紅景天復合面膜的研制

為了研制具有多重皮膚生物活性的面膜，本研究將紅景天提取物、牛油果樹果脂、積雪草葉提取物、垂盆草提取物和透明質酸進行配伍，研制了紅景天復合面膜。試驗采用單因素方法確定油相和乳化劑的主要輔料組成和用量；同時，采用酪氨酸酶活性抑制試驗、DPPH自由基清除試驗以及面膜對小鼠皮膚中水分和膠原蛋白的影響試驗評估了紅景天面膜的生物活性。試驗結果顯示，所制備的面膜的各項檢測指標均符合面膜的標準要求。此外，體外和小鼠試驗也證實了面膜具有美白、抗氧化和抗皮膚衰老的三重生物活性。

關鍵詞：紅景天復合面膜；酪氨酸酶活性抑制；DPPH自由基清除；膠原蛋白

紅景天為景天科植物大花紅景天（Rhodiola crenulata （Hook. f. et Thoms.） H. Ohba）的干燥根和根莖，具有抗氧化和美白等護膚功效[1，2]。牛油果樹果脂是從牛油果果實中提取的天然植物油脂，在臨床上已經證實對皮膚具有保濕和改善皮膚干燥的活性[3]。傘形科植物積雪草（Centella asiatica （L.） Urb）的干燥全草，具有極高藥用價值和較為廣泛的藥理活性，尤其在抗皮膚衰老、抗氧化，促進膠原蛋白合成方面[4-6]。垂盆草為景天科植物垂盆草（Sedum sarmentosum）的干燥全草。垂盆草中黃酮和三萜類成分通過與過氧化物結合，具有較強的抗氧化功效[7]。透明質酸具有良好的皮膚保濕效果，此外高分子透明質酸還具有控油功效，低分子透明質酸還具有促進皮膚成纖維細胞增殖作用[8，9]。

本研究以紅景天提取物、牛油果樹果脂、積雪草葉提取物、垂盆草提取物和透明質酸（高、低分子量）作為活性原料，制備具有美白、抗氧化和抗皮膚衰老三重復合功效的面膜。具體研究如下：（1）單因素確定面膜最佳制備處方組成；（2）體外和小鼠實驗評估面膜的美白（抑制酪氨酸酶活性）、抗氧化（DPPH自由基清除）和抗皮膚衰老（增加皮膚水分和膠原蛋白含量）；通過本研究，為化妝品中面膜制備提供參考。

Part 1

儀器與材料

BSA323S （精度0.001 g）電子天平（德國賽多利斯公司）；PR224ZHE型（精度0.0001g）電子天平（沙鷹科學儀器有限公司）；TS800 酶標儀（美國安捷倫公司）；Ql-866型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；KQ5200E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SiGmS高速冷凍離心機（北京五洲東方科技發展有限公司）；800D-1型離心機（常州天瑞儀器有限公司）；BIO-DL型移液槍（賽多利斯公司）；LHS-100F型恒溫恒濕培養箱（上海精其儀器有限公司）；F6/10型電動均漿機（上海凈信實業發展有限公司）；高速剪切機J200-SH（上海精其儀器有限公司）；臺式面膜涂布機（蘇州愛可姆機械有限公司）； 96孔酶標板（NEST biotechnology Co，Ltd.）。

紅景天苷對照品（純度：≥98%，上海詩丹德標準技術服務有限公司）；熊果苷（純度：≥98%，上海詩丹德標準技術服務有限公司）；維生素C （純度：≥98%，上海詩丹德標準技術服務有限公司）；海藻糖（Hayashibara Co.Ltd）；低聚果糖（山東白龍創園生物科技股份有限公司）；角鯊烷（Empresa Figueirense de Pesca，Lda）；聚甘油-2油酸酯和聚甘油-10油酸酯（The Nisshin Oillio Group，Ltd）；霍霍巴籽油（Vantage Speciallty Chemicals，Inc）；液體石蠟（山東利爾康消毒科技有限公司）；羥乙基脲（Nouryon Surface Chemistry AB）；甘油（P&G Chemicals Asia）；吐溫-80 （南京威爾藥業股份有限公司）；司盤-60 （天津致遠化學試劑有限公司）；紅景天提取物（云南英格生物技術有限公司）；牛油果樹果脂（VantageSpeciallty Chemicals，Inc）；積雪草葉提取物（奇華頓日用香精香料（上海）有限公司）；垂盆草提取物（百朗德（廣州）生物科技有限公司）；透明質酸鈉（山東焦點福瑞達生物股份有限公司）、酪氨酸酶（美國Sigma公司）；L -酪氨酸上海麥克林生化科技有限公司）；DPPH （Shanghai Ruitai Biotechnology Co.， Ltd.）、D-半乳糖（美國Sigma公司）; 小鼠I型膠原蛋白ELISA kit （美國LSBio公司）;娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；PBS緩沖液、生理鹽水（天津市化工三廠有限公司）；乙醇為分析純（天津市化工三廠有限公司）。BALB/c Nude小鼠（SPF級，合格證號：2019-0010），并已通過倫理審批（倫理審批號BUCM-4-2019060515-1028）。

Part 2

試驗方法

1.紅景天面膜制備

將海藻糖（1.0%）、低聚果糖（0.5%）和甘油（4.0%）3種水相輔料和5種活性原料混合，再加純凈水溶解之后，使用高速剪切機剪切，得到所需的溶液A。按處方量將角鯊烷（0.2%）和霍霍巴籽油（0.5%）兩種油相輔料和三種表面活性劑聚甘油-2油酸酯（0.1%）、聚甘油-10油酸酯（0.2%）和羥乙基脲（1.0%）混合，得到溶液B。將溶液B加入到溶液A中，高速剪切機剪切，再按處方補足純凈水，攪拌均勻，得到所需的溶液C。空白膜布快速通過低溫區（-30℃），進行預凍。在預凍后的膜布上，涂布溶液C，涂布厚度為0.5 mm，上料質量25g/片。涂布之后再次通過低溫冷凍，然后進行裁切成大小合適的片材，裝入凍干機，真空度30 Pa，升華溫度40℃，升華時間2h，即得初始配方的紅景天復合面膜。

2.單因素試驗

（1）油相霍霍巴籽油與液體石蠟對比

在多種油相配比中分別加入不同比例的霍霍巴籽油與液體石蠟，以此制備面膜樣品。以感官屬性、觸感和黏度作為主要評價標準，分析兩種油相添加劑對面膜性能的影響，并據此確定最終的油相配方成分。

（2）乳化劑配方組成

在不同乳化劑配方中分別加入不同用量的聚甘油-2油酸酯、聚甘油-10油酸酯、羥乙基脲組合與吐溫80或司盤80，制備面膜。本實驗以乳液的穩定性、面膜的黏度以及離心穩定性作為關鍵評估指標，分析不同乳化劑對面膜性能的影響。通過綜合評價實驗結果，以確定最適宜的乳化劑組成與用量。

（3）單因素考查輔料用量

實驗設計6個配方，分別考查不同油相和乳化劑用量對面膜的影響，最終確定配方最優的輔料用量，不同配方設計見表1。

3.酪氨酸酶活性抑制試驗

參考文獻方法[10]，反應體系為pH6.5的PBS緩沖液。配制2.5kU·L-1 酪氨酸酶和45.0g·L-1 L -酪氨酸溶液。陽性對照為熊果苷溶液（1mg·mL-1）。將面膜中活性原料用PBS緩沖液超聲溶解，按活性原料質量計算，母液濃度為2mg·mL-1。在96孔酶標板中加入供試樣品溶液（供試品溶液+4 μL，酪氨酸酶+80μL，L-酪氨酸溶液）、陰性溶液（酪氨酸酶-L-酪氨酸溶液）和空白溶液（供試品溶液+ L-酪氨酸溶液）。整個反應體系為200μL，供試樣品終濃度分別為1600μg·mL-1、800μg·mL-1、400μg·mL-1、200μg·mL-1、100μg·mL-1、50μg·mL-1，溶液不足200μL加PBS緩沖液補充。試驗于37℃震搖3min，溫孵20min，在492nm測吸光度（A）。以酪氨酸酶和L -酪氨酸生成黑色素量表示酪氨酸酶的活性。

以抑制率（%） = [（A陰性-A空白） - （A供試樣品-A空白）/（A陰性-A空白）×100%計算供試樣品對酪氨酸酶的抑制率。

4.抗氧化試驗

抗氧化實驗（DPPH自由基清除試驗）主要參考相關的文獻研究[11，12]。先精密稱取DPPH，用無水乙醇溶解配置成50μg·mL-1溶液。陽性對照為維生素C溶液（濃度100μg·mL-1）。將面膜中活性原料用PBS緩沖液超聲溶解，按活性原料質量計算，母液濃度為2mg·mL-1。在96孔酶標板中加入200μL供試品溶液（供試品溶液+ 100μL DPPH）、陰性溶液（100μL DPPH+100μL無水乙醇）和空白溶液（供試品溶液+100μL無水乙醇/純凈水）。整個反應體系為200μL，供試樣品終濃度分別為1000μg·mL-1、500μg·mL-1、250μg·mL-1、125μg·mL-1、62.5μg·mL-1、31.3μg·mL-1，溶液不足200μL加純凈水補充。渦旋使樣品混合均勻，再避光反應30min，517nm下吸光度（A），平行三次試驗，按照如下公式計算供試品對DPPH自由基的清除率。

自由基清除率（%） = [1- （A供試樣品- A空白）]/（A陰性- A空白）×100%。

5.對小鼠皮膚中水分和膠原蛋白的影響

參考文獻方法[13，14]，動物分組與造模，雄性小鼠30只， 隨機分成5組，每組6只，分別為正常對照組，模型組，陽性對照組，給藥組。正常對照組小鼠背部每日貼敷空白面膜（不含活性原料的面膜基質成分，面積3×2cm2）20min。模型組，陽性對照組和給藥組的小鼠在背頸部每日給予皮下注射10% D-半乳糖溶液1g·kg-1， 同時每天小鼠背部皮膚在波長400nm紫外光下照射40min，持續60天。從第10天開始，陽性對照組小鼠背部皮膚（面積3×2cm2）涂抹5%維生素E （VE）軟膏，給藥組小鼠背部每日分別貼敷面膜（面積3×2cm2）各20min。實驗結束后處死小鼠。取小鼠背部面膜貼敷的皮膚組織，剪碎后置于組織勻漿器中，加入10倍量生理鹽勻漿，使組織充分破碎。勻漿液5000r·min-1離心10min，離心后的上清液備用，按試劑盒說明書操作測定皮膚I型膠原蛋白含量。同時實驗結束后取適量背部貼敷面膜的皮膚采用干燥法檢測皮膚中含水量，參考文獻方法[13]，按如下公式計算。

皮膚含水率/ % = （干燥前皮膚質量-干燥后皮膚質量） /干燥前皮膚質量×100計算皮膚含水率。

6.數據分析

單因素方差分析（Tukey-Kramer HSD檢驗）比較均值，以p＜0.05（*）或p＜0.01（**）表示差異有統計學意義。對酪氨酸酶的抑制和DPPH清除能力采用IC50評估，計算各個濃度供試樣品的抑制活性和清除率，采用四參數Logistic擬合計算。

E=Emax+（Emin-Emax）/（1+EXP（a×（LogC-LogIC50）， Emax和Emin分別代表擬合最大和最小效應；C代表供試樣品最終濃度；a代表擬合斜率），通過JMP軟件（版本16.0.0）求解IC50。本研究中數據統計分析均由JMP 11.0.0平臺實現（SAS Institute Inc.）。

Part 3

結果

1.單因素試驗

配方單因素試驗結果顯示面膜的最佳配方組成為角鯊烷 0.2%、霍霍巴籽油2.0%、聚甘油-2油酸酯0.1%、聚甘油-10油酸酯0.2%、羥乙基脲5.0%和甘油2.0%，按此配方制備面膜檢測結果如表2所示。

因此，可確定紅景天復合面膜最終配方如表3所示。

2.體外功效試驗

（1）酪氨酸酶抑制活性研究

由表4可知，在所測試的濃度范圍之內，紅景天面膜提取液對酪氨酸酶抑制率隨濃度的增加而增加，在濃度為1600μg·mL-1時達到最大， 與對照組熊果苷相比無顯著性差異（p>0.05），表明在此濃度下二者對酪氨酸酶抑制率基本相當。計算紅景天面膜提取液對酪氨酸酶抑制的IC50值為218.8μg·mL-1。

（2） DPPH自由基清除研究

由表5可知，在所測試的濃度范圍之內，紅景天面膜提取液對DPPH的清除率隨濃度的增加而增加，在濃度為500μg·mL-1時達到最大， 與對照組維生素C相比無顯著性差異（p>0.05），表明二者對DPPH清除能力基本相當。計算紅景天面膜提取液對DPPH的清除能力的IC50值為199.5μg·mL-1。

3.對小鼠皮膚的含水量和I型膠原蛋白含量影響

表6顯示了紅景天復合面膜對小鼠皮膚中含水量和膠原蛋白含量的影響。與正常對照組相比，模型組小鼠皮膚的含水量和膠原蛋白含量均顯著下降（P<0.01）；與模型組相比較，VE組的皮膚含水量和膠原蛋白含量均顯著升高（P<0.01），這說明模型建立成功。實驗結果表明，紅景天復合面膜能顯著增加小鼠皮膚含水量（P<0.01）和膠原蛋白含量（P<0.05），面膜對衰老皮膚的改善效果與VE組類似。

Part 4

結論

本研究首次將多種對皮膚具有生物活性的可用于化妝品的原料進行配伍，研制了紅景天復合面膜，并通過體外和小鼠實驗對面膜的四種主要生物活性進行了評價。實驗結果顯示，紅景天復合面膜表現出良好的美白效果（抑制酪氨酸酶活性）、抗氧化能力（DPPH自由基清除）以及抗皮膚衰老特性（增加皮膚水分和膠原蛋白含量）。此外，紅景天復合面膜各項檢測指標均符合QB/T2872—2007《中華人民共和國輕工行業標準》。本研究為其他面膜配方的研制和活性評價提供了可借鑒的思路和方法。

作者介紹

李和偉：博士，高級工程師，主要研究方向：化妝品和生物醫藥研究，供職于常州偉博海泰化妝品有限公司

代 穎，魏國志：供職于常州偉博海泰化妝品有限公司

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