滇產刺梨多糖的提取純化及其結構分析

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.07.029

引文格式：楊紫焰，李倩倩，李自霖，等.滇產刺梨多糖的提取純化及其結構分析.中國調味品，2024，49（7）：192-199，207.

YANG Z Y， LI Q Q， LI Z L， et al.Extraction， purification and structure analysis of polysaccharides from Rosa roxburghii Tratt. produced in Yunnan province.China Condiment，2024，49（7）：192-199，207.

摘要：目的：探討刺梨多糖提取和純化的方法。方法：采用熱水提取醇沉法從刺梨果實中提取多糖，在單因素實驗的基礎上，以響應面實驗對刺梨多糖的提取工藝進行優化。采用Cellulose DEAE-52和Sephadex G-100柱對刺梨粗多糖進行分離純化，Sevage法脫蛋白，D-101吸附樹脂脫色素，FT-IR、HPGPC和HPLC測定分子量和單糖組成。結果：刺梨多糖是一種以Glc為主要成分的均一性酸性多糖。

關鍵詞：刺梨多糖；提取純化；脫蛋白；脫色；Cellulose DEAE-52；Sephadex G-100

中圖分類號：TS201.1""""" 文獻標志碼：A""""" 文章編號：1000-9973（2024）07-0192-08

Extraction， Purification and Structure Analysis of Polysaccharides from

Rosa roxburghii Tratt. Produced in Yunnan Province

YANG Zi-yan1， LI Qian-qian1， LI Zi-lin1， CHEN Gui-yuan1，2， ZHANG Cui-xiang1*

（1.School of Basic Medical Sciences， Dali University， Dali 671000， China; 2.Key Laboratory of

Entomology Biopharmaceutical Research and Development in Yunnan Province， Dali 671000， China）

Abstract： Objective： To study the extraction and purification methods of polysaccharides from Rosa roxburghii Tratt.. Methods： Polysaccharides are extracted from Rosa roxburghii Tratt. fruit by hot water extraction and alcohol precipitation method. On the basis of single factor experiment， the extraction process is optimized by response surface experiment. The crude polysaccharides are separated and purified by Cellulose DEAE-52 and Sephadex G-100 columns， deproteinized by Sevage method， decolorated by D-101 adsorptivon resin， and the molcecular weight and the composition of monosaccharides are determined by FT-IR， HPGPC and HPLC. Results： Rosa roxburghii Tratt. polysaccharide is a kind of homogeneous acid polysaccharide with Glc as the main component.

Key words： Rosa roxburghii Tratt. polysaccharides; extraction and purification; deproteinization; decolorization; Cellulose DEAE-52; Sephadex G-100

收稿日期：2024-01-23

基金項目：國家自然科學基金項目（31860252）；云南省自然科學基金地方高校聯合面上項目（202301BA070001-043）；云南省教育廳科學研究基金項目（2021J0337）

作者簡介：楊紫焰（1999—），女，碩士研究生，研究方向：植物多糖分離提取及功能。

*通信作者：張翠香（1979—），女，高級實驗師，研究方向：天然產物提取及生物學活性研究。

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.，RRT）是一種野生鮮果資源，俗稱刺莓果、佛朗果、文先果，廣泛分布于我國貴州、湖南、湘西、陜西、四川、云南等地，具有豐富的營養保健功能及開發和應用價值。現代研究發現刺梨果含有多酚、三萜、黃酮、維生素Ｃ、多糖、超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化物質。多糖作為一種天然活性成分，具有調節免疫力、抗腫瘤、降血糖、抑制炎癥等多種生物活性。目前關于刺梨多糖提取的研究還鮮見報道。本實驗采用熱水提取醇沉法從刺梨果實中提取多糖，以響應面法優化其提取條件，從而為刺梨多糖后續的活性研究提供一定依據。

本研究采用熱水提取結合醇沉法提取刺梨果實多糖。采用Cellulose DEAE-52和Sephadex G-100柱從刺梨中分離純化多糖。采用紫外光譜（UV）、傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、高效凝膠滲透色譜（HPGPC）和高效液相色譜（HPLC）對分離的多糖進行表征。采用DPPH和ABTS+自由基清除法測定了刺梨多糖的抗氧化活性。上述研究結果將為刺梨資源的利用和進一步開發提供科學依據。

1" 材料與方法

1.1" 儀器

FST-Ⅲ20超純水機" 杭州物微儀器有限公司；B型萬能粉碎機" 常州市寶康干燥機械有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋" 常州國華電器有限公司；BT224S電子分析天平" 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；RE-3000旋轉蒸發器" 上海亞榮生化儀器廠；SJ-3恒溫磁力攪拌器、THZ-82恒溫振蕩器" 常州智博瑞儀器制造有限公司；RXH-5-C遠紅外節能鼓風循環或不銹鋼烘箱" 上海崇明實驗儀器廠；DL-8000C冷凍離心機" 上海安亭科學儀器廠;SP-722紫外可見分光光度計" 上海光譜儀器有限公司；FD-1型冷凍干燥機" 北京博醫康技術有限責任公司。

1.2" 材料

刺梨干果原料：購自云南省大理市白族自治州中草藥批發市場，經大理大學基礎醫學院陳貴元教授鑒定為薔薇科薔薇屬。

氯化鈉、硝酸鈉、剛果紅、正丁醇、氯仿（均為分析純）、溴化鉀（光譜純）、二甲基亞砜（色譜純）：云南馳恩科技有限公司；右旋糖酐標準品：中國食品藥品檢定研究院；單糖標準品包括阿拉伯糖（Ara）、果糖（Fru）、巖藻糖（Fuc）、葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）、半乳糖（Gal）、木糖（Xyl）、半乳糖醛酸（Gal-UA）、葡萄糖醛酸（Glc-UA）：德國Sigma公司；離心管：無錫耐思生命科技股份有限公司。

1.3" 方法

1.3.1" 刺梨多糖的提取與純化

稱取適量刺梨干果研磨過篩，將干粉溶于一定體積的蒸餾水中，經石油醚脫脂（3倍體積的石油醚加熱回流2次，每次4 h），增壓沸水提取多糖，離心，減壓濃縮后用乙醇沉淀，沉淀物依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌。采用D101樹脂清除色素，Sevage法脫蛋白。置于冷凍干燥機中處理，得刺梨果多糖粗品，將粗多糖溶于去離子水中，分別用Cellulose DEAE-52和Sephadex G-100柱進行純化。氯化鈉溶液濃度分別為0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mmol/L，梯度洗脫，流速為 1 mL/min，樣品采用苯酚-硫酸法進行檢測。

1.3.2" 分子量和單糖組成的測定

分別制備濃度為2.5 mg/mL的右旋糖酐標準溶液，采用HPGPC進行分析。采用示差折光檢測器記錄譜圖，繪制保留時間-分子量標準曲線。色譜條件：Shodex OHpak SB-804 HQ 色譜柱（8 mm×300 mm），流動相 0.1 mol/L NaCl；流速 0.5 mL/min；分析時間 35 min。方法同上對樣品進行 HPGPC分析，用示差折光檢測器記錄譜圖，將分析所得的樣品保留時間代入標準曲線，計算分子量。

精密稱取干燥單糖標準品（Man、Ara、Rha、Glc、Gal、Glc-UA、Gal-UA、GlcNAc、Fuc），加入去離子水制備成1 mg/mL的混合單糖儲備溶液，分別稀釋0，10，20，50，100，200倍作為混合溶液。稱取樣品0.4 mg，加入1 mL去離子水，得到0.4 mg/mL的樣品溶液。各混合標準溶液、樣品溶液均取1 mL于試管中，加入4 mol/L三氟乙酸（TFA）混勻，于110 ℃油浴水解4 h，水解反應結束后旋蒸干燥。將干燥后的樣品進行衍生化，依次加入0.6 mol/L的NaOH溶液調節pH至11，與400 μL 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）溶液混合均勻，于70 ℃烘箱中衍生化反應1 h，冷卻至室溫，用0.3 mol/L鹽酸中和，用三氯甲烷充分萃取3次。水相離心，用0.22 μm微孔濾膜過濾，對標準品衍生化產物進行HPLC分析。

1.3.3" FT-IR和UV可見光譜分析

將刺梨干粉和干燥的溴化鉀粉末按1∶4的比例研磨，壓制成厚度為1 mm的片狀，使用紅外光譜儀在500～4 000 cm-1范圍內進行分析。精密稱取1 g 刺梨干粉溶解于100 mL去離子水中，使用紫外可見分光光度計在200～400 nm范圍內掃描。

1.3.4" 剛果紅的測定

稱取5 mg 刺梨干粉溶于1 mL去離子水和1 mL剛果紅試劑（80 μmol/L）中，逐漸加入1 mol/L氫氧化鈉溶液，使最終濃度呈梯度分布（0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/L）。采用紫外可見分光光度計檢測200～800 nm范圍內的吸收波長。

1.3.5" 葡萄糖標準曲線圖

精確稱取0.1 g干燥的葡萄糖標準品，溶于適量蒸餾水中，制備濃度為100 μg/mL的葡萄糖標準溶液。取10支無菌試管，分別加入葡萄糖標準溶液0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90 mL，定容至2 mL。各管中均加入0.2 mL 苯酚溶液和1 mL濃硫酸，混合后于室溫下靜置30 min。同一方法另取2.0 mL水，加入1.0 mL苯酚溶液和5.0 mL濃硫酸，作空白對照，測量490 nm處的吸光度值，以葡萄糖標準品質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y=1.657 9X+0.014 1（R2=0.999 4），表明在一定范圍內葡萄糖標準品質量濃度與吸光度值呈良好的線性關系。

1.3.6" 刺梨多糖提取率的測定

以去離子水為對照，在620 nm波長處測定吸光度值。用葡萄糖標準曲線計算刺梨多糖的質量濃度，多糖提取率按下式計算：

E=CVNM×100%。

式中：E為提取率（%）；C為多糖濃度（g/mL）；V為多糖體積（g）；N為稀釋比；M為原料質量（kg）。

1.4" 多糖提取的響應面實驗設計

在單因素實驗的基礎上，以總多糖提取率（Y）作為考察指標，設計四因素三水平響應面實驗，采用Design-Expert 8.0.6軟件對數據進行分析。響應面實驗因素水平見表1。

2" 結果

2.1" 各單因素對刺梨多糖提取率的影響

2.1.1" 提取時間

固定料液比為1∶30、提取溫度為60 ℃、提取次數為1次，考察提取時間分別為1，2，3，4，5 h時對多糖提取率的影響。由圖1中A可知，當提取時間為3 h時，多糖提取率最高，達到28.01%。隨著提取時間繼續延長，多糖提取率呈下降趨勢。因此，最佳提取時間為3 h。

2.1.2" 提取溫度

固定料液比為1∶30、提取時間為1 h、提取次數為1次，考察提取溫度分別為40，50，60，70，80 ℃時對多糖提取率的影響。由圖1中B可知，當提取溫度為60 ℃時，多糖提取率最大，達到27.21%。隨著提取溫度繼續升高，多糖提取率下降。因此，最佳提取溫度為60 ℃。

2.1.3" 料液比

固定提取溫度為60 ℃、提取時間為1 h、提取次數為1次，考察料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50時對多糖提取率的影響。由圖1中C可知，當料液比為1∶30時，多糖提取率最大，為31.54%。隨著料液比繼續上升，多糖提取率逐漸下降。因此，最佳的料液比為1∶30。

2.1.4" 提取次數

固定料液比為1∶30、提取溫度為60 ℃、提取時間為1 h，考察提取次數分別為1，2，3，4，5次時對多糖提取率的影響。由圖1中D可知，當提取次數為3次時，多糖提取率最大，達到28.52%。隨著提取次數繼續增加，多糖提取率下降。因此，最佳提取次數為3次。

2.2" 響應面實驗

基于單因素實驗結果，設計Box-Behnken響應面實驗，響應面實驗設計及結果見表2，方差分析結果見表3，回歸模型誤差統計分析見表4。

采用多元二次模型回歸和多元線性分析，分析A、B、C、D對響應值Y的影響，回歸方程為Y=+29.46+0.75A+0.77B－1.09C－0.97D－0.040AB+0.26AC－0.080AD－0.61BC－0.22BD－0.52CD－2.23A2－0.71B2－1.42C2－1.77D2。

由表3和表4可知，模型的Plt;0.000 1，說明該回歸方程極顯著，模型的整個回歸區域擬合較好，說明參與比較的數據來自具有差異的不同組。失擬項的P值為0.091 5（Pgt;0.05），差異不顯著，表明用二次多元回歸方程檢驗擬合良好。變異系數為2.79%，說明變量間的離散度較小。一般認為變異系數越小，回歸模型的可靠性越高。R2為0.910 6，RAdj2為0.821 2，表明變量間的線性相關程度較接近，實驗誤差較小。該實驗的信噪比為11.3，表明模型擬合良好。此外，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2對多糖提取率均有顯著的影響。以上分析結果表明，該模型可以用于分析和預測熱水提取醇沉法對刺梨多糖的提取工藝。

2.3" 刺梨多糖的分離和純化

利用葡聚糖凝膠柱Sephadex G-100對刺梨多糖溶液進行洗脫，結果見圖2，刺梨多糖洗脫曲線只有一個獨立的峰，表明多糖樣品的純化效果良好，收集峰部位洗脫液，進行濃縮、冷凍干燥，得到精制刺梨多糖。

由圖3可知，經Cellulose" DEAE-52層析柱純化，得到刺梨多糖單一組分，表明其糖含量和純度較高。收集洗脫液進行濃縮、除鹽、冷凍干燥用于后續實驗。

2.4" 刺梨多糖的分子量和單糖組成分析

采用HPGPC法測定刺梨多糖的分子量。由圖4可知分子量呈單峰，說明刺梨多糖是一種均質多糖。根據保留時間，最大分子量峰值為2.7×102 kDa。

由圖5可知，水解后的刺梨多糖有9個有意義的吸收峰。摩爾比為Man∶Rha∶GlcNAc∶Gal-UA∶Glc∶GalAc∶Xyl∶Ara∶Fuc為3.95∶2.51∶1.17∶1.00∶26.59∶13.65∶1.29∶8.62∶7.89，由此可得，刺梨是由這9個單糖組成的。在單糖組成分析中，Glc占比最大，說明刺梨多糖是一種以葡萄糖為主要成分的酸性多糖。

2.5" FT-IR和UV可見光譜測定

由圖6可知，刺梨多糖在3 418 cm-1處有寬而大的吸收峰，為OH的伸縮振動，在2 941 cm-1處有吸收峰，為次甲基（CH2）中CH的伸縮振動，在1 741，1 630" cm-1處有吸收峰，為羧酸鹽的伸縮振動，在1 435，1 009 cm-1處有吸收峰，為COC的伸縮振動。上述結果表明刺梨多糖是一種含有羧酸的酸性多糖（見圖6中A），與單糖組成結果一致。此外，在260～280 nm處無特征性吸收峰，說明刺梨多糖不含蛋白質和核酸（見圖6中B）。

2.6" 剛果紅實驗

剛果紅可以與具有三螺旋結構的刺梨多糖絡合。由圖7可知，與剛果紅溶液相比，該混合物的最大吸收波長發生了紅移，這意味著刺梨多糖具有三螺旋構象。

2.7" 各因素交互作用對刺梨多糖提取率的影響

采用 Design-Expert 8.0.6軟件對表2中數據繪制響應面圖，見圖8。響應面圖和等高線圖可直觀反映各因素的交互作用程度，即響應面坡度越陡，因素的交互作用影響越顯著;坡度越平緩，因素的交互作用影響越不顯著。等高線形狀越接近于橢圓形，因素的交互作用影響越顯著；形狀越接近于圓形，因素之間的相互作用影響越不顯著。響應面設計能夠通過更直觀的圖形、精密度較高的數學模型獲得最佳工藝。

2.8" 驗證實驗

為了將提取工藝運用于實際實驗操作，需要選擇實驗設計、擬合函數對擬合的回歸模型的精度進行評價并對得出的數據進行預測。采用Design-Expert 8.0.6軟件預測多糖的最佳提取工藝：提取時間3.14 h，提取溫度68.01 ℃，料液比1∶25，提取次數2.74次。考慮到實際操作，將提取工藝調整為提取時間3 h、提取溫度70 ℃、料液比1∶30、提取次數3次，平行3組實驗，多糖提取率為（30.56±0.89）%，理論值為30.22%，誤差為1.12%。結果表明，采用響應面法優化的刺梨多糖提取工藝穩定可行。

2.9" 抗氧化能力測定

2，2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）脫色實驗是估計食品、植物提取物和生物液體的抗氧化能力以及單個化合物的抗氧化活性最常用的方法之一。在細胞信號傳導中，活性氧，特別是過氧化氫，可以作為第二信使。許多癌細胞在惡性轉化過程中不斷產生內在活性氧，從而保持了致瘤表型，促進了腫瘤的發展。氧化應激及其產生的氧化損傷是癌癥發生和發展的重要因素，當活性氧產生過多，無法使機體的防御系統維持平衡時，將會導致嚴重的代謝功能障礙。抗氧化劑在許多疾病的預防方面有重要作用，DPPH是一種自由基，具有非常穩定的氮中心，現已廣泛應用于抗氧化研究中，其易與具有氫鍵供體的化合物發生電子轉移反應。自由基與某些生理活性物質的調控和炎癥免疫過程有密切關系， 自由基引起的細胞氧化損傷同樣作用于免疫系統，從而引起免疫功能降低。由圖9可知，刺梨多糖對ABTS+自由基與DPPH自由基均有一定的清除能力。

3" 討論

多糖由單糖通過糖苷鍵連接而成，糖苷鍵對酸堿敏感，易發生斷裂，所以若提取工藝不合理可能會使多糖因糖苷鍵斷裂而發生部分水解，導致多糖提取率降低。因此，提取工藝是實現多糖高提取率的關鍵。云南省因其獨特的地理位置和氣候為天然植物研究提供了地理優勢。多糖是天然植物的有效活性成分之一，是一種可溶于水的生物大分子。多糖的提取方法有很多，可根據多糖的不同性質選擇不同的提取方法。植物多糖具有多種生物活性，現已掌握多種多糖提取方法，在提取過程中，不同的提取方法或條件對多糖的活性及構象可造成不同的影響。多種疾病的發生發展均與自由基有著密切的關系，當機體生理功能紊亂時，可導致機體的器官受到不同程度的損害，從而影響人體健康。范露露等采用超聲輔助水提醇沉法提取柳芽粗多糖（CPW），并運用響應面分析法進行優化，發現不同濃度的CPW能夠有效清除 DPPH 自由基并抑制·OH 和 O2- ·的產生。劉夢培等利用微波輔助法從杜仲葉中提取多糖，分析杜仲葉多糖的結構組成，發現不同杜仲葉多糖均有良好的抗氧化活性。Chen等采用熱水提取法從苦瓜中提取出苦瓜多糖（MCP），并研究了多糖對超氧陰離子自由基、羥基自由基和DPPH自由基的清除能力以及抗脂質過氧化和還原能力。黃芪多糖有抗衰老、增強免疫力、抗腫瘤、抗病毒、降血糖等作用，其通過誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞的增殖和轉移來抗腫瘤。當歸多糖對體內外多種癌細胞均有抑制作用，可通過調節信號通路抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡，調控腫瘤基因表達，提高機體免疫應答。當前研究表明，多糖作為調味品和營養劑已成為食品工業研究的熱點。將植物多糖應用于肉制品中不僅可以改進產品的色澤、提高口感，而且能降低肉制品中的脂肪含量，促進健康。可溶性大豆多糖不僅有巨大而廉價的原料來源，而且有著廣泛的應用場景。生姜多糖能鎖住雞肉丸中的水分，維持肉丸的彈性，還能抑制在冷藏期間雞肉丸的氧化。響應面法（response surface methodology，RSM）被認為是一種用于揭示工藝參數及其相互作用的有效統計技術。以響應面實驗對刺梨多糖進行初步純化，并以Cellulose DEAE-52和Sephadex G-100柱對刺梨多糖進一步純化處理。VC是良好的抗氧化劑，具有豐富的微量元素和較好的美白效果。研究結果表明，純化多糖對氧化劑具有抑制性，將其作為天然、低廉的抗氧化劑，在食品和保健品中進一步開發應用，使其更具商業價值。

4" 結論

本研究采用熱水提取醇沉法從刺梨果實中提取多糖，利用響應面實驗設計確定刺梨多糖提取的最優條件，并對刺梨多糖的分離純化及其活性組分進行了初步探討。結果表明，HPGPC測定刺梨多糖的分子量約為2.7×102 kDa，化學分析表明刺梨多糖主要由Glc組成，為含有羧酸的均一性酸性多糖，具有三螺旋結構。本文為刺梨多糖的后續活性研究及刺梨的臨床使用奠定了一定的理論基礎。

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