超聲輔助提取竹葉黃酮及提取機理研究

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.07.028

引文格式：程濤，李仕魯，陳德勇，等.超聲輔助提取竹葉黃酮及提取機理研究.中國調味品，2024，49（7）：184-191.

CHENG T， LI S L， CHEN D Y， et al.Study on ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from bamboo leaves and extraction mechanism.China Condiment，2024，49（7）：184-191.

摘要：文章采用超聲輔助提取竹葉黃酮，通過響應面法得到最優提取條件。結果表明，最優提取條件為超聲功率356 W、超聲時間15 min、乙醇濃度59.6%、料液比1∶27 （g/mL）、竹葉粉末大小60～80目、竹葉浸潤時間40 min，該條件下竹葉黃酮提取率可達到（1.647 5±0.064）%。文章還分析了超聲提取機理，發現超聲波的熱效應為竹葉黃酮的提取提供了適宜的溫度，有利于竹葉黃酮的提取，同時超聲波降解了竹葉的細胞壁，減小了傳質阻力，從而有利于竹葉黃酮的溶出。

關鍵詞：竹葉黃酮；超聲提取；響應面法；提取機理

中圖分類號：TS201.2""""" 文獻標志碼：A""""" 文章編號：1000-9973（2024）07-0184-08

Study on Ultrasonic-Assisted Extraction of Flavonoids from

Bamboo Leaves and Extraction Mechanism

CHENG Tao， LI Shi-lu， CHEN De-yong， HE Yi-guo， ZHAO Xing-xiu

Symbolj@@

（College of Bioengineering， Sichuan University of Science ＆ Engineering， Yibin 644005， China）

Abstract： In this paper， ultrasonic-assisted extraction method is used to extract flavonoids from bamboo leaves， and the optimal extraction conditions are obtained by response surface method. The results show that the optimal extraction conditions are ultrasonic power of 356 W， ultrasonic time of 15 min， ethanol concentration of 59.6%， solid-liquid ratio of 1∶27 （g/mL）， bamboo leaves powder size of 60～80 mesh and bamboo leaves infiltration time of 40 min. Under these conditions， the extraction rate of flavonoids from bamboo leaves could reach （1.647 5±0.064）%. In addition， the ultrasonic extraction mechanism is analyzed in this paper， and it is found that the thermal effect of ultrasonic wave provides a suitable temperature for the extraction of flavonoids from bamboo leaves， which is beneficial to the extraction of flavonoids from bamboo leaves. Meanwhile， ultrasonic wave degrades the cell wall of bamboo leaves and reduces the mass transfer resistance， and thus facilitates the dissolution of flavonoids from bamboo leaves.

Key words： flavonoids from bamboo leaves; ultrasonic extraction; response surface method; extraction mechanism

收稿日期：2024-01-18

基金項目：四川省科技創新創業苗子工程項目（2021JDRC0129）

作者簡介：程濤（1979—），男，碩士，研究方向：食品加工與安全。

*通信作者：趙興秀（1977—），女，教授，碩士，研究方向：食品發酵與生物技術。

世界竹資源豐富，竹子是廣泛分布于東南亞地區的禾本科植物，在中國、日本等亞洲國家是一種食品和藥材來源。竹葉提取物具有清熱去火、清除燥熱、生津止渴、止咳化痰等功效。現代研究發現，竹葉中含有蛋白質、酚類、多糖、黃酮類等多種活性成分，表明竹葉具有較高的利用價值和市場潛力。黃酮類化合物是指以2-苯基色原酮為基核的一類化合物，廣泛存在于植物中，是多種藥用植物的有效成分。竹葉提取物中含有大量的黃酮類物質，其具有抗氧化、抑菌、抗炎、降血糖、抗疲勞、抗腫瘤等多種藥理作用。因此，竹葉黃酮還被廣泛應用于食品、保健品和化妝品中。然而，目前竹葉黃酮的提取率較低，缺乏對提取機理的深入研究，因此，深入研究竹葉提取物的提取工藝，特別是對黃酮類化合物的提取機理進行深入探究，將對工業大規模加工提供理論依據和參考。

對黃酮類物質的提取，目前國內外主要采用直接溶劑提取法、超聲提取法和超臨界CO2提取法，這些方法都有一定的優點和缺點，但提取率都不高。超聲提取技術是近年來提取植物有效藥用成分的新方法之一，超聲波提取具有設備簡單、操作方便、提取時間短、提取率高、產物穩定性高等優點，其利用超聲波輻射藥液產生的空化效應、機械效應、熱效應等能瞬間使植物細胞壁遭到破壞，增強了溶劑滲透到細胞內部的能力，加速了植物有效成分在溶劑中的溶解。本文采用超聲輔助提取竹葉黃酮，通過響應面法優化了提取條件，得到最佳工藝參數，為中試提取和企業生產竹葉黃酮提供了理論基礎。本文還研究了超聲熱效應對竹葉黃酮提取效果的影響，從微觀角度多重探究了超聲提取竹葉黃酮的機理。

1" 材料與方法

1.1" 材料

硬頭黃竹（Bambusa rigida Keng amp; P. C. Keng）：采自宜賓市翠屏區。

1.2" 試劑

硝酸鋁、石油醚、亞硝酸鈉、蘆丁（均為分析純）：成都市科隆化學品有限公司。

1.3" 主要儀器與設備

VEGA3 SBU掃描電子顯微鏡" 翱藝儀器（上海）有限公司；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀" 美國Thermo Fisher Scientific公司；D8型X射線衍射儀" 德國Bruker公司；JY98-ⅢDN超聲波細胞破碎儀" 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.4" 試驗方法

1.4.1" 超聲輔助提取竹葉黃酮

準確稱取5.0 g干燥竹葉粉末于燒杯中，加入一定量乙醇于室溫下密閉浸潤，然后轉入超聲波細胞破碎儀中，設置參數進行超聲提取，過濾收集竹葉提取液，加入等體積石油醚進行萃取，除去葉綠素等物質的干擾，以保證結果的重現性和穩定性，萃取3次后收集下層萃取液備用。

1.4.2" 竹葉黃酮的測定

準確稱取16.8 mg蘆丁標準品（干燥至恒重）并用30%乙醇溶解，定容至100 mL。取0.0，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL蘆丁溶液于25 mL比色管中，用30%乙醇定容至12.5 mL，加入0.7 mL 5% NaNO2溶液，靜置4 min，加入0.7 mL 10% Al（NO3）3溶液，靜置4 min，加入5.0 mL 1 mol/L NaOH溶液，用30%乙醇定容，靜置10 min后于510 nm處測定吸光度，以不加蘆丁為空白，繪制標準曲線。采用同樣的方法，測得萃取液的吸光度，根據標準曲線計算竹葉黃酮濃度，按下式計算竹葉黃酮提取率：

Φ=C×V×25m×v。

式中：Φ為竹葉黃酮提取率（%）；C為竹葉黃酮濃度（g/mL）；V為提取液總體積（mL）；m為竹葉粉末質量（g）；v為萃取液體積（mL）。

1.4.3" 超聲提取竹葉黃酮工藝優化

1.4.3.1" 單因素試驗

選擇超聲時間25 min、乙醇濃度 60%、料液比（竹葉質量∶乙醇體積，g/mL）1∶25、竹葉浸潤時間40 min、竹葉粉末大小40～60目，研究不同超聲功率（60，120，240，360，600，840，1 080 W）對竹葉黃酮提取率的影響。

選擇超聲功率360 W、乙醇濃度60%、料液比1∶25（g/mL）、竹葉浸潤時間40 min、竹葉粉末大小40～60目，研究不同超聲時間（5，15，25，35，45，55 min）對竹葉黃酮提取率的影響。

選擇超聲功率360 W、超聲時間15 min、料液比1∶25（g/mL）、竹葉浸潤時間40 min、竹葉粉末大小40～60目，研究不同乙醇濃度（30%、45%、60%、75%、90%、100%）對竹葉黃酮提取率的影響。

選擇超聲功率360 W、超聲時間15 min、乙醇濃度 60%、竹葉浸潤時間40 min、竹葉粉末大小40～60目，研究不同料液比（1∶5、1∶15、1∶25、1∶35、1∶45，g/mL）對竹葉黃酮提取率的影響。

選擇超聲功率360 W、超聲時間15 min、料液比1∶25（g/mL）、乙醇濃度 60%、竹葉浸潤時間40 min，研究不同竹葉粉末大小（20～40目、40～60目、60～80目、80～100目、100目以上）對竹葉黃酮提取率的影響。

選擇超聲功率360 W、超聲時間15 min、料液比1∶25（g/mL）、竹葉粉末大小60～80目、乙醇濃度60%，研究不同竹葉浸潤時間（10，40，70，100，130 min）對竹葉黃酮提取率的影響。

1.4.3.2" 響應面優化超聲提取竹葉黃酮

在單因素試驗的基礎上，選取竹葉粉末大小60～80目、竹葉浸潤時間40 min為基本條件，以乙醇濃度（A）、超聲時間（B）、超聲功率（C）、料液比（D）4個因素為自變量，以竹葉黃酮提取率（Y）為響應值，通過Design-Expert V8.0.6.1軟件進行Box-Behnken試驗設計和數據分析。響應面試驗設計見表1。

1.5" 超聲提取機理探究

1.5.1" 超聲熱效應對竹葉黃酮提取的影響

在最優提取條件下研究超聲溫度隨時間的變化，每隔30 s記錄溫度并取樣，計算對應的竹葉黃酮提取率，探究超聲熱效應與竹葉黃酮提取率的動態變化。

1.5.2" 掃描電鏡（SEM）表征分析

分別稱取0.1 mg超聲處理前后的干燥竹葉粉末（均在50 ℃下干燥），將其放置在導電碳膜雙面膠上，使用離子濺射儀將樣品噴金30 s，在掃描電子顯微鏡下觀察并收集圖像。

1.5.3" 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）表征分析

采用KBr壓片法對超聲處理前后的竹葉粉末進行FT-IR分析，精確稱取干燥后的竹葉粉末1.0 mg，加入10 mg KBr并研磨成均質粉末，壓制成透明薄片，用空白KBr作為背景，對樣品進行紅外表征，掃描范圍為500～4 000 cm－1。

1.5.4" X射線衍射（XRD）表征分析

分別取適量超聲處理前后的竹葉粉末填入樣品板的凹槽，用光滑平整的玻璃片壓實，隨后放入儀器中，對其進行XRD測試，以4°/min進行掃描，掃描范圍為5°～90°（2θ），步長為0.02°。運用Jade 6.5軟件處理數據并分析。

1.5.5" 竹葉粉末粒度分析

采用FBS6100-B干濕一體激光粒度分析儀對超聲前后的竹葉粉末粒徑進行分析，以蒸餾水為分散介質，采用濕法測定，折射率為1.53，吸收率為0.01，比重為1 g/cm3。粒度以平均粒徑D10、D50和D90表示。試驗主要采用粒度的中位徑D50來反映竹葉粉末的粒徑大小，并通過D50計算細胞壁的破碎率（φ），同時采用D10、D90和Span來表示結果。其中，D10表示樣品的累計粒度分布百分數達到10%時所對應的粒徑；D50表示樣品的累計粒度分布百分數達到50%時所對應的粒徑；D90表示樣品的累計粒度分布百分數達到90%時所對應的粒徑；Span表示粒度分布圖的展寬，Span和細胞壁破碎率計算公式如下：

Span=（D90－D10）/D50。

φ=×100%。

當D50＜10 μm時，φ=100%。

2" 結果與分析

2.1" 標準曲線

以吸光值為橫坐標，蘆丁濃度為縱坐標，繪制竹葉黃酮標準曲線，結果見圖1，回歸方程為y=143.442 2x+0.385 1（R2=0.999 3）。

2.2" 超聲提取竹葉黃酮工藝優化

2.2.1" 單因素試驗

由圖2中a可知，竹葉黃酮提取率隨著超聲功率的上升呈現先上升后下降的趨勢，當超聲功率為360 W時，竹葉黃酮提取率達到最大值1.227 6%，在統計學上具有顯著性（P＜0.05），超聲功率在0～360 W范圍內，提取率不斷上升，其原因可能是超聲波促進了竹葉黃酮的溶出，隨著超聲功率的繼續增大，竹葉黃酮提取率呈現下降趨勢，可能是由于超聲功率過強，會在竹葉表面形成一道微波屏障，從而影響黃酮類物質的提取。此外，隨著超聲功率的不斷增大，機械振動能量過強，可能破壞了部分黃酮類物質的結構，超聲功率過強也會致使其空化趨于飽和，產生無用氣泡，增加散射衰減，降低空化強度，使提取率下降，所以選擇超聲功率為360 W。

由圖2中b可知，竹葉黃酮提取率隨著超聲時間的增加呈現先上升后下降的趨勢，超聲處理15 min時，竹葉黃酮提取率達到最大值1.327 3%，在統計學上具有顯著性（P＜0.05）。當超聲時間為5～15 min時提取率上升，可能是超聲波促進了竹葉黃酮的溶出。隨著超聲時間繼續增加，超聲提取產生大量的熱量，導致提取液的溫度較高，可能使部分竹葉黃酮類物質結構遭到破壞，降低了提取率，所以選擇超聲時間為15 min。

由圖2中c可知，竹葉黃酮提取率隨著乙醇濃度的上升呈現先上升后下降的趨勢，當乙醇濃度為60%時，竹葉黃酮提取率達到最大值1.305 0%，在統計學上具有顯著性（P＜0.05）。當乙醇濃度為30%～60%時提取率上升，可能是由于乙醇濃度上升使竹葉中黃酮類物質充分溶出。此后，隨著乙醇濃度的繼續增大，竹葉中的大部分醇溶性雜質溶出，從而影響竹葉黃酮的提取率，雜質過多也不利于后續竹葉黃酮的純化，所以選擇乙醇濃度為60%。

由圖2中d可知，竹葉黃酮提取率隨著料液比的增大呈現先上升后平緩的趨勢，當料液比為1∶35時，竹葉黃酮提取率達到最大值1.312 2%。當料液比為1∶5～1∶35時提取率上升，主要是由于料液比增大使竹葉中黃酮類物質充分溶出。此后，隨著料液比的繼續增大，竹葉中黃酮類物質已經充分溶出，趨于飽和，提取率也趨于平緩。當料液比為1∶25時，竹葉黃酮提取率達到1.291 7%，接近于料液比為1∶35時的最大提取率，綜合考慮成本等因素，選取料液比為1∶25。

由圖2中e可知，竹葉粉末大小對竹葉黃酮提取率的影響不大，當采用大小為60～80目的竹葉粉末時，提取率達到最大值1.288 7%。隨著竹葉粉末大小的增大，竹葉黃酮提取率呈現上升趨勢，主要是由于竹葉粉末越細，與溶劑接觸越充分，有利于黃酮類物質的提取。但當竹葉粉末大小在80目以上時，提取率略微下降，可能是由于竹葉粉末過細，漂浮在溶劑上，不利于超聲提取，所以選取竹葉粉末大小為60～80目。

由圖2中f可知，竹葉浸潤時間對竹葉黃酮提取率的影響不大，當竹葉浸潤時間在40 min以內時，提取率隨著浸潤時間的增加呈現上升趨勢，可能是竹葉與溶劑充分接觸，有利于黃酮類物質的提取。當竹葉浸潤40 min以后，提取率基本穩定在1.31%左右，無明顯變化，所以選取竹葉浸潤時間為40 min。

2.2.2" 響應面優化超聲提取竹葉黃酮

根據單因素試驗結果，選取乙醇濃度（A）、超聲時間（B）、超聲功率（C）、料液比（D）為因素，以竹葉黃酮提取率為響應值，采用Box-Behnken試驗方法進行四因素三水平的優化試驗設計，結果見表2，回歸模型方差分析結果見表3。

通過Design-Expert V8.0.6.1軟件，以竹葉黃酮提取率（Y）為響應值進行多元回歸擬合分析，得到該模型的擬合二次回歸方程：Y=1.62－0.028A+6.473×10-4B－0.018C+0.015D－0.011AB－0.033AC－0.020AD+5.641×10-3BC+0.027BD－0.066CD－0.16A2－0.17B2－0.15C2－0.17D2。

由表3可知，運用F檢驗分析該模型，F值為19.16，模型的P＜0.000 1，說明建立的竹葉黃酮提取率模型極顯著，方法可靠；根據F值可知各因素對竹葉黃酮提取率影響的主次順序為A＞C＞D＞B，即乙醇濃度＞超聲功率＞料液比＞超聲時間。失擬項的P值為0.058 4＞0.05，表明失擬項不顯著，回歸方程擬合情況良好，優化的竹葉黃酮提取率的響應面模型選擇合適，具有實際指導意義。回歸模型的決定系數R2=0.950 4，表明模型的擬合度良好，試驗誤差小，變異系數C.V.=3.17%，表明模型的擬合度好，可用來進行預測和分析。

由表3可知，模型的一次項A顯著，B、C、D不顯著；交互項CD極顯著，其余交互項均不顯著；二次項A2、B2、C2、D2均極顯著，且其系數均為負值，表明此模型拋物線開口向下，有最大值。根據回歸方程得到竹葉黃酮提取率（Y）的最大值為1.664 68%，此時乙醇濃度為59.57%、超聲時間為15.04 min、超聲功率為356.25 W、料液比為1∶26.67。從試驗實際出發，將提取條件調整為乙醇濃度59.6%、超聲時間15 min、超聲功率356 W、料液比1∶27，進行5次平行試驗，竹葉黃酮提取率為（1.647 5±0.064）%，與預測值無顯著性差異（P＞0.05），相對誤差僅為1.04%。楚秉泉等對竹葉黃酮類化合物的調研表明，箣竹屬中總黃酮提取率一般在1.627%左右，本試驗選取的硬頭黃竹屬于箣竹屬，優化后的提取率與其調研結果相近。

竹葉黃酮提取率與乙醇濃度、超聲時間、超聲功率和料液比交互作用的三維空間響應面圖見圖3。

由表3可知，AB、AC、AD、BC、BD的P值分別為0.625 9，0.150 0，0.373 9，0.796 0，0.224 9，表明AB、AC、AD、BC、BD的交互作用影響不顯著；CD交互作用的P值為0.008 3＜0.01，表明CD的交互作用影響極顯著，即超聲功率與料液比的交互作用對竹葉黃酮提取率的影響較大。

2.3" 超聲提取機理探究

2.3.1" 超聲熱效應對竹葉黃酮提取的影響

extraction of flavonoids from bamboo leaves

由圖4可知，超聲提取溫度隨著超聲時間的增加而不斷上升，最后溫度穩定在69.4 ℃，竹葉黃酮提取率隨著超聲時間的增加也不斷上升，其變化規律與超聲溫度變化契合，在900 s時達到最大提取率1.642%。超聲波的部分能量轉化為熱能，其熱效應引起超聲提取溫度實時變化，其變化范圍為25～70 ℃，有利于竹葉黃酮的提取并能保證其活性物質不被破壞。

2.3.2"" 掃描電鏡（SEM）表征分析

由圖5可知，超聲提取前竹葉粉末結構整齊、致密，表面存在較多褶皺且無明顯小孔，外表附著大量粒狀物，可能為竹葉黃酮等小分子物質所呈現的聚集態。超聲提取后的竹葉粉末外表基本看不見附著的粒狀物，表明提取完全，大部分黃酮類物質已被溶出。超聲后的竹葉粉末具有明顯的纖維結構，在細胞壁纖維束上出現大量裂痕和蜂窩狀孔洞，表明超聲破壞了竹葉細胞壁，減小了物質提取過程中的傳質阻力，使黃酮等物質更易溶出，傳質速率提高，從而提高了竹葉黃酮的提取率，原因可能是超聲波的機械效應和空化效應使細胞壁破壞，從結果來看，與采用纖維素酶的傳統方法破壞的細胞壁相似。

2.3.3" 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）表征分析

由圖6可知，對超聲前后的竹葉粉末進行FT-IR表征分析，兩種竹粉主要吸收峰為3 434 cm－1處及其附近區域的UOH寬強吸收和UCH ，1 637 cm－1處及其附近區域的UCC（骨架振動），1 087 cm－1處及其附近區域的UC—O，可見體系中含有較強的芳烴體系， 可能存在由于羥基被糖基取代而形成的孤立體系，也可能存在共軛體系，推測有黃酮類或萜類結構，1 087 cm－1處強吸收的糖峰推測可能是多糖或取代糖苷，都與竹葉提取物的成分測定吻合。與原料竹粉相比，超聲后的竹粉在2 924 cm－1處出現了強吸收的UC—H（伸縮振動），表明在超聲的作用下，竹粉內的物質發生變化，可能產生了新的物質，也可能是超聲破壞的細胞壁纖維結構使填充在細胞壁間隙的半纖維素和木質素被釋放出來。890 cm－1 處是3 位上無取代基黃酮類化合物的特征吸收峰，來自吡喃酮環C3 的C—H 面外彎曲振動，超聲后的竹粉在此處吸收峰很弱，表明提取完全，黃酮類物質殘留少。

2.3.4" X射線衍射（XRD）表征分析

由圖7可知，兩種樣品的出峰位置基本一致，只有強弱之分。主要衍射峰在2θ=15°和2θ=22°處，對應的是纖維素Ⅰ結構中（101）和（002）晶面，雖然超聲提取并未改變細胞壁的結晶結構，但超聲前后峰出現了明顯的強弱之分，采用Jade 6.5軟件對樣品進行分峰擬合分析，對樣品的晶粒尺寸和結晶度進行比較，結果見表4。

由表4可知，與超聲前的竹葉粉末相比，超聲后的竹葉粉末晶粒尺寸為44.72 nm，降低了32.46%，結晶度為11.4%，降低了21.38%，表明超聲破壞了細胞壁，使其纖維素得到了充分的降解，從而減小了傳質阻力，更有利于竹葉黃酮等物質的溶出，這與SEM和FT-IR分析結果相吻合。

2.3.5" 竹葉粉末粒度分析

由表5可知，超聲提取竹葉黃酮后，竹葉粉末的粒徑明顯減小，以D50表示粒徑，超聲處理后的竹葉粉末粒徑減小了18.97%，Span提高了16.02%，細胞壁破碎率提高了21.80%。結合圖8超聲處理前后竹葉粉末粒徑分布圖分析，超聲處理破壞了竹葉粉末的細胞壁，減小了物質提取過程中的傳質阻力，使黃酮等物質更容易溶出，提高了傳質速率和竹葉黃酮提取率。

3" 結論

采用超聲輔助提取竹葉黃酮，優化了超聲提取條件并探索了其提取機理，為超聲輔助提取竹葉黃酮提供了理論基礎。優化的超聲條件為竹葉粉末大小60～80目、竹葉浸潤時間40 min、乙醇濃度59.6%、超聲時間15 min、超聲功率356 W、料液比1∶27，該條件下竹葉黃酮提取率為（1.647 5±0.064）%。通過對提取機理的探索，超聲波的熱效應為竹葉黃酮提取提供了適宜的溫度，有利于竹葉黃酮的提取；超聲前后的竹葉粉末掃描電鏡、紅外光譜、X射線衍射、粒度分析都表明超聲波破壞了竹葉的細胞壁，降解了纖維素，減小了傳質阻力，從而有利于竹葉黃酮物質的溶出。

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