秀珍菇殘次菇超聲酶解工藝優化及揮發性風味成分分析

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.07.004

引文格式：宋心鵬，陳壽輝，馮夢媛，等.秀珍菇殘次菇超聲酶解工藝優化及揮發性風味成分分析.中國調味品，2024，49（7）：24-31.

SONG X P， CHEN S H， FENG M Y， et al.Optimization of ultrasonic enzymatic hydrolysis process and analysis of volatile flavor components of defective Pleurotus geesteranus.China Condiment，2024，49（7）：24-31.

摘要：為提高秀珍菇副產物的附加值，利用秀珍菇殘次菇制備調味基料，篩選適宜的蛋白酶酶解秀珍菇殘次菇，基于水解度、模糊數學評定法設計單因素試驗和響應面法優化超聲波耦合蛋白酶酶解的工藝參數，分析酶解產物的抗氧化性和揮發性風味成分。結果表明，超聲酶解最佳工藝條件為料液比1∶30、酶添加量1.5%、pH 7.0、溫度47 ℃、時間72 min、超聲功率420 W。在此條件下，秀珍菇水解度、酶解產物得率和綜合評分分別為（51.98±3.82）%、（71.83±3.61）%、98.04±3.58；酶解后的總氨基酸含量、抗氧化活性都有顯著提高（P＜0.05）；主要揮發性成分蘑菇醇含量顯著增加，月桂烯含量顯著減少，且新增了12種揮發性香氣成分。該研究結果為秀珍菇殘次菇制備調味基料提供了理論和技術支持。

關鍵詞：秀珍菇殘次菇；酶解液；響應面優化；抗氧化能力；揮發性成分

中圖分類號：TS201.25""""" 文獻標志碼：A""""" 文章編號：1000-9973（2024）07-0024-08

Optimization of Ultrasonic Enzymatic Hydrolysis Process and Analysis of

Volatile Flavor Components of Defective Pleurotus geesteranus

SONG Xin-peng1， CHEN Shou-hui2， FENG Meng-yuan2，3， CHEN Zong-zhong4， LI Yi-bin2*

（1.College of Life Sciences， Fujian Normal University， Fuzhou 350117， China; 2.Institute of Agricultural

Products Processing， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou 350004， China; 3.Jinshan

College of Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350003， China;

4.Fujian Innovation Food Technology Co.， Ltd.， Fuzhou 350101， China）

Abstract： In order to improve the added value of Pleurotus geesteranus by-products， defective Pleurotus geesteranus is used to prepare seasoning basic material， and suitable protease is screened for enzymatic hydrolysis of defective Pleurotus geesteranus.Based on the degree of hydrolysis and fuzzy mathematics evaluation method， single factor test and response surface method are designed to optimize the process parameters of ultrasonic coupled protease enzymatic hydrolysis， and the antioxidant activity and volatile flavor components of enzymatic hydrolysates are analyzed. The results show that the optimal process conditions of ultrasonic enzymatic hydrolysis are solid-liquid ratio of 1∶30， enzyme addition amount of 1.5%， pH of 7.0， temperature of 47 ℃， time of 72 min and ultrasonic power of 420 W. Under these conditions， the degree of hydrolysis， the yield of enzymatic hydrolysates and the comprehensive score of Pleurotus geesteranus are （51.98±3.82）%， （71.83±3.61）% and 98.04±3.58 respectively. The total amino acid content and antioxidant activity after enzymatic hydrolysis both significantly increase （Plt;0.05）. The content of main volatile component 1-octen-3-ol increases significantly， the content of myrcene decreases significantly， and 12 new volatile aroma components appear.The research results have provided theoretical and technical support for the preparation of seasoning basic material with defective Pleurotus geesteranus.

收稿日期：2024-02-26

基金項目：福建省科技計劃-創新資金項目（2022C0028）；福建省人民政府-中國農業科學院農業高質量發展超越“5511”協同創新工程項目（XTCXGC2021014）；福建省財政專項-科技創新團隊項目（CXTD2021018-2）

作者簡介：宋心鵬（1998—），男，碩士，研究方向：食品生物技術。

*通信作者：李怡彬（1981—），男，研究員，博士，研究方向：食品科學。

Key words： defective Pleurotus geesteranus; enzymatic hydrolysate; response surface optimization; antioxidant capacity; volatile components

秀珍菇（Pleurotus geesteranus）富含多種氨基酸與呈味物質，還含有多糖、黃酮等生物活性成分，因此具有較高的保健價值。但其在生產加工中存在小分子呈味物質提取不完全、營養成分損失嚴重、綜合利用率低、主要非揮發性呈味物質呈味效果差、產品質量低等問題。秀珍菇殘次菇作為粗加工過程中的副產物，常被當作飼料等低價值產品，但其蛋白質與呈味物質含量較高，因此，需要開發相關產品來提高其利用價值。

廖茜妤研究發現，秀珍菇蛋白堿性蛋白酶水解物富含疏水性、陰離子和芳香族氨基酸，表現出優越的抗氧化活性。方若思等研究了不同酶解條件對秀珍菇鮮味菇液的影響，并采用響應面法優化酶解工藝，以水解度為指標，得出最優酶解條件為酶解溫度42 ℃、pH 7.30、纖維素酶用量0.10%，該條件下水解度為18.51%。陳雅平以氨基酸利用率為評價指標，通過單因素試驗和正交試驗，得到最佳酶解條件為復合風味酶用量0.5%、酶解時間120 min、酶解溫度50 ℃、pH 8.5，秀珍菇氨基酸利用率為27.9%。Chen等發現多次酶解后的扁豆酶解液比扁豆水提液具有更高的鮮味強度和適口性。以上研究結果表明生物酶解制備秀珍菇調味料是精深加工秀珍菇的重要途徑。

本文以秀珍菇殘次菇為原料，探究超聲波耦合生物酶酶解對其水解度和水解產物得率的影響，比較分析秀珍菇酶解液的氨基酸含量、抗氧化能力和揮發性風味成分，旨在為高效利用秀珍菇殘次菇生產優質營養調味基料提供理論和技術支持。

1" 材料和方法

1.1" 材料

秀珍菇殘次菇：產自福建省寧德市古田縣，粗蛋白含量29.42 g/100 g，水分含量13.06%，用中藥粉碎機粉碎后備用。

1.2" 試劑

乙酰丙酮（分析純）：上海易恩化學技術有限公司；氫氧化鈉、無水乙酸鈉、鹽酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；乙酸（優級純）、甲醛、硫酸銨（均為分析純）：西隴化工股份有限公司；菠蘿蛋白酶（300 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（80 U/mg）、堿性蛋白酶（20 U/mg）、復合蛋白酶（10 U/mg）、總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；DPPH自由基清除能力試劑盒、總氨基酸（T-AA）測定試劑盒（比色法）：南京建成科技有限公司。

1.3" 主要儀器與設備

TU-1810紫外可見分光光度計" 北京普析通用儀器有限責任公司；DF-101S電熱恒溫水浴鍋" 上海力辰邦西儀器科技有限公司；XS105 電子分析天平" 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GL-10MD離心機" 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；ST3100 pH計" 奧豪斯儀器（常州）有限公司；KQ-600DV型超聲波清洗機" 昆山市超聲儀器有限公司；LDZF-30L-Ⅲ高壓蒸汽滅菌鍋" 上海申安醫療器械廠；Foss-Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀" 福斯分析儀器（蘇州）有限公司；JC-8890氣相色譜儀" 青島聚創環保集團有限公司。

1.4" 方法

1.4.1" 工藝流程

秀珍菇殘次菇→粉碎→取樣、配制、混勻→調節適宜pH、加酶→調節超聲功率與溫度→超聲波耦合蛋白酶酶解提取→沸水浴滅酶→離心→取上清液備用。

1.4.2" 蛋白酶的篩選

按照設定的工藝流程，對比5種蛋白酶對秀珍菇的酶解效果，稱取3 g秀珍菇樣品，設定料液比為1∶30、超聲功率為200 W，在表1中所列的各蛋白酶的最適條件下，提取60 min后沸水浴滅活，離心取上清液，以水解度為指標，篩選出最優蛋白酶進行下一步試驗，以不加酶、不調整pH、提取溫度為50 ℃為空白對照。

1.4.3" 單因素試驗設計

以復合蛋白酶為酶制劑，固定料液比1∶20、超聲功率360 W、pH 7.0、酶添加量1.5%、提取溫度50 ℃、酶解時間60 min，以水解度為指標，考察料液比（1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40）、超聲功率（240，300，360，420，480 W）、pH（6，6.5，7，7.5，8）、酶添加量（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）、提取溫度（40，45，50，55，60 ℃）、酶解時間（30，45，60，75，90 min）對秀珍菇酶解效果的影響。

1.4.4" 響應面試驗設計

根據Box-Behnken中心組合設計原理，在單因素試驗的基礎上，固定料液比為1∶30、酶添加量為1.5%，以pH、提取溫度、酶解時間、超聲功率為自變量，以水解度和酶解產物得率為指標，根據模糊數學評定方法得到的酶解液最優工藝綜合評分為響應值，進行四因素三水平的響應面分析，試驗因素水平見表2。

1.4.5" 秀珍菇酶解液的模糊綜合評價

參考孟甜等的方法，設待評價的試驗組別集為X=（x1，x2，…，x29）。影響秀珍菇酶解液最優工藝的因素集為U=（u1，u2），其中，u1表示水解度，u2表示酶解產物得率。權重集A={a1（0.6）、a2（0.4）}。對于組別xi∈X，按第j個因素uj∈U進行測度，得到條件xi下關于因素uj的數據xij，從而構成模糊數學中的信息矩陣R=（xij）29×2。響應變量Y為根據水解度和酶解產物得率在最優工藝中的重要性加權求和得到的綜合評分，綜上可得關于秀珍菇酶解液最優工藝模糊評定綜合評分公式（1）：

Yi=xi1xi1max×a1＋xi2xi2max×a2（i=1，2，…，29）。（1）

式中：xi1max表示在影響因素u1下，xi1（i=1，2，…，29）中的最大值，xi2max表示在影響因素u2下，xi2（i=1，2，…，29）中的最大值。

1.4.6" 酶解產物得率

酶解產物得率按公式（2）計算：

酶解產物得率（%）=酶解產物冷凍干燥后質量（g）秀珍菇樣品質量（g）×100%。（2）

1.4.7" 水解度的測定

水解度（DH）的測定參考桂海佳等的方法，按公式（3）計算：

水解度（%）=水解液中的游離氨基酸量（g/100 g）水解液中的總氮量（g/100 g）×100%。（3）

參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中的第一法凱氏定氮法測定秀珍菇蛋白含量。

參考GB 5009.235—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸態氮的測定》中的第二法比色法測定總氨基酸態氮含量。

1.4.8" 總氨基酸含量的測定

根據南京建成科技有限公司的總氨基酸（T-AA）測定試劑盒（比色法）進行總氨基酸含量的測定。

1.4.9" 抗氧化活性的評價

1.4.9.1" DPPH自由基清除能力的測定

根據南京建成科技有限公司的DPPH自由基清除能力試劑盒進行DPPH自由基清除能力的測定。

1.4.9.2" 總抗氧化能力的測定

根據北京索萊寶科技有限公司的總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒進行總抗氧化能力的測定。

1.4.10" 揮發性成分的測定

氣相色譜條件：DB-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣溫度：260 ℃；分流比：不分流；載氣：氦氣；流速：1 mL/min；柱溫：40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，以20 ℃/min升至250 ℃，保持2 min；接口溫度：260 ℃；離子源：EI源；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；電子能量：70 eV；質量掃描范圍（m/z）：40～550 amu。

2" 結果與分析

2.1" 不同蛋白酶對秀珍菇酶解效果的影響

由圖1可知，5種蛋白酶的添加都能使秀珍菇水解度得到顯著提升，其中堿性蛋白酶與復合蛋白酶的效果最好，分別比對照組提高47.5%和52.43%，且復合蛋白酶是以堿性蛋白酶為主要酶的一種復合酶，這說明在添加單一蛋白酶的情況下堿性蛋白酶對秀珍菇的水解效果較好。張柳蓮等在制備肉桂秀珍菇酶解液時也發現堿性蛋白酶的酶解效果最好。由于復合蛋白酶酶解秀珍菇的水解度明顯高于其他單一酶，選擇復合蛋白酶為秀珍菇酶解的最佳生物酶。

2.2" 單因素試驗設計

2.2.1" 酶解時間對秀珍菇酶解效果的影響

由圖2可知，隨著酶解時間的增加，秀珍菇的水解度先升高后略有降低，在酶解75 min時水解度達到最大值。酶解時間越長意味著反應物有更多的時間發生水解反應，從而產生更多的產物，然而過長的酶解時間可能導致底物濃度下降或產生其他負面影響，從而降低了水解度。因此，選擇75 min為最適酶解時間。

2.2.2" pH對秀珍菇酶解效果的影響

pH是影響酶活力的主要因素之一。由圖3可知，隨著pH的增加，水解度呈先升高后降低的趨勢，pH為7時達到最大值。酶在最適pH下活力最高，復合蛋白酶水解秀珍菇的最適pH為7，此pH下復合蛋白酶水解秀珍菇的能力最強。

2.2.3" 酶添加量對秀珍菇酶解效果的影響

由圖4可知，隨著酶添加量的增加，水解度呈先升高后降低的趨勢，酶添加量過高可能導致酶過度活化，使酶失活，降低其催化活性，從而降低酶解效率，酶添加量過低可能導致酶解不完全，影響產品的質量和純度。因此，選擇1.5%為最適復合酶添加量。

2.2.4" 提取溫度對秀珍菇酶解效果的影響

溫度是影響酶解反應速率的重要因素之一。由圖5可知，隨著提取溫度的上升，水解度呈先升高后降低的趨勢，溫度的升高可以增加分子的熱運動，加快反應速率，然而，當提取溫度超過酶的適宜溫度范圍時，酶的構象可能發生改變，導致酶失活 。因此，選擇50 ℃為復合蛋白酶酶解的最適提取溫度。

2.2.5" 超聲功率對秀珍菇酶解效果的影響

由圖6可知，隨著超聲功率的增加，水解度呈先上升后下降的趨勢，在420 W時達到最大值37.71%，當超聲功率超過420 W時，水解度開始下降。這可能是由于超聲波能增加液體流動性，促進酶與底物之間的相互作用，加快反應速率，從而提高了蛋白水解率，但過高的超聲功率會導致生物酶分子的空間構象發生改變，從而影響其催化活性和穩定性，降低酶解反應速度。因此，選擇420 W為秀珍菇酶解的最佳超聲功率。

2.2.6" 料液比對秀珍菇酶解效果的影響

由圖7可知，隨著料液比的增加，水解度先逐漸增大后趨于平緩，當料液比為1∶30時，水解度達到最大值42.76%，但更高的料液比未使水解度進一步提升。這可能是因為當料液比較低時底物濃度過高，水解液的黏度過大，影響酶的擴散，對酶解反應有抑制作用，而過高的料液比會產生稀釋效應，導致酶與底物的有效碰撞減少。因此，選擇1∶30為最適料液比。

2.3" 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇pH、提取溫度、酶解時間、超聲功率為自變量，以水解度和酶解產物得率為指標，以綜合評分為響應值，根據Box-Behnken法設計原理，采用Design-Expert 13軟件進行試驗設計，優化超聲波耦合生物酶水解秀珍菇工藝，確定最佳工藝參數，Box-Behnken試驗設計與結果見表3。

運用 Design-Expert 13軟件對表8中的數據進行二次多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程：Y=95.82－1.94A-2.66B－1.4C－2.72D+2.02AB－2.02AC－0.107 5AD+2.87BC－1.42BD+2.57CD－5.11A2－4.13B2－4.55C2－4.66D2。

對響應值的二次模型進行方差分析，結果見表4，模型的Plt;0.01，說明本實驗擬合得到的二次多項模型具有極顯著性，且失擬項的P=0.054 0gt;0.05，說明模型的失擬項不顯著，具有統計學意義，同時該回歸模型的相關系數R2=0.812 0，表明該模型的擬合程度較好，可用來分析響應值與因素值的關系及變化情況，能夠較好地分析不同酶解條件對秀珍菇酶解液水解度與酶解產物得率的影響，在4個因素中，提取溫度和超聲功率影響顯著（Plt;0.05），結合F值可知4個因素對綜合評分的影響順序為超聲功率gt;提取溫度gt;pHgt;酶解時間。

超聲功率、提取溫度、pH和酶解時間這4個因素間有交互作用，對其進行響應面分析，響應曲面圖見圖8。隨著超聲功率、提取溫度、pH和酶解時間的增加，綜合評分先增大后減小，這與單因素試驗結果一致。

通過模型預測超聲波耦合生物酶酶解法提取秀珍菇酶解液的最優工藝條件為pH 7.045、提取溫度47.27 ℃、酶解時間71.99 min、超聲功率416.99 W，綜合評分的預測值為96.295。考慮到實際情況，對上述條件進行修正，最終的優化條件為pH 7.0、提取溫度47 ℃、酶解時間72 min、超聲功率420 W，在此條件下進行3次平行試驗驗證，秀珍菇水解度、酶解產物得率和綜合評分分別達到（51.98±3.82）%、（71.83±3.61）%、98.04±3.58，與理論預測值較接近，說明該模型對秀珍菇酶解液制備工藝的優化具有一定的參考意義。

2.4" 秀珍菇酶解液氨基酸含量與抗氧化活性分析

由表5可知，酶解后總氨基酸含量顯著增加，這可能是在酶解過程中，堿性蛋白酶可以有效地將蛋白質水解為小分子的肽和氨基酸，同時隨著蛋白質的水解，原本被蛋白質所包埋的氨基酸被釋放出來，導致秀珍菇酶解液中總氨基酸含量增加。

DPPH自由基清除能力與總抗氧化能力的增強可能與酶解過程中釋放出的小分子肽、多肽和氨基酸有關，這些小分子物質可能具有較高的抗氧化活性。秀珍菇蛋白經酶解后可能會產生更多的生物活性底物，這些底物提供電子并與自由基反應，將其轉化成更穩定的物質，從而終止了自由基鏈式反應，這有助于清除體內的自由基，減少氧化損傷，從而提高酶解液的抗氧化能力。

2.5" 秀珍菇酶解液揮發性成分分析

由表6可知，酶解前后共有65種揮發性物質，酶解后新增了12種揮發性物質，減少了17種揮發性物質，主要包括14種醇類、5種烯烴類、12種醛類、3種酮類、3種芳香烴類、4種酯類、22種烷烴類以及2種其他類物質。

酶解后醇類物質中相對含量呈顯著上升趨勢的是蘑菇醇，是秀珍菇的主要氣味來源之一，酶解后還出現了2-丙基-1-戊醇、3-己炔-1-醇等具有芳香味的物質。烯烴類化合物中，月桂烯含量在酶解后顯著下降，可能是由于烯烴類化合物可參與到多種化學反應中，其中包括與氧氣、水或其他分子發生氧化、水解、加成等反應，從而生成醛類、酮類物質，這些化合物對食品的香味和口感都會產生影響。醛類化合物和酮類化合物在化學結構上非常相似，味道卻有所不同，一般來說，醛類化合物通常具有較刺激的味道，而酮類化合物通常具有較柔和香甜的味道。烷烴類化合物大多數穩定性較高，通常表現為香氣較弱或無香氣。

3" 結論

通過超聲波耦合生物酶技術水解秀珍菇殘次菇，篩選有效單因素并結合模糊數學評定法對秀珍菇的水解度與酶解產物得率進行綜合評分，以綜合評分為響應值進行響應面優化試驗，結果表明，超聲功率和提取溫度對秀珍菇的水解度和酶解產物得率均有顯著影響（P＜0.05），且主次順序為超聲功率＞提取溫度＞pH＞酶解時間。得出酶解液最佳提取工藝為pH 7.0、提取溫度47 ℃、酶解時間72 min、超聲功率420 W，在此條件下，秀珍菇水解度、酶解產物得率和綜合評分分別達到（51.98±3.82）%、（71.83±3.61）%、98.04±3.58，表明本試驗建立的回歸模型具有參考性；酶解后，總氨基酸含量、抗氧化活性都顯著提高（P＜0.05）；主要揮發性成分蘑菇醇顯著增加，而月桂烯顯著減少，并新增了12種揮發性香氣成分。這些研究結果為利用秀珍菇殘次菇等低價值副產物開發調味基料產品提供了科學依據，從而提高了秀珍菇副產物的利用價值。

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