模擬干旱脅迫對4種油松根系真菌生長及生理特性的影響

摘要：采用PEG-6000模擬干旱脅迫，固體培養和液體培養的方法，研究0、15%、25%、35% PEG-6000對從油松根系分離出的2種外生菌根真菌［血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus）、彩色豆馬勃（Pisolithus tinctorius）］和2種深色有隔內生真菌［短梗蠕孢菌（Pleotrichocladium opacum）、須殼孢屬（Pyrenochaeta sp.）］生長及生理特性的影響，以期探究油松根系真菌的抗旱機制，了解4種真菌對干旱脅迫的耐受性，為干旱地區挖掘具有應用價值的潛力菌株。結果表明，4種真菌在PEG脅迫下均能夠生長，與對照相比，Ps生物量在15%、25% PEG-6000下顯著提高，Pt生物量僅在35% PEG-6000下顯著提高，其余菌株的生物量在PEG脅迫下均顯著提高，且Po、Pss生物量顯著高于Ps、Pt。在PEG脅迫下4種真菌均在一定程度上降低了培養液pH值，提高了抗氧化酶活性，多數能夠提高脯氨酸和可溶性蛋白的含量來應對干旱脅迫環境。Po、Pss的抗氧化酶活性在35% PEG-6000下仍顯著高于對照，SOD活性分別提高了48.7%、82.0%，CAT活性分別提高了40.3%、122.4%。Pss在35% PEG-6000下脯氨酸含量和可溶性蛋白含量相比對照仍顯著提高，分別提高了131.1%、267.6%。此外4種真菌在受到PEG脅迫時，體內MDA的積累有所差異。Ps的MDA含量僅在15% PEG-6000下相比對照顯著降低，降低了38.8%。Pt、Po的MDA含量在PEG脅迫下（除15% PEG-6000）相比對照均顯著增加，而Pss的MDA含量在PEG脅迫下均顯著低于對照。綜上，在PEG脅迫下，4種真菌對干旱脅迫均具有一定的耐受性，均能夠通過在一定程度上降低培養液pH值，提高抗氧化酶活性，提高脯氨酸和可溶性蛋白的含量來適應干旱脅迫環境。4種真菌對干旱脅迫的耐受能力大小為Pssgt;Pogt;Psgt;Pt。

關鍵詞：PEG-6000；抗旱性；外生菌根真菌；深色有隔內生真菌；抗氧化酶活性；耐受性

中圖分類號：S182 "文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）14-0236-08

收稿日期：2023-09-02

基金項目：國家自然科學基金（編號：32001112）；河北省自然科學基金（編號：C2023204238、C2020204169）。

作者簡介：鄭妍妍（1998—），女，河北元氏人，碩士，研究方向為園林植物資源評價與種質創新。E-mail：787472707@qq.com。

通信作者：周 勇，博士，講師，主要從事園林植物生理生態學研究。E-mail：zhouyong275@sina.com。

干旱地區的水資源匱乏，植被覆蓋率低，土體缺乏有效保護，土壤干燥松散、固持力差，水土流失嚴重［1］。干旱脅迫對植物的生長發育也有一定的影響和危害，嚴重時甚至會導致植物死亡，因此干旱脅迫已經成為影響植物生長及生態環境效益的重要因素。菌根技術是應用于育苗造林、生態修復以及提高植物抗逆性的一項生物技術，優良菌劑的研發對于菌根技術的應用具有重要意義，因此挖掘具有抗旱潛力的真菌菌株，對干旱地區菌根菌劑的選擇和在生態修復中的實際應用具有理論價值和指導意義。

共生真菌是能夠與植物形成互惠共生關系的真菌，外生菌根真菌和深色有隔內生真菌是目前研究較為關注的2類真菌，外生菌根真菌是菌絲體能夠侵染宿主植物營養根形成外生菌根的一類菌根真菌。外生菌根真菌資源豐富，全球約有6 000種外生菌根真菌，已有研究表明松科植物是最古老的外生菌根植物［2］。深色有隔內生真菌是一類小型內生真菌，定殖于植物的根表皮細胞、根皮層、維管組織細胞內或植物根細胞間隙，具有明顯帶有橫隔的深色的菌絲和微菌核結構［3-4］，分布廣泛，在干旱、重金屬污染、極地等極端環境中均有分布，近年受到了研究者的廣泛關注［5］。已有大量研究表明，接種外生菌根真菌或深色有隔內生真菌，能夠促進植物的生長和抗逆性［6-8］，在生態環境修復方面也具有一定的應用價值［9-11］。

目前關于外生菌根真菌和深色有隔內生真菌的研究主要集中于資源調查、分離鑒定以及對宿主植物影響的研究。有關真菌自身抗逆機制的相關研究相對較少，已有重金屬脅迫、鹽脅迫、低溫脅迫以及干旱脅迫對真菌的影響研究［12-17］，但真菌自身的抗逆性機制仍尚不明確。并且具有耐旱性的真菌菌株報道較少，因此本試驗利用PEG-6000模擬干旱脅迫，采用固體和液體2種方式進行真菌培養，測定4種真菌的菌落直徑、生物量、抗氧化酶活性、滲透調節物質含量等指標，分析干旱脅迫對真菌生長及生理特性的影響，初步探究真菌抗旱的生理機制并挖掘具有抗旱能力的潛力菌株，以期為研發可應用于干旱地區的優良菌劑提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

試驗于2022年4—6月于河北農業大學園林與旅游學院實驗室進行，供試菌株（圖1）為2種外生菌根真菌：血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus，Ps）、彩色豆馬勃（Pisolithus tinctorius，Pt）；2種深色有隔內生真菌：短梗蠕孢菌（Pleotrichocladium opacum，Po）、須殼孢屬（Pyrenochaeta sp.，Pss），上述菌株均分離自油松根系，經純化、鑒定后保存于河北農業大學園林與旅游學院實驗室。菌株使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基進行培養，儲存于27 ℃霉菌培養箱備用。

1.1.2 供試培養基

使用新鮮馬鈴薯、葡萄糖、植物凝膠、PEG-6000制備試驗所需的固體培養基和液體培養基，培養基含PEG-6000的濃度梯度為0、15%、25%、35%，共16個處理，每個處理3個重復。

1.2 試驗方法

1.2.1 含PEG-6000培養基的制備

將200 g削皮馬鈴薯切成小塊，沸水煮沸30 min后用4層紗布過濾，向無殘渣的濾液中加入20 g葡萄糖，充分攪拌溶解后定容至1 L，自然pH值。配制試驗所需的液體培養基時，在馬鈴薯提取液（葡萄糖20 g/L）中分別加入 0、150、250、350 g/L的PEG-6000固體，加熱溶解完全后分別分裝于250 mL錐形瓶中，每瓶100 mL，用無菌膜封口，在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min后備用，所得培養基即為分別含0、15%、25%、35% PEG-6000的液體培養基。配制固體培養基時在液體培養基配制的基礎上加入少量植物凝膠促凝，即可得到對應濃度的固體培養基。

1.2.2 真菌接種與培養

選取在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上生長良好的真菌菌落，在超凈工作臺中沿菌落邊緣切取直徑9 mm的菌餅，分別接種到 20 mL 的固體培養基和100 mL的液體培養基中，固體培養于27 ℃霉菌培養箱中進行，暗培養14 d。液體培養于27 ℃恒溫搖床上進行，以180 r/min的速度振蕩培養14 d。

1.2.3 真菌菌落直徑測定

采用十字交叉法測定菌落直徑，每隔1 d測量1次，每個處理重復3次，連續觀察14 d，至培養結束時共測量8次。

1.2.4 真菌菌絲生物量測定

液體培養結束后過濾收集菌絲，一部分用于測定抗氧化酶活性及丙二醛、脯氨酸以及可溶性蛋白含量。另一部分菌絲體稱量鮮重后于80 ℃烘干至恒重，以此確定菌絲體的含水量。2個部分菌絲體的干重之和即為真菌的生物量［18］。

1.2.5 真菌濾液pH值測定

液體培養結束后過濾收集真菌濾液，并使用pH計測定各處理濾液的pH值，每個處理重復3次。

1.2.6 真菌菌絲抗氧化酶活性測定

超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑光還原法測定，過氧化氫酶（CAT）活性采用高錳酸鉀滴定法測定［19］。

1.2.7 真菌菌絲丙二醛及滲透調節物質含量測定

丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定，脯氨酸含量采用茚三酮顯色法測定，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250法測定［20］。

1.3 數據分析

數據利用SPSS 24.0進行統計分析，用單因素方差分析，鄧肯氏新復極差法對試驗數據進行顯著性檢驗（α=0.05）。采用Excel 2016進行數據整理和圖表制作。

2 結果與分析

2.1 不同濃度PEG-6000對根系真菌生長的影響

由圖2可知，4種真菌的生長趨勢不同。Ps在 0、15% PEG-6000下菌落生長曲線呈冪函數趨勢，隨著PEG脅迫的增加，生長曲線變為線性趨勢。Pt在0、15%、25% PEG-6000下生長曲線呈指數型，而在35% PEG-6000下生長曲線呈線性趨勢。Po在0 PEG-6000下菌落直徑呈線性趨勢增長，在其余處理下生長曲線均為指數型，而Pss在所有處理下生長曲線均為指數型。

如圖3所示，4種真菌的14 d菌落直徑隨 PEG-6000 濃度的升高呈現不同的變化趨勢。Ps、Pt的菌落直徑隨PEG-6000濃度的升高呈先升高后降低的趨勢，而Po、Pss的菌落直徑呈逐漸升高的趨勢。Ps的菌落直徑在35% PEG-6000下相比對照顯著降低12.6%。Pt在15%、25% PEG-6000下菌落直徑相比對照顯著增加20.3%、13.9%，在35% PEG-6000下菌落生長受到抑制，相比對照顯著降低23.4%。Po菌落直徑在25%、35% PEG-6000下均顯著高于對照，分別增加40.6%、54.7%。Pss菌落直徑在各處理下相比對照分別顯著提高25.4%、39.0%、44.1%（Plt;0.05）。

固體培養14 d后4種真菌在不同處理下的菌落形態如圖4所示。Ps在不加PEG-6000下菌落大而厚實，菌落全緣，顏色呈中間深紅邊緣淺紅。隨著PEG-6000濃度的升高， 菌絲逐漸稀少， 質地

呈顆粒狀。菌落顏色變淺且顏色不均勻，邊緣逐漸呈放射狀。Pt在0濃度PEG-6000下菌絲細長，質地疏松，菌落顏色呈棕黃色。隨著PEG-6000濃度的升高，菌落質地緊密呈絨毛狀，菌落顏色逐漸變淺。Po在0濃度PEG-6000下菌落疏松，菌落顏色呈淺灰色，邊緣全緣。隨著PEG-6000濃度升高菌落致密，菌落顏色逐漸加深。Pss在0濃度PEG-6000下菌落質地致密，菌落顏色為淺灰色。隨著 PEG-6000 濃度的升高，菌絲顏色逐漸變淺，菌落邊緣逐漸呈波浪形鋸齒狀。

2.2 不同濃度PEG-6000對根系真菌生物量的影響

由圖5可知，在PEG脅迫下4種根系真菌均能夠生長。隨著脅迫濃度的增加，4種真菌的生物量呈現出不同的變化趨勢。其中Ps、Pss生物量隨脅迫濃度增加呈先升高后降低的趨勢，均在15% PEG-6000 下達到最大值，相比對照分別顯著提高129.8%、211.0%，且Ps在25% PEG-6000下生物量提高125.2%，Pss在25%、35% PEG-6000 下生物量分別提高159.6%、137.8%。Pt生物量隨脅迫濃度的增加呈先降低后升高的趨勢，在35% PEG-6000下相比對照仍顯著提高27.0%。Po生物量隨脅迫程度增加呈逐漸升高的趨勢，相比對照分別顯著提高31.1%、81.0%、104.5%（Plt;0.05）。整體上，相較對照Ps在PEG脅迫下對于生物量的提高優于Pt；Pss對于生物量的提高優于Po。

2.3 不同濃度PEG-6000對根系真菌濾液pH值的影響

如圖6所示，在PEG脅迫下真菌濾液的pH值均有所降低。Ps、Pt濾液pH值呈先降低后升高的趨勢，均在25% PEG-6000下達到最低，相比對照分別顯著降低1.92、1.44個單位（Plt;0.05）。隨著PEG-6000濃度的升高，Po、Pss濾液pH值相比對照均顯著降低，且在35% PEG-6000下達到最低，分別降低了0.39、0.35個單位。4種真菌在受到PEG脅迫時濾液pH值均有所降低，說明真菌在受到PEG脅迫時能通過產生H+來維持其正常生長，最低pH值不同可能與其最適生長pH值有關。

2.4 不同濃度PEG-6000對根系真菌抗氧化酶活性的影響

由圖7、圖8可知，隨著PEG脅迫的增加，Ps的SOD活性和CAT活性均有所提高，且在15%、25% PEG-6000下與對照存在顯著差異（Plt;0.05），相比對照分別提高37.1%、60.5%和43.4%、64.6%。

隨著PEG脅迫的增加，Pt的SOD活性均有所提高，在15%、25% PEG-6000下差異達到顯著水平（Plt;0.05），相比對照分別提高13.0%、48.9%，CAT活性在25%、35% PEG-6000下相比對照分別顯著提高35.8%、56.8%。隨著PEG脅迫的增加，Po和Pss的SOD和CAT活性相比對照均顯著提高（Plt;0.05），Po的SOD活性分別提高59.8%、77.6%、48.7%，CAT活性分別提高60.2%、83.7%、40.3%。Pss的SOD活性分別提高74.2%、80.2%、82.0%，CAT活性分別提高155.9%、125.2%、122.4%。

4種根系真菌在低濃度PEG脅迫下能夠促進其體內抗氧化酶活性的提高，而在最高濃度的 PEG-6000 處理下除Pss菌株的SOD活性和Pt的CAT活性仍有所提高外，其他菌株體內抗氧化酶活性的提高程度有所降低，但在較高濃度PEG-6000下Po和Pss菌株抗氧化酶活性仍顯著高于對照，總得來說，在PEG脅迫下真菌提高抗氧化酶活性的效果為Po、Pss優于Ps、Pt，Pss優于Po，Ps優于Pt。

2.5 不同濃度PEG-6000對根系真菌丙二醛含量的影響

如圖9所示，隨著PEG-6000濃度的升高，真菌MDA含量呈不同的變化趨勢。Ps、Pss在受到PEG脅迫時MDA含量呈現先降低后升高的趨勢，Pt、Po的MDA含量隨脅迫程度的增加呈逐漸上升的趨勢。Ps在15% PEG-6000下MDA含量與對照存在顯著差異，相比對照顯著降低了38.8%。Pt在25%、35% PEG-6000下MDA含量與對照存在顯著差異，相比對照分別增加了144.9%、174.2%。Po在PEG-6000處理下MDA含量均顯著高于對照，分別增加了26.9%、90.3%、146.6%。Pss在PEG-6000處理下MDA含量均顯著低于對照，分別降低95.7%、75.7%、23.9%（Plt;0.05）。Ps、Pss在受到PEG脅迫時MDA含量存在顯著降低，說明其通過一定的體內調節減少了體內MDA含量的積累。而Pt、Po體內MDA含量積累較多說明其體內調節能力相比其他2種菌株較弱。

2.6 不同濃度PEG-6000對根系真菌滲透調節物質的影響

由圖10可知，隨著PEG-6000濃度的升高，Ps、Pt、Po的脯氨酸含量均呈先升高后降低的趨勢，且在15% PEG-6000下脯氨酸含量達到最大值。Pss的脯氨酸含量隨PEG-6000濃度的升高逐漸升高，且在35% PEG-6000下達到最大值。Ps的脯氨酸含量僅在15% PEG-6000下相比對照顯著增加，增加了46.1%，Pt在PEG-6000處理下的脯氨酸含量與對照相比均存在顯著差異，相比對照分別增加121.9%、45.6%、19.7%。Po在15% PEG-6000 下脯氨酸含量相比對照顯著增加，增加了24.8%。Pss在PEG-6000處理下的脯氨酸含量均顯著高于對照，相比對照分別增加31.8%、41.6%、131.1%（Plt;0.05）。

如圖11所示，Ps的可溶性蛋白含量隨PEG濃度的升高呈先上升后下降的趨勢，且在PEG-6000處理下可溶性蛋白含量均顯著高于對照，相比對照分別提高99.9%、47.4%、32.8%（Plt;0.05）。Pt的可溶性蛋白含量隨PEG-6000濃度增加呈逐漸下降的趨勢，且在35% PEG-6000下可溶性蛋白含量最低，相比對照顯著降低52.1%。Po、Pss菌株的可溶性蛋白含量隨PEG-6000濃度的增加呈逐漸上升的趨勢，在35% PEG-6000下達到最大值。Po的可溶性蛋白含量在PEG-6000處理下均顯著高于對照組，相比對照分別增加54.6%、75.4%、170.8%。Pss的可溶性蛋白含量在PEG-6000處理下均顯著高于對照，相比對照分別顯著增加163.0%、259.9%、267.6%（Plt;0.05）。

在受到PEG脅迫時，4種真菌中多數能夠通過提高自身脯氨酸和可溶性蛋白的產生來應對脅迫，表現為低濃度脅迫下促進產生，高濃度脅迫下產生含量有所降低，可能與脅迫程度過高有關。相較對照而言，在PEG脅迫下Pss對于脯氨酸和可溶性蛋白含量的提高優于Po，其在高濃度下仍能產生較多的脯氨酸和可溶性蛋白。相較對照，Ps對于可溶性蛋白含量的提高要優于Pt。2種深色有隔內生真菌（Po、Pss）對于可溶性蛋白含量的提高優于2種外生菌根真菌（Ps、Pt）。

3 討論

干旱脅迫是影響生物生存的一種重要的非生物脅迫，干旱脅迫使生物可利用水分缺乏，從而導致其生長受到抑制。目前實驗室條件下，PEG-6000 是被廣泛應用于模擬干旱脅迫的化合物［21-23］。本試驗利用PEG-6000模擬干旱脅迫，試驗表明在脅迫處理下4種真菌的生長情況存在差異。已有研究表明較低濃度的PEG脅迫能夠促進菌絲生長，而PEG濃度較高時，菌絲的生長會受到抑制［24］。在本試驗中Ps的生長曲線在15% PEG-6000 下呈冪函數趨勢，而在高濃度PEG-6000下生長曲線呈線性趨勢，且菌落直徑在高濃度下有所降低，Pt的生長曲線在35% PEG-6000下為線性，菌落直徑顯著降低，而其余處理下生長曲線均為指數型，菌落直徑顯著增加。這說明Ps、Pt在低濃度的PEG脅迫下菌絲生長受到了促進，而高濃度PEG處理下生長受到抑制，這與前人的研究結果［24］一致。而Po、Pss在PEG-6000處理下生長曲線均為指數型，且菌落直徑呈上升趨勢，這說明Po、Pss在PEG脅迫處理下的生長均受到促進作用，這可能與真菌的種類不同有關。

在脅迫環境下，真菌的生長情況及生物量是反映其抗性的重要指標［25］。4種真菌在PEG脅迫下均能夠正常生長，說明其對PEG脅迫具有一定的耐受性。除Pt外Ps、Po、Pss菌株在PEG脅迫下的生物量均高于對照組，且4種真菌的濾液pH值在PEG脅迫下相比對照均有所降低。這說明真菌在受到脅迫時能夠分泌酸性物質來調節其生長環境的酸堿度，從而促進其生長。多數情況下ECMF喜酸性環境，最適pH值在4.0～6.0［26］，但不同菌種對pH值的偏好也存在較大差異［27］，也存在真菌偏好微堿性生長環境的情況［28］。在本試驗中Ps、Pt濾液的pH值大部分呈酸性而Po、Pss在各個PEG-6000濃度下濾液的pH值呈弱堿性，這可能與真菌的最適pH值有關。

在正常的環境條件下，細胞內活性氧（ROS）的產生和保護酶發揮作用進行活性氧的清除處于平衡狀態，然而當生物體受到環境脅迫時，細胞內的ROS產生增多［29］，由于產生過量的ROS抗氧化系統并不能及時將其清除，進而導致ROS在生物體內發生大量積累，最終導致細胞受到氧化損傷。SOD、CAT是抗氧化系統中用于清除ROS和H2O2的重要保護酶，在細胞內相互協作發揮維持ROS產生與清除平衡狀態的作用，從而對生物體抗逆性的提高發揮一定作用［30］。在本試驗中，4種真菌在受到PEG脅迫時其抗氧化酶活性存在一定程度的升高，這與劉燕霞的研究結果具有相似性，其研究中所用真菌的SOD活性在干旱脅迫下均高于對照［31］。這說明真菌細胞可能通過合成抗氧化酶來清除干旱環境下積累的ROS，以此來緩解自身受到的氧化傷害。試驗中Po、Pss對抗氧化酶活性的提高程度要高于Ps、Pt，說明Po、Pss應對PEG脅迫的能力要強于Ps、Pt。

滲透調節是生物抵御脅迫環境的一種重要的生理調節，通過滲透調節可以提高其在脅迫環境下的適應性［32］。脯氨酸是生物體內重要的滲透保護物質，在脅迫環境中可以大量積累從而有效地調節生物的代謝，降低脅迫環境對其造成的傷害。其含量可以反映逆境對生物的危害程度和生物對脅迫的抵抗力［33］?？扇苄缘鞍资菨B透調節中一種重要的滲透調節物質，它能夠促進菌絲細胞的滲透調節從而提高菌絲細胞對脅迫的耐受性。在本試驗中，Ps、Pt、Po的脯氨酸含量均呈先上升后下降的趨勢，且在15% PEG-6000下達到最大，而Pss的脯氨酸含量呈顯著上升趨勢。除Pt外真菌的可溶性蛋白含量在PEG脅迫處理下均大于對照，這說明菌株在受到PEG脅迫時，脯氨酸和可溶性蛋白可能參與滲透調節來提高菌絲對PEG的耐受性［34］。MDA是細胞在脅迫環境下膜脂過氧化的主要產物，其含量可以反映細胞所受脅迫的程度［35-36］。隨PEG濃度的增加，Pt、Po的MDA含量呈顯著上升趨勢，而Ps、Pss的MDA含量隨濃度的變化呈先降低后升高的趨勢，且在15% PEG-6000下相比對照顯著降低，這可能與參與滲透調節物質含量的增加以及抗氧化酶活性的提高有關。

4 結論

本研究表明，在PEG脅迫下4種真菌均能夠正常生長，能通過降低培養液pH值，提高SOD活性、CAT活性以及提高脯氨酸含量和可溶性蛋白含量來應對脅迫環境。在PEG脅迫下Po、Pss生物量的積累優于Ps、Pt。Po、Pss相比Ps、Pt對抗氧化酶活性的提高和提高滲透調節物質的含量更多，綜合分析試驗結果可知，2種深色有隔內生真菌Po和Pss在PEG脅迫下生長狀況優于2種外生菌根真菌Ps和Pt，4種真菌的耐旱能力大小為：Pssgt;Pogt;Psgt;Pt。4種真菌具有作為耐旱菌劑的潛力以應用于干旱地區促進植物生長及增強植物抗旱性，對干旱地區的育苗造林和生態修復具有重大意義。

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