響應面分析法優化女貞子蛋白質提取工藝及功能性研究

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.07.001

引文格式：沈祥皓，陳昌威，付靖雯，等.響應面分析法優化女貞子蛋白質提取工藝及功能性研究.中國調味品，2024，49（7）：1-9.

SHEN X H， CHEN C W， FU J W， et al.Optimization of extraction process of protein from Ligustrum vulgaris by response surface analysis methodology and study on its functionality.China Condiment，2024，49（7）：1-9.

摘要：為了進一步研究和開發女貞子在食品領域的應用，以提高女貞子蛋白質的提取率為目的進行研究。將超聲輔助堿溶酸沉法提取干燥女貞子果實中的蛋白質工藝作為基礎，通過單因素實驗和響應面實驗考察提取溫度、提取時間、液料比、pH值4個因素對女貞子蛋白質提取率的影響，以確定最佳的提取工藝并測定其功能性。實驗結果表明，女貞子蛋白質的最佳提取條件為提取溫度45 ℃、提取時間40 min、液料比為25∶1、pH值9.0，該條件下最高提取率為 85.09%，實際提取率與模型預測值無顯著性差異。此時所得的女貞子蛋白質在持水性、乳化性、乳化穩定性方面均高于市售成品大豆蛋白，持油性、起泡性、泡沫穩定性均低于大豆蛋白，且具有較強的抗氧化能力。因此，該方法提取的女貞子蛋白質具有很高的應用價值和發展潛力，可為女貞子在飲品、調味品等食品領域的高值化利用提供理論依據。

關鍵詞：女貞子；蛋白質；工藝優化；功能性；食品

中圖分類號：TS201.21""""" 文獻標志碼：A""""" 文章編號：1000-9973（2024）07-0001-09

Optimization of Extraction Process of Protein from Ligustrum vulgaris by

Response Surface Analysis Methodology and Study on Its Functionality

SHEN Xiang-hao1，2，3， CHEN Chang-wei1，2，3， FU Jing-wen1，2，3， YANG Liu-ying1，2，3，

WANG Ze-cheng1，2，3， YANG Jin-yu1，2，3， PAN Sai-kun1，2，3*

（1.School of Marine Food and Biological Engineering， Jiangsu Ocean University， Lianyungang 222005，

China; 2.Key Laboratory of Marine Biological Resources and Environment in Jiangsu Province，

Lianyungang 222000， China; 3.Collaborative Innovation Center of Marine Bio-industry

Technology in Jiangsu Province， Lianyungang 222000， China）

Abstract： In order to further study and develop the application of Ligustrum vulgaris in the field of food， with the aim of improving the extraction rate of protein from Ligustrum vulgaris， the study is carried out.Based on the extraction process of protein from dried Ligustrum vulgaris fruit by ultrasonic-assisted alkali-solution and acid-isolation method， through single factor experiment and response surface experiment， the effects of extraction temperature， extraction time， liquid-solid ratio and pH value on the extraction rate of protein from Ligustrum vulgaris are studied to determine the optimal extraction process and detect its functionality. The experiment results show that the optimal extraction conditions for protein from Ligustrum vulgaris are extraction temperature of 45 ℃， extraction time of 40 min， liquid-solid ratio of 25∶1 and pH value of 9.0. Under these conditions， the highest extraction rate is 85.09%， and there is no significant difference between the actual extraction rate and the predicted value

收稿日期：2023-12-28

基金項目：江蘇省高等學校自然科學研究重大項目（21KJA240004）

作者簡介：沈祥皓（1998—），男，碩士研究生，研究方向：功能性食品。

*通信作者：盤賽昆（1974—），男，教授，博士，研究方向：食品加工與功能食品。

of the model. At this time， the water holding capacity， emulsibility and emulsification stability of the obtained Ligustrum vulgaris protein are higher than those of commercially available finished soybean protein products， the oil holding capacity， foamability and foam stability are lower than those of soybean protein， and has strong antioxidant capacity. Therefore， the protein extracted from Ligustrum vulgaris by this method has high application value and development potential， which can provide a theoretical basis for the high-value utilization of Ligustrum vulgaris in the food field such as beverages and condiments.

Key words： Ligustrum vulgaris; protein; process optimization; functionality; food

女貞子（Ligustrum vulgaris）廣泛分布于我國華東、華南地區，其果實富含三萜類、環烯醚萜類、黃酮類等優質功能性化學成分，且含有大量多糖、蛋白質、氨基酸、脂肪酸、揮發性成分、色素以及多種微量元素。女貞子蛋白質含量約為6%～9%，其氨基酸種類相當豐富，包括的17種氨基酸中有7種必需氨基酸，谷氨酸含量最高，亮氨酸含量次之，是優質的植物蛋白原料。目前，市面上女貞子大都以初級農產品的形式作為中藥材進行銷售，其可作為保健食品的特性未被人們熟知，國內外對女貞子蛋白質提取工藝的研究較少，提取方式單一、提取效率低，在食品工業領域的運用極少。

本文以安徽亳州銷售的女貞子干燥果實為原料，對其進行脫脂處理，然后采用超聲波輔助提取與堿溶酸沉法提取其蛋白質，并在單因素實驗的基礎上，通過Design-Expert設計響應面實驗，優化女貞子蛋白質提取工藝，從而為女貞子蛋白質的提取提供理論基礎。

1" 材料與方法

1.1" 材料與試劑

干燥女貞子果實：安徽省亳州市壽安堂藥業有限公司；考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白：上海伯奧生物科技有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2" 實驗設備

BP221S電子分析天平" 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；ZNC-107超微粉碎機" 北京華儀高科電氣有限公司；SHA-2數顯冷凍水浴恒溫振蕩器" 江蘇金壇市億通電子有限公司；B-220電子恒溫水浴鍋" 浙江舟山市定海區海源儀器廠；ELX808酶標儀" 美國BioTek公司；UV-754型紫外可見分光光度計" 山東高密彩虹分析儀器有限公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗機" 昆山市超聲儀器有限公司；DDL-5M低速冷凍離心機" 上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.3" 實驗方法

1.3.1" 女貞子基本成分測定

1.3.1.1" 女貞子蛋白質含量測定

采用自動凱氏定氮儀進行測定。

1.3.1.2" 女貞子灰分含量測定

采用直接灰分法進行測定。

1.3.1.3" 女貞子脂肪含量測定

采用索氏抽提法測定游離態脂肪含量。

1.3.2" 干燥女貞子果實脫脂及預處理

挑選無雜質、保存完好的干燥女貞子果實樣品，通過破壁機粉碎，將過篩后的干燥女貞子粉末按照液料比為10∶1（mL/g）與石油醚一起加入到浸提裝置中，保持溫度60 ℃恒溫的條件下，回流浸提5 h，浸提后將溶液靜置一段時間后抽濾。將剩余的過濾物以相同條件再次回流浸提，將兩次操作所得的濾液一并回收并過濾，將過濾物洗凈后干燥，放入干凈且密封性良好的容器中，冷藏備用。

1.3.3" 女貞子蛋白質提取工藝流程

將經過脫脂干燥的定量女貞子粉末過篩后置于燒杯中，按比例加入純水，混合均勻。用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調節溶液的pH值，置于超聲清洗器中超聲，直至溶液完全混勻。用高速離心機離心后收集上清液，用鹽酸調節水溶液的pH值使女貞子蛋白質析出，再次離心，去除上清液，向沉淀物中加入純水并調節pH值至中性，離心后將沉淀物冷凍干燥，即可得到女貞子蛋白質。

1.3.4" 單因素實驗設計

1.3.4.1" 提取溫度對女貞子蛋白質提取率的影響

研究了在提取時間為30 min、pH值為9.0、液料比為20∶1（mL/g）、超聲功率為400 W的條件下，提取溫度分別為30，35，40，45，50 ℃對女貞子蛋白質提取率的影響。

1.3.4.2" 提取時間對女貞子蛋白質提取率的影響

研究了在提取溫度為40 ℃、pH值為9.0、液料比為20∶1 （mL/g）、超聲功率為400 W的條件下，提取時間分別為20，30，40，50，60 min對女貞子蛋白質提取率的影響。

1.3.4.3" pH值對女貞子蛋白質提取率的影響

研究了在提取時間為30 min、提取溫度為40 ℃、液料比為20∶1（mL/g）、超聲功率為400 W的條件下，pH值分別為8.0，9.0，10.0，11.0，12.0對女貞子蛋白質提取率的影響。

1.3.4.4" 超聲功率對女貞子蛋白質提取率的影響

研究了在提取時間為30 min、提取溫度為40 ℃、pH值為9.0、液料比為20∶1（mL/g）的條件下，超聲功率分別為200，300，400，500，600 W對女貞子蛋白質提取率的影響。

1.3.4.5" 液料比對女貞子蛋白質提取率的影響

研究了在提取時間為30 min、提取溫度為40 ℃、pH值為9.0、超聲功率為400 W的條件下，液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1對女貞子蛋白質提取率的影響。

1.3.5" 響應面優化實驗

根據單因素實驗結果，選取提取溫度、提取時間、液料比和pH值這4個作為女貞子蛋白質提取實驗的關鍵因素，構建四因素三水平的響應面實驗設計。以女貞子蛋白質的提取率作為評價基準，確定最佳的女貞子蛋白質提取工藝參數。具體的實驗設計因素水平見表1。同時，建立女貞子蛋白質提取率的二次多項式數學模型。

1.3.6" 女貞子蛋白質功能性測定

1.3.6.1" 抗氧化性測定

對女貞子蛋白質在清除DPPH自由基方面的效能進行了檢驗。首先，選定濃度為1 mg/mL的女貞子蛋白質樣品溶液，分別取出100，200，300，400，500 μL放入無水乙醇中，定容至500 mL，然后注入1 mL濃度為0.1 mol/mL的DPPH-乙醇溶液，攪拌均勻，然后在陰涼、沒有光照的地方靜置20 min。使用波長為517 nm的光譜對其進行紫外吸光度值的測定。在進行空白對照實驗時，將DPPH溶液器換成無水乙醇溶液；而在標準對照實驗中將樣品溶液替換成蒸餾水。根據公式（1）計算女貞子蛋白質樣品對DPPH自由基的清除率。

DPPH自由基清除率（%）=×100%。（1）

1.3.6.2" 持水性與持油性測定

量取0.5 g女貞子樣品放入離心管內，加入5 g水或5 g大豆油，計算樣品和離心管的總質量（g）。經過5 min的渦旋振蕩并在室溫條件下靜置20 min。離心（4 500 r/min，持續15 min）后，去除上層清液，再次測量離心后樣品和離心管的總質量（g）。根據公式（2）計算其持水性或持油性。

持水性（g/g）或持油性（g/g）=（離心后女貞子蛋白質樣品與離心管的總質量-原女貞子蛋白質樣品與離心管的總質量/樣品質量。（2）

1.3.6.3" 乳化性與乳化穩定性測定

a.乳化性測定

先取1.0 g女貞子蛋白質放入25 mL蒸餾水中，加入5 mL大豆油，以12 000 r/min的速度攪拌均勻，時間為2 min。此后，進行離心操作，轉速為4 500 r/min，時間為15 min。最后，測量女貞子蛋白質混合溶液乳化層的高度（mm）和離心管中女貞子蛋白質混合溶液的總高度（mm），根據公式（3）計算女貞子蛋白質的乳化性。

乳化性（%）=（乳化層高度/離心管中女貞子蛋白質混合溶液總高度）×100%。（3）

b.乳化穩定性測定

在 80 ℃的水浴中，先進行預處理，再進行30 min的恒溫靜置，用冷水清潔，離心（4 500 r/min，15 min），通過公式（4）測定液體乳化層的厚度（mm）變化來確定女貞子蛋白質的乳化穩定性。

乳化穩定性（%）=（保持乳化狀態的液層厚度/原女貞子蛋白質混合溶液乳化層厚度）×100%。（4）

1.3.6.4" 起泡性與泡沫穩定性測定

先取0.5 g樣品放入燒杯中，倒入50 mL去離子水，搖晃30 min使樣品完全溶入水中，然后使用高速均質機以12 000 r/min的速度混合2 min，待混合液完全融合后，對泡沫層的體積（mL）進行記錄。混合液靜置30 min后再次測量瓶面的氣泡體積（mL）。根據公式（5）和公式（6）計算女貞子蛋白質的起泡性和泡沫穩定性。

起泡性（%）=（女貞子蛋白質混合溶液上層泡沫體積/50）×100%。（5）

泡沫穩定性（%）=（靜置后女貞子蛋白質混合溶液上層泡沫體積/未靜置女貞子蛋白質混合溶液上層泡沫體積）×100%。（6）

1.3.7" 數據處理

對各項實驗分別進行3次平行實驗，計算平均值，結果以平均值±標準差表示。使用Origin 2018軟件處理結果，使用SPSS軟件分析計算單因素方差。顯著性的判斷標準：Plt;0.05表示差異顯著，Plt;0.01表示差異極顯著。

2" 結果與分析

2.1" 女貞子基本成分含量

女貞子基本成分含量見表2。

2.2" 各因素對女貞子蛋白質提取率的影響

2.2.1" 提取溫度對女貞子蛋白質提取率的影響

rate of protein from Ligustrum vulgaris

注：不同小寫字母表示差異顯著（Plt;0.05），下圖同。

由圖1可知，提取溫度對女貞子蛋白質提取率的影響顯著。當提取溫度達到45 ℃時，女貞子蛋白質提取率達到最高，為84.73%，這可能是因為當提取溫度越來越高時，女貞子蛋白質分子之間的布朗運動變得越來越活躍，從而促進了細胞膜的滲透作用，進而促進了蛋白質的溶解，同時促進了水分子的熱運動，從而使得女貞子蛋白質的提取率顯著提升。當提取溫度大于45 ℃時，過高的溫度會引發蛋白質變性，導致其中一部分已溶解的蛋白質出現交聯聚合的現象。此狀況下，這些蛋白質更易與其他不溶材質混淆并被離心分離，因此，會大幅度降低上清液中的蛋白質濃度，從而影響蛋白質的提取率。因此，選取提取溫度40，45，50 ℃進行進一步實驗。

2.2.2" 提取時間對女貞子蛋白質提取率的影響

由圖2可知，提取時間對女貞子蛋白質提取率的影響顯著。當提取時間為40 min時，女貞子蛋白質提取率達到最高，為80.66%。這主要是因為女貞子在溶液中經過了一定時間的溶脹，充足的溶脹時間使得女貞子蛋白質提取率得到了提高。此外，超聲波的機械和空化效應持續作用，也加強了堿液的滲透能力，使得女貞子蛋白質在溶劑中盡可能地溶解，提高了提取率。然而，如果提取時間過長，蛋白質的提取率反而會隨之降低，這可能是由于超聲波空化效應的不斷增強導致部分蛋白質的性狀發生改變，甚至開始水解。因此，選取提取時間30，40，50 min進行進一步實驗。

2.2.3" pH值對女貞子蛋白質提取率的影響

由圖3可知，當pH值為8～10時，氧化還原電位的堿性增強，含有極性基團的某些蛋白質分子的二級結構會破裂，這將導致電荷集群聚集在其他蛋白質分子上，加快二級鍵的解離，進而促進蛋白質的分離。當pH值為9時，蛋白質的提取效果最佳，提取率達到77.59%。然而，隨著溶液pH值的繼續增加，蛋白質的提取率反而下降，這可能是由于在高pH值環境中，蛋白質的二級和三級結構發生改變，部分蛋白質開始水解，導致脫氨、脫羧和肽鍵斷裂等反應。經實驗驗證，女貞子蛋白質的提取受溶劑酸堿度雙向調節，因此，當pH值為9時提取效果更加理想。

2.2.4" 超聲功率對女貞子蛋白質提取率的影響

由圖4可知，隨著超聲功率的不斷增加，女貞子蛋白質提取率呈現上升趨勢。超聲功率由200 W上升至500 W時，蛋白質提取率逐漸上升，原因是隨著超聲功率的增加，超聲波對細胞的空化效應和機械效應增強，蛋白質溶出量增加。當超聲功率達到300 W時，提取率和純度均達到峰值，且具有差異性。當超聲功率達到600 W時，蛋白質提取率略微下降，原因可能是高功率超聲波的“聲空化”作用使蛋白質分子結構發生嚴重的裂解或重構，使空間結構和等電點發生改變，導致提取率降低。

2.2.5" 液料比對女貞子蛋白質提取率的影響

由圖5可知，增加溶劑的占比，提取物的濃度差會相應增大，從而有利于提高提取率。液料比在某種程度上影響著女貞子蛋白質的提取效果，當液料比在10∶1～30∶1 之間時，女貞子蛋白質提取率先升后降。當液料比為25∶1時，蛋白質提取率最高，達到81.54%。假設物質濃度過高，系統的黏性會相應增大，從而對分子的擴散產生阻礙，使水的活動性降低，會妨礙蛋白的溶解，為水解反應施加抑制作用，降低了蛋白的提取率。然而，溶劑比例提高使得女貞子能充分接觸溶劑，使蛋白質更易被提取液吸取，能夠增強蛋白質的分散效率，推動提取蛋白的比例增大。然而，過高的液料比可能會導致蛋白質提取率降低，可能是由于濃度過低的分散系統在處理過程中容易引發溶質丟失。鑒于后續可能產生的費用和耗水量，選擇液料比5∶1、10∶1、15∶1進行后續實驗。

2.3" 響應面實驗設計

2.3.1" Box-Behnken響應面實驗設計與結果

在此前設定的實驗流程基礎上，采用提取溫度（A）、提取時間（B）、液料比（C）和pH值（D）4個變量作為響應面因素，以蛋白質提取率為響應值（Y），Box-Behnken響應面實驗設計與結果見表3。使用Design-Expert 8.0.6 軟件對所得到的數據進行多元回歸分析，估算蛋白質的提取率。去除對模型影響不顯著的項，經優化得到以下二次回歸方程：

Y（%）=85.96+1.34A+0.88B+1C+1.51D+3.24AB－0.19AC－3.42AD－0.69BC－1.68BD－1.7CD－4.61A2－2.74B2－3.18C2－3.1D2。

2.3.2" Box-Behnken實驗方差分析

對回歸模型的覆蓋度和顯著性進行了考量，相關的數據見表4。

注：“*”表示差異顯著（Plt;0.05），“**”表示差異極顯著（Plt;0.01），“-”表示差異不顯著（Pgt;0.05）。

由表4可知，模型的P值lt;0.000 1，表明模型極顯著，從而驗證了該實驗方案的準確性。回歸模型的F值為20.46，且其差異極顯著（Plt;0.000 1）。然而失擬項的P=0.098 8gt;0.05，表明本次實驗中未知的干擾因素對實驗結果的影響微乎其微，模型的適應能力非常強。模型的R2=0.953 4、RAdj2=0.906 8、RPred2=0.749 5，表明結果非常可靠，實際的實驗數據和模型預測數據的契合度很高，為此可以借助此模型對女貞子蛋白質提取的工藝參數進行分析和預測。在此基礎上，在提取溫度（A）、提取時間（B）、液料比（C）、pH值（D）這4個主要的變量中，對蛋白質提取率影響的主次順序為pH值（D）＞提取溫度（A）＞液料比（C）＞提取時間（B）。模型可以展示每個變量和響應值之間的關系。

2.3.3" 驗證實驗

由圖6～圖11可知，通過Design-Expert 8.0.6軟件對響應面優化實驗各工藝參數進行優化分析后，女貞子蛋白質提取率（預測值）為86.30%，其對應的因素為提取溫度46.26 ℃、提取時間42.96 min、液料比25.61∶1、pH值8.99。根據實際應用情況測試該方法的有效性，將女貞子蛋白質提取的最優條件修正為提取溫度45 ℃、提取時間40 min、液料比25∶1、pH值9.0。在最佳工藝條件下進行3次驗證實驗，女貞子蛋白質提取率分別為84.73%、85.09%、85.07%，平均值約為84.96%，接近模型的預測值，表明使用Box-Behnken中心組合設計獲得的工藝參數和響應面分析結果準確可靠，具有一定的應用價值。

2.4" 女貞子蛋白質功能性測定

2.4.1" 抗氧化性

根據DPPH自由基清除率體外實驗法，測定結果見圖12。

由圖12可知，在樣品濃度為0.5 mg/mL時，DPPH自由基清除率最高，達52.99%，證明女貞子蛋白質具有一定的抗氧化效果。

2.4.2" 持水性與持油性

對常見的大豆蛋白質與女貞子蛋白質的功能特性進行分析，采用相同的實驗方法，在同等條件下測定兩種植物蛋白的功能性，并進行對比分析。

女貞子蛋白質與大豆蛋白質的持水性與持油性見圖13。

由圖13可知，二者的持水性差異較明顯，女貞子蛋白質的持水性（7.33 g/g），優于大豆蛋白質的持水性（4.07 g/g），這可能是由于女貞子蛋白質氨基酸比大豆蛋白質氨基酸含有更多的親水基團，使得女貞子蛋白質更易與氫氧離子結合。從持油性來看，女貞子蛋白質的持油性（0.94 g/g），略低于大豆蛋白質的持油性（1.58 g/g），這可能是由于大豆蛋白質的疏水性強于女貞子蛋白質，使其與油分子的相互作用力更強，從而獲得了較高的持油性，相比之下，女貞子蛋白質的持油性較低。

2.4.3" 乳化性與乳化穩定性

由圖14可知，女貞子蛋白質的乳化性（21.35%）顯著高于大豆蛋白質的乳化性（16.83%），這一結果得益于女貞子蛋白質在實驗范圍內的溶解性更強，而且它的疏水性更強，因此，它的乳化穩定性也更優，超過了大豆蛋白質。女貞子蛋白質在油/水界面處的穩定性較強，并且比傳統的大豆蛋白質更加耐受環境的改變。

2.4.4" 起泡性與泡沫穩定性

由于蛋白質的結構特征不一致，導致它們的兩親性特征，它們既可以是親水的，也可以是疏水的。被分解時，它們的親水部位會被溶解到溶劑中，會導致蛋白質的結構發生變化，從而產生不一樣的結構。

在混合過程中，疏水性基團會附著在氣液分界位置，從而減小了表面張力。而位于界面的蛋白質之間的互動則產生了一層帶有黏性和彈性的薄膜，這有助于泡沫的形成。

由圖15可知，女貞子蛋白質的起泡性為28.64%，低于大豆蛋白質的起泡性42.55%，女貞子蛋白質的泡沫穩定性為64.51%，略低于大豆蛋白質的泡沫穩定性為69.5%，低起泡性和低穩定性使得女貞子蛋白質在實際生產應用中會比大豆蛋白產生更少的氣泡，但在例如飲品、調味品等液態產品的應用中，該特性使其有著較高的應用價值。

3" 結論

根據中心組合設計原理，在單因素實驗的基礎上，運用軟件進行響應面實驗優化，并對各工藝參數進行深入的優化分析。確定了女貞子蛋白質提取的最適修正條件：提取溫度為45 ℃、提取時間為40 min、液料比為25∶1（mL/g）、pH值為9.0。該結果與預測模型極為匹配，此條件下的最高提取率達到85.09%。實驗結果符合實驗模型的預測值范圍，充分表明實驗的工藝參數和響應面分析數據是精確可靠的，也證明了實驗的可行性。

實驗證明相較于常見的大豆蛋白質，經超聲輔助堿溶酸沉法提取的女貞子蛋白質的持水性、乳化性、乳化穩定性均高于大豆蛋白質，持油性、起泡性、泡沫穩定性均低于大豆蛋白質，表明通過此實驗方法得到的女貞子蛋白質在飲品、湯料等食品領域具有廣闊的發展空間和較高的研究價值。此外，女貞子蛋白質在抗氧化方面有一定的功效價值，可以進一步深度研究。

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