）的存在可能是因為TBP是未經過純化的雜多糖，含有一定量的蛋白質、核酸等雜質。

2.3.3" TBP的紅外光譜分析

紅外光譜法是糖類化合物常見的研究方法之一，部分特殊官能團在多糖結構的紅外光譜中會呈現特異的吸收峰。由圖8可知，在3 334 cm-1處有一個圓滑的強吸收峰，是OH伸縮振動引起的，說明TBP存在氫鍵，2 938 cm－1處的峰是TBP CH的對稱伸縮振動導致的，1 653 cm-1處的峰是多糖的羰基的CO伸縮振動導致的，表明TBP內包含糖醛酸，符合2.3.1中的實驗結果。1 236 cm-1處的峰是SO伸縮振動導致的，表明TBP中含有硫酸基團，1 079 cm-1處的峰是COC的伸縮振動導致的，說明TBP可能有吡喃環的結構。綜上所述，TBP具備典型的糖類化合物的特征峰，可以推斷TBP是糖類化合物，可為后續的純化多糖結構研究提供參考。

2.4" TBP的抗氧化活性分析

2.4.1" ABTS自由基清除能力

對天然化合物進行抗氧化活性評價時，ABTS法是一種非常重要且快速的方法。由圖9可知，當TBP處于低濃度（0.5～1 mg/mL）時，對ABTS自由基的清除能力較弱，只有10%左右，但隨著TBP濃度升高至3～5 mg/mL時，其ABTS自由基清除率出現了較大提升，當TBP濃度為5 mg/mL時，清除率為（58.48±0.24）%，但遠弱于同濃度VC的清除率，推測是由于TBP未經過純化，有很多雜質，影響其抗氧化性能。

2.4.2" 羥自由基清除能力

清除羥自由基對于細胞和機體的抗氧化防御至關重要，由圖10可知，當TBP處于低濃度（1～2 mg/mL）時，羥自由基清除能力較弱，隨著TBP濃度的不斷提高，其羥自由基清除率表現出一定的量效關系，當TBP濃度為5 mg/mL時，清除率為（77.14±0.38）%，和同濃度VC的清除率差距較小，表明TBP的羥自由基清除能力較好。

2.4.3" 超氧陰離子自由基清除能力

超氧陰離子自由基是生命體代謝過程中容易產生的一種對機體有害的自由基，與人類的衰老和身體部位的病變有著非常緊密的聯系。由圖11可知，當TBP在低濃度（0.5～1 mg/mL）時，對超氧陰離子的清除能力在50%左右，當TBP濃度為5 mg/mL時，超氧陰離子清除率達到（71.66±0.52）%，略低于同濃度VC的清除率，表明TBP具有良好的超氧陰離子自由基清除能力。

3" 結論

本研究采用復合酶法提取TBP，并對TBP的化學組成及抗氧化活性進行研究，主要結論如下：

通過單因素實驗和響應面法優化設計，確定了TBP復合酶法提取的最優工藝條件為酶解pH 6.1、復合酶添加量5.35%、酶解溫度53.1 ℃和酶解時間84.2 min，在最佳條件下，TBP提取率為（8.86±0.13）%。

TBP化學組成分析顯示，TBP中總糖含量為（57.59±1.06）%，蛋白質含量為（5.14±0.88）%，糖醛酸含量為（3.16±0.42）%，其具備典型的糖類化合物特征峰，含有吡喃糖和硫酸基團，是一種酸性多糖，其單糖主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖組成，是一種復雜的雜多糖。

對TBP進行體外抗氧化活性分析時發現，TBP在高濃度下的抗氧化效果表現良好，同時表現出一定的量效關系。

本研究結果可為柵藻多糖在功能性食品、食品添加劑及食品調味劑的深入開發和利用中的應用提供參考。

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