利用中壓制備液相色譜從藍莓葉多酚中分離純化綠原酸

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.07.026

引文格式：張芷瑜，張天偉，楊馥菡，等.利用中壓制備液相色譜從藍莓葉多酚中分離純化綠原酸.中國調味品，2024，49（7）：170-175.

ZHANG Z Y， ZHANG T W， YANG F H， et al.Separation and purification of chlorogenic acid from blueberry leaf polyphenols by medium pressure liquid chromatography.China Condiment，2024，49（7）：170-175.

摘要：該研究以藍莓葉為試驗材料，采用超聲輔助纖維素酶的方法獲得藍莓葉多酚粗提物，然后利用中壓制備液相色譜技術對粗提物進行分離純化，分別考察不同流動相、進樣量、流動相流速對綠原酸得率的影響。結果表明，最佳制備條件為乙腈-水溶液為流動相、進樣量6 mL、流動相流速10 mL/min，在此條件下，綠原酸得率為21.39%。經高效液相色譜分析，得到的綠原酸純度可達94.98％。該方法能夠快速、高效地分離藍莓葉中的綠原酸。該方法為研究和應用藍莓葉中活性成分提供了一種有效的手段。

關鍵詞：藍莓葉多酚；中壓制備液相色譜；分離純化；綠原酸

中圖分類號：TS255.7""""" 文獻標志碼：A""""" 文章編號：1000-9973（2024）07-0170-06

Separation and Purification of Chlorogenic Acid from Blueberry Leaf Polyphenols

by Medium Pressure Liquid Chromatography

ZHANG Zhi-yu1，2， ZHANG Tian-wei1，2， YANG Fu-han2，

LI Hui-zhen1，2， ZHANG Zhi-jun1，2*

（1.School of Chemistry and Chemical Engineering， North University of China， Taiyuan 030051，

China; 2.Jinzhong Industrial Technology Innovation Institute， North University of

China， Jinzhong 030600， China）

Abstract： In this study， with blueberry leaves as the test materials， ultrasonic-assisted cellulase method is used to obtain crude polyphenol extracts， and then the crude extracts are separated and purificated using medium pressure liquid chromatography technology， and the effects of different mobile phases， sample volumes and mobile phase flow rates on the yield of chlorogenic acid are investigated. The results show that the optimal preparation conditions are acetonitrile-aqueous solution as the mobile phase， the sample volume of 6 mL， and the mobile phase flow rate of 10 mL/min. Under these conditions， the yield of chlorogenic acid is 21.39%. Through high-performance liquid chromatography analysis， it is found that the purity of the obtained chlorogenic acid can reach 94.98%. Chlorogenic acid from blueberry leaves can be quickly and efficiently separated by this method. This method has provided an effective means for studying and applying the active components in blueberry leaves.

Key words： blueberry leaf polyphenols; medium pressure liquid chromatography; separation and purification; chlorogenic acid

收稿日期：2024-01-25

基金項目：山西省重點研發計劃項目特優農業技術創新專項（2022ZDYF123）

作者簡介：張芷瑜（1999—），女，碩士，研究方向：植物有效成分提取。

*通信作者：張志軍（1973—），男，教授，博士生導師，博士，研究方向：植物功能成分提取與高效利用。

藍莓葉在《本草綱目》已有記載：“其味苦平，無毒，益精氣，強筋骨，止瀉除睡，久服長生不饑，變白卻老。”藍莓葉作為藍莓植物的一部分，具有豐富的營養成分，已列入《中國藥典》，可以作為普通食品的原料。研究表明，藍莓葉中的綠原酸是一種重要的多酚類化合物，除了具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗糖尿病、降血脂、降血壓等多種生物活性外，還具有抗腫瘤、心血管疾病、肝病、肥胖癥等潛在的藥理作用，被廣泛應用于食品保藏、食品添加劑、化妝品等領域。Cao等研究發現，魚片通過用綠原酸-殼聚糖復合膜進行保藏，能明顯地抑制脂質和蛋白質氧化。唐薇研究發現，綠咖啡豆綠原酸可將紅豆飲品的保質期延長約5 d，對桔子飲品能起到增香、護色作用并增加儲存期限約3 d。Zhang等研究發現綠原酸對Diaporthe sp.引起的獼猴桃果實采后腐爛具有防控作用，原因是綠原酸能夠誘導Diaporthe sp.菌絲體中的線粒體ROS爆發，從而導致線粒體功能受到損害，并最終觸發真菌細胞的凋亡。Thom的研究中調查了食用綠原酸咖啡組與食用普通咖啡組受試者的平均體重分別降低了5.4 kg和1.7 kg，表明長期服用含有綠原酸的咖啡可以幫助肥胖者減輕體重。

超聲輔助酶法提取是一種利用超聲波和酶的協同作用加速植物組織中有效成分提取的方法，具有提取效率高、提取時間短、成分純度高等優點。目前，超聲輔助酶法被廣泛用于從多種植物材料中提取多酚。植物細胞壁可直接阻斷細胞內容物的釋放，影響植物多酚的提取，纖維素酶可以水解纖維素，從而破壞植物的細胞壁，提高多酚的提取量。胡霞等通過超聲輔助纖維素酶法提取辣木籽多酚，提取量為6.90 mg/g，同時辣木籽多酚提取物具有較好的胰脂肪酶和α-淀粉酶抑制活性。黃敏等采用超聲波輔助酶法提取香蕉皮多酚，提取率為2.989 mg/g，該提取物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌具有良好的抑制作用。

中壓制備液相色譜（medium pressure liquid chromatography，MPLC）是一種基于液相色譜原理的分離和純化技術。該技術的基本原理是將待分離的化合物溶于一定體積的移動相中，經過液相色譜柱內的填充劑層，根據不同化合物的親疏水性、極性、電荷等特性，通過與填料相互作用的方式，將混合物中的化合物分離。分離后通過收集器將純化后的化合物收集。MPLC操作對壓力和設備的要求較低，可以通過中等壓力下的流速來實現化合物的分離和純化，同時具有填料、溶劑和流速的靈活性，使得它可以適應不同化合物的特性，進行優化操作。總之，MPLC是一種靈活、高效、經濟、操作簡單的分離和純化技術，在制藥、天然產物提取、化學品純化、生物技術等領域得到廣泛應用。趙聰敏等采用中壓制備色譜技術實現甜菊糖苷單體的分離，得到RUB、DA、RC、STV純度均為80%以上，結合重結晶各單體純度大于95%。楊馥菡使用中壓制備液相色譜對迷迭香酸和咖啡酸進一步分離純化，純化得到的咖啡酸和迷迭香酸單體純度分別為98.29%和97.01%。林丹等用1.0 g純度為92.6%的茶多酚經過中壓色譜制備得到了90 mg EGC、355 mg EGCG、23 mg EC和92 mg ECG，它們的純度分別為91.8%、97.6%、97.7%、99.3%。本研究通過超聲輔助纖維素酶法提取藍莓葉多酚，得到的粗提液通過MPLC進行分離純化，以期獲得高純度的單體成分，為藍莓葉的綜合利用提供了理論依據。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

藍莓葉：采自晉中市烏金山地區；無水乙醇、甲醇、甲酸、正丁醇（均為分析純）：天津市恒興化學試劑制造有限公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）：上海阿拉丁試劑有限公司；綠原酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、3，5-二咖啡酰奎寧酸（均為標準品）：上海麥克林生化科技有限公司；硅膠板：青島海洋化工廠分廠。

1.2" 儀器與設備

BQS-08A超聲波清洗器" 杭州寶珀超聲波科技有限公司；5702RH離心機" 南京伊若達儀器設備有限公司；UV7600紫外光燈" 上海米青科實業有限公司；UV7600紫外可見分光光度計" 上海棱光技術有限公司；ZA305AS分析天平" 上海贊維衡器有限公司；BK-DI10超純水機" 上海佰博康儀器有限公司；Essentia LC-16液相色譜儀、Hypersil GOLD液相色譜柱" 日本島津公司；IsoleraTM One中壓制備色譜儀" 瑞典Biotage Sweden AB公司。

1.3" 試驗方法

1.3.1" 藍莓葉多酚的提取

將新鮮陰干的藍莓葉粉碎過80目篩得藍莓葉粉末。準確稱取1.00 g藍莓葉粉，按照料液比為1∶40（g/mL）加入體積分數為50%的乙醇溶液，再加入0.6%的纖維素酶，在55 ℃條件下超聲處理1.0 h，提取結束后在5 000 r/min條件下離心10 min。對所得上清液進行旋蒸，除去乙醇，烘干得到藍莓葉多酚粗提濃縮物。

1.3.2" 藍莓葉多酚含量的測定

取1 mL藍莓葉多酚提取液，加入5 mL 10%的福林酚溶液，搖勻，反應5 min，加入4 mL 7.5%的碳酸鈉溶液，避光靜置60 min，以空白對照作為參比液，在760 nm波長處測定吸光度，并以沒食子酸標準曲線方程計算多酚含量，計算公式如下：

多酚提取量（mg/g）=C×V×N×0.001M。

式中：C為沒食子酸濃度（μg/mL）；V為提取液體積（mL）；N為稀釋倍數；M為樣品質量（g）。

1.3.3" 藍莓葉多酚單體的分離

1.3.3.1" MPLC分析條件

取1.3.1方法提取的多酚濃縮物1.00 g，按1∶40的比例加入40 mL甲醇溶液，用0.45 μm濾膜過濾后經中壓制備液相色譜儀進行分離，根據色譜峰收集流出液。

MPLC條件：SNAP Ultra C18 30 g柱；檢測波長：280 nm；流動相A：水，流動相B：乙腈；梯度設置：0～3 min，95%～60% A，5%～40% B；3～18 min，60%～52% A，40%～48% B；18～25 min，52%～48% A，48%～52% B；25～30 min，48%～42% A，52%～58% B。

1.3.3.2" 單因素試驗

分別以流動相、進樣量、流動相流速為單因素，考察各因素對出峰時間、單次制備時間、峰形、純度的影響。

a.不同流動相對分離效果的影響

控制進樣量為6 mL，流動相流速為10 mL/min，考察不同流動相（A：水，B：甲醇；A：水，B：乙腈；A：0.2%甲酸-水，B：乙腈）對藍莓葉多酚單體分離的影響。

b.不同進樣量對分離效果的影響

控制流動相A：水，B：乙腈，流動相流速為10 mL/min，考察進樣量分別為4，6，8 mL對藍莓葉多酚單體分離的影響。

c.不同流動相流速對分離效果的影響

控制流動相A：水，B：乙腈，進樣量為6 mL，考察流動相流速分別為5，10，15 mL/min對藍莓葉多酚單體分離的影響。

1.3.4" 純度檢測與組分分析

采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析藍莓葉粗提物以及經MPLC分離出來的各組分。色譜條件：Hypersil GOLD柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃；檢測波長：280 nm；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；流動相A：乙腈，流動相B：0.2%甲酸-水。按如下梯度進行洗脫：0～10 min，15%～50% A；10～20 min，50%～100% A；20～25 min，100% A；25～27 min，100%～15% A；27～40 min，15% A。采用峰面積歸一化法計算純度。通過對比各組分與標品的保留時間，對組分進行初步定性。

2" 結果與分析

2.1" 藍莓葉多酚單體的分離

2.1.1" 不同流動相對分離效果的影響

考察了流動相分別為甲醇-水溶液、乙腈-0.2%甲酸-水溶液和乙腈-水溶液時藍莓葉多酚的分離情況，進樣量、流動相流速的固定水平分別為6 mL、10 mL/min，其他條件相同，制備色譜見圖1。

比較不同流動相的MPLC圖發現，流動相的選擇對峰與峰之間的分開程度有較大的影響。不同流動相下的具體分離指標見表1。

由圖1中A和表1可知，以甲醇-水作為流動相時，圖中出現了明顯拖尾現象，經HPLC檢測發現綠原酸的純度較低，這是因為甲醇是一種極性較小的溶劑，其對固相表面的吸附力較小。相反，水是一種極性較大的溶劑，其對固相表面的吸附力較大，兩者的相互作用不穩定。因此，以甲醇-水作為流動相時，綠原酸可能會在洗脫過程中不充分地從固相中洗脫，導致其保留時間增加，從而形成拖尾現象。此外，甲醇-水體系對綠原酸的分離能力相對較弱，從而影響純度和分離效果，導致綠原酸的純度較低。

由圖1中B和表1可知，流動相的消耗量減少，但是經HPLC檢測發現綠原酸的純度較低，僅為81.74%。這可能是因為甲酸會影響綠原酸的質子化狀態，使其形成不同的離子態，導致分離不完全。其次，甲酸為一種弱酸，可以與水反應生成甲酸根離子和氫離子，從而改變流動相的pH值。分離柱中的柱填料和綠原酸本身都帶有電荷，其電荷狀態隨著pH值的改變而改變。因此，甲酸的存在可能會影響柱填料與綠原酸之間的相互作用力，從而影響分離效果。同時甲酸本身是一種有機物質，可能與綠原酸競爭吸附于柱填料表面，這會使綠原酸在柱填料表面的停留時間減少，進而影響其分離效果。

由圖1中C和表1可知，流動相為乙腈-水時，峰形對稱，且沒有拖尾現象，有利于收集，得到的綠原酸純度顯著提高，可達94.98%，這是因為在乙腈-水混合溶劑中，乙腈和水的極性相似，因此它們之間的相互作用強，使得乙腈-水混合溶劑在分離極性物質時具有較好的分離效果，因此得到的綠原酸純度高。

綜上所述，選擇乙腈-水作為流動相。

2.1.2" 不同進樣量對分離效果的影響

進樣量分別為4，6，8 mL，流動相成分、流動相流速的固定水平分別為乙腈-水溶液、10 mL/min，其他條件相同，制備色譜見圖2。不同進樣量下的具體分離指標見表2。

由圖2中A、B和表2可知，當進樣量由4 mL增加到6 mL時，分離速度加快，經HPLC檢測發現綠原酸的純度顯著提高，可達94.98%，這是因為進樣量的增加會增加吸附相上的物質數量，進而增加吸附相和洗脫相之間的物質轉移速率，從而加快分離速度。

由圖2中B、C和表2可知，當進樣量由6 mL增加到8 mL時，進樣量過高導致柱的過載，而色譜柱中的填料數量是有限的，當進樣量過大時，填料中的空隙會被樣品占據，造成填料不均勻堆積，甚至超出了填料的容積，導致相互作用力失衡，進而導致分離效果下降，經HPLC檢測，綠原酸的純度降低，僅為88.21%。同時，進樣量超過色譜柱的處理能力后，導致一些未被完全分離的物質進入檢測器，從而出現了雜峰。

綜上所述，當進樣體積為6 mL時，分離速率和綠原酸純度最高，且沒有雜峰影響。

2.1.3" 不同流動相流速對分離效果的影響

考察了流動相流速分別為5，10，15 mL/min，流動相成分、進樣量的固定水平分別為乙腈-水溶液、6 mL，其他條件相同，制備色譜見圖3。不同流動相流速下的具體分離指標見表3。

由圖3中A、B和表3可知，當流動相流速由5 mL/min增加到10 mL/min時，出峰時間明顯減少，峰寬度降低，這是因為增加流速提高了流動相在柱內的流動速度，加快了溶液中各組分在色譜柱上的傳遞速度，從而達到快速分離的目的。流速為10 mL/min時，綠原酸的純度顯著提高，可達94.98%。

由圖3中B、C和表3可知，當流動相流速由10 mL/min增加到15 mL/min時，出峰時間明顯減少，峰寬度降低，這可能是因為流速過高時，柱內物質分離的時間變短，各組分之間的分離不充分，導致分離效率降低，綠原酸的純度僅為79.31%。同時峰形變得不對稱，峰頂變窄，甚至產生雜峰現象，這是因為在高流速下，組分在色譜柱中的停留時間變短，各組分的分離程度降低，導致相鄰峰之間出現交錯和重疊。此外，過高的流速還會增加柱的背壓，加速色譜柱的磨損，減少使用壽命，同時增加耗材成本。

綜合考慮，選擇流動相流速為10 mL/min進行后續研究。

2.1.4" 最佳條件下的試驗結果

通過上述優化試驗，得到MPLC分離純化的最佳條件為乙腈-水溶液作為流動相、進樣量6 mL、流動相流速10 mL/min，在最佳條件下綠原酸的得率和純度分別為21.39%、94.98%。在該條件下得到的中壓制備色譜圖見圖4。

2.2" 分離組分的HPLC檢測

收集圖4中峰1物質以及粗提物、標準品進行HPLC分析，結果見圖5。通過對比標準品和粗提物的HPLC圖可以發現，藍莓葉多酚的主要成分為綠原酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、3，5-二咖啡酰奎寧酸。通過MPLC可以將綠原酸與其他成分較好地分開，達到分離純化的效果。

由圖5可知，綠原酸標準品的保留時間為5.799 min；槲皮素-3-O-葡萄糖苷標準品的保留時間為8.221 min；3，5-二咖啡酰奎寧酸標準品的保留時間為9.354 min。藍莓葉粗提物中綠原酸的保留時間和純度分別為5.734 min、38.81%；槲皮素-3-O-葡萄糖苷的保留時間和純度分別為8.257 min、11.25%；3，5-二咖啡酰奎寧酸的保留時間和純度分別為9.377 min、8.83%。通過與標準品對比發現MPLC分餾得到的峰1物質為綠原酸，其保留時間和純度分別為5.777 min、94.98%，由此分析可得，經MPLC分離后綠原酸的純度顯著提高，為粗提物純度的2.45倍。

3" 結論

本文通過超聲輔助纖維素酶的方法得到藍莓葉多酚粗提物，通過HPLC分析可知其主要成分為綠原酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、3，5-二咖啡酰奎寧酸。考察了不同流動相、進樣量、流動相流速對分離效果的影響，確定MPLC分離純化綠原酸的條件為乙腈-水溶液為流動相、進樣量6 mL、流動相流速10 mL/min，該純化過程需13.3 min，綠原酸得率為21.39%。經HPLC測定，在該條件下得到的綠原酸純度為94.98%。結果表明，該方法可以高效地從藍莓葉中分離純化綠原酸，為后續在食品添加劑、功能保健食品、化妝品等方面的應用提供了有力的支持。

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