高效解磷菌RL-7的鑒定、解磷能力及促生效應(yīng)

摘要：解磷菌能夠提高土壤中有效磷供給，減少磷肥施用量，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。本研究以筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期分離的高解磷菌RL-7為研究對(duì)象，利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定菌株種屬，采用正交試驗(yàn)法明確菌株在不同初始pH值、培養(yǎng)溫度和接種量等培養(yǎng)條件下的解磷特性，通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)菌株發(fā)酵液中乙酸產(chǎn)生量，測(cè)定菌株產(chǎn)IAA能力和對(duì)番茄苗的促生效果。結(jié)果顯示，高解磷菌株RL-7為克雷伯氏菌（Klebsiella sp.），該菌株在溫度35 ℃、初始接種量3%、pH值7.0的條件下，溶磷量最高，達(dá)537.34 mg/L。不同的培養(yǎng)條件下，發(fā)酵液pH值均在4.23～4.67之間。菌株具有產(chǎn)乙酸能力，發(fā)酵液中乙酸含量達(dá)1.14 g/L。在不添加色氨酸和添加色氨酸LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，IAA濃度分別為24.13 μg/mL和110.90 μg/mL。在番茄苗促生試驗(yàn)中，株高、莖粗、地上部鮮重和地下部鮮重與對(duì)照差異顯著，且番茄苗中全磷含量明顯高于對(duì)照。說(shuō)明高解磷菌RL-7具有較高的解磷能力，同時(shí)具備產(chǎn)IAA能力，能夠很好地促進(jìn)番茄苗期生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：根際；解磷菌；鑒定；條件優(yōu)化；乙酸；促生

中圖分類號(hào)：S182 "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）14-0280-05

收稿日期：2023-08-15

基金項(xiàng)目：重慶市農(nóng)業(yè)發(fā)展資金項(xiàng)目（編號(hào)：cqaas2023sjczqn029、cqaas2023sjczhx004）；重慶市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：CSTB2022NSCQ-MSX0508）。

作者簡(jiǎn)介：馬連杰（1982—），女，河北易縣人，碩士，助理研究員，主要從事肥效微生物和生防微生物開(kāi)發(fā)利用研究。E-mail：malianjie_0816@163.com。

通信作者：廖敦秀，研究員，主要從事植物保護(hù)和農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用研究。E-mail：664852751@qq.com。

磷是植物生長(zhǎng)必需的三大元素之一，在光合碳循環(huán)、信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程中起關(guān)鍵作用［1］。我國(guó)74%以上的耕地土壤缺磷，僅有0.1%的有效磷可供植物吸收利用［2］。為避免磷素缺乏對(duì)糧食增產(chǎn)的制約，每年對(duì)耕地施用大量磷肥；但大部分磷進(jìn)入土壤后，易與Fe3+、Al3+等金屬離子結(jié)合為難溶性磷酸鹽形態(tài)［3］，導(dǎo)致磷素利用率較低，造成了大量的浪費(fèi)。

解磷菌（phosphate solubilizing microorganism，PSM）是一類具有解磷效果的微生物，能夠?qū)㈦y溶性磷轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的有效磷，對(duì)土壤中磷素形態(tài)具有重要的影響［4-6］。目前報(bào)道的解磷菌包含細(xì)菌、真菌和放線菌，共20多個(gè)屬。其中種類和數(shù)量最多的為細(xì)菌，如芽孢桿菌屬、歐文氏菌屬、假單胞菌屬、伯克氏菌屬、腸細(xì)菌屬、微球菌屬、根瘤菌屬、土壤桿菌屬、色桿菌屬、黃桿菌屬等［7］。解磷菌主要通過(guò)分泌葡萄糖酸、乙酸、草酸及檸檬酸等有機(jī)酸溶解無(wú)機(jī)磷，通過(guò)分泌堿性和酸性磷酸酶分解有機(jī)磷［8-9］。目前，一些解磷菌已經(jīng)制成生物肥料應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，能夠顯著促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量的同時(shí)降低了化學(xué)磷肥的投入［10-13］。本研究對(duì)前期從玉米根際土壤中分離篩選得到的1株高效解磷克雷伯氏菌RL-7，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并對(duì)其解磷條件進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)番茄苗促生試驗(yàn)驗(yàn)證該菌株的促生效果，以期為其在生物肥料的研發(fā)提供微生物資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

菌株RL-7為前期通過(guò)透明圈篩選法，從玉米根際土中獲得。試驗(yàn)于2020—2022年在重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院開(kāi)展。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水定容至1 000 mL。LB固體培養(yǎng)基在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉 15～20 g，121 ℃滅菌20 min備用。

NBRIP液體培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，Ca3（PO4）2 5 g，MgCl2·6H2O 5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.2 g，（NH4）2SO4 0.1 g，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min備用。

PKO固體培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，Ca3（PO4）2 5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，MnSO4 0.03 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，酵母膏0.5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.8～7.0。121 ℃滅菌20 min備用。

1.1.3 供試試劑與設(shè)備

PCR 擴(kuò)增用試劑購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，DNA 細(xì)菌提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，PCR儀購(gòu)自 BIO-RAD 公司。

1.1.4 供試種子

番茄種子：渝粉8號(hào)，重慶科光種苗有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的鑒定

在LB固體平板上進(jìn)行菌株純化，在PKO固體培養(yǎng)基上觀測(cè)RL-7菌株產(chǎn)生的透明圈及單菌落形態(tài)特征，同時(shí)利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行初步鑒定。采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，采用16S rDNA基因通用引物27F/1492R進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至重慶崇浩生物技術(shù)有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。測(cè)序片段結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)分析，同時(shí)利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.2 解磷條件優(yōu)化

采用正交試驗(yàn)方法，設(shè)置接種量、起始pH值和培養(yǎng)溫度3個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置4個(gè)水平，詳見(jiàn)表1。接種量梯度設(shè)置為2%、3%、4%和5%，培養(yǎng)溫度梯度設(shè)置為25、30、35、40 ℃，起始pH值梯度設(shè)置為5、6、7和8，每個(gè)處理3次重復(fù)。采用NBRIP培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株，培養(yǎng)基滅菌冷卻后在超凈臺(tái)內(nèi)調(diào)節(jié)起始pH值。原始菌株在LB液體培養(yǎng)中培養(yǎng)36 h后利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液濃度，調(diào)節(jié)菌液濃度至D600 nm=1.0。按照設(shè)計(jì)的接種量轉(zhuǎn)接原始菌液至NBRIP培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為160 r/min的搖床中培養(yǎng)7 d后，菌液在4 ℃、8 000 r/min 離心 10 min，棄沉淀，收集上清液，利用鉬銻抗比色法測(cè)定可溶性磷含量，同時(shí)測(cè)定上清液的pH值。

1.2.3 菌株產(chǎn)酸特性

將菌株接種至在NBRIP液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)48 h后，10 000 r/min離心15 min后收集上清液，用 0.22 μm 水系膜過(guò)濾，收集過(guò)濾后的上清液，參照高威等的方法［14］，利用液相色譜測(cè)定培養(yǎng)液中乙酸含量。

1.2.4 菌株產(chǎn)IAA能力

共設(shè)置3個(gè)處理，對(duì)照、RL-7（N）、RL-7（Y）。對(duì)照為不加菌不加色氨酸處理，RL-7（N）為加菌不加色氨酸處理，RL-7（Y）為加菌加色氨酸處理。每個(gè)處理3次重復(fù)。取0.3 mL菌原液加入裝有30 mL不同處理培養(yǎng)基的三角瓶中。30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后離心，每瓶取1 mL上清液轉(zhuǎn)移至2 mL EP管中備用。然后在每管中加入等量S2比色液，室溫黑暗靜置 30 min 后用紫外分光光度計(jì)在530 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各菌株的IAA分泌量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：配制濃度為0、3、6、9、12、15 μg/mL 的生長(zhǎng)素標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取1 mL加入等量的S2比色液，于黑暗中靜置反應(yīng)30 min后用紫外分光光度計(jì)在530 nm處測(cè)定吸光度。利用測(cè)定數(shù)據(jù)在Excel軟件中制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 番茄苗期促生效果

將培養(yǎng)好的RL-7菌液在4 ℃、6 000 r/min離心10 min后，倒掉上清，用滅菌水清洗菌體2次，最后用無(wú)菌水稀釋獲得 107 CFU/mL 的菌液。購(gòu)買商用育苗基質(zhì)，育苗前 1 d 按5%比例將菌液加至基質(zhì)中拌勻，整個(gè)育苗過(guò)程不再添加菌液，不施用其他肥料。設(shè)計(jì)空白對(duì)照，以無(wú)菌水代替菌液。育苗結(jié)束后隨機(jī)選取對(duì)照和添加菌液處理各10株，對(duì)番茄株高、莖粗、地上（下）部鮮重和葉綠素含量（SPAD值）等生長(zhǎng)指標(biāo)，水分、全氮、全磷和全鉀含量等養(yǎng)分指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)測(cè)定與分析處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel、MEGA和SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 RL-7菌株平板解磷效果

RL-7菌株純化后，在PKO無(wú)機(jī)磷平板上培養(yǎng)2 d后，有明顯透明圈出現(xiàn)，單菌落呈圓形，米黃色、表面光滑、邊緣整齊、中間凸起，挑起有粘連、略透明（圖1）。

2.2 RL-7菌株分子生物學(xué)鑒定

利用通用引物27F和1492R對(duì)解磷菌株RL-7

基因組進(jìn)行16S序列擴(kuò)增，獲得1 410 bp長(zhǎng)度序列。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中序列比對(duì)，結(jié)果顯示，RL-7菌株與Klebsiella sp.同源性達(dá)99%。同時(shí)利用MEGA 7.0軟件根據(jù)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2），結(jié)合平板形態(tài)，將RL-7菌株初步鑒定為克雷伯氏菌。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

最適發(fā)酵條件結(jié)果見(jiàn)表2，可以看出，最優(yōu)條件下RL-7菌株最大溶磷量達(dá)537.34 mg/L，對(duì)應(yīng)發(fā)酵條件為溫度35 ℃，接種量3%，初始pH值7。從極差（R）來(lái)看，對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響最大的因素為溫度，

R為97.80；其次為接種量，R為78.92；最后為初始pH值，R為31.45。故最適發(fā)酵溫度為35 ℃左右。同時(shí)對(duì)發(fā)酵后上清液的pH值進(jìn)行了測(cè)定，可以看到pH值范圍在4.23～4.67之間，初步判定發(fā)酵液pH值與初始pH值關(guān)聯(lián)不大，同時(shí)相應(yīng)

條件下對(duì)照pH值在6.71～7.45之間。發(fā)酵液呈明顯酸性，推測(cè)溶磷作用可能與產(chǎn)生有機(jī)酸有關(guān)。

2.4 產(chǎn)乙酸能力

通過(guò)高效液相色譜手段檢測(cè)RL-7菌株發(fā)酵上清液中乙酸含量，結(jié)果如圖3所示，在5.0 min處出現(xiàn)最高峰，此峰為乙酸的出峰位點(diǎn)。根據(jù)出峰面積計(jì)算，發(fā)酵液中乙酸含量為1.14 g/L，說(shuō)明RL-7菌株能夠分泌較高含量的乙酸。初步推斷分泌有機(jī)酸為RL-7解磷菌的主要解磷方式。

2.5 產(chǎn)IAA能力

RL-7菌株在不添加色氨酸和添加色氨酸LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)均具有產(chǎn)IAA能力，產(chǎn)IAA濃度分別為24.13、 110.90 μg/mL（表3）。 添加色氨酸后大大提升了產(chǎn)IAA能力，具有潛在促生能力。

2.6 苗期促生效果

在番茄育苗試驗(yàn)中，添加RL-7菌株的基質(zhì)表現(xiàn)出明顯的促生效果（圖4）。由表4可知，相較于

對(duì)照，菌液處理的番茄苗株高、莖粗、地上部鮮重和地下部鮮重差異顯著，分別比對(duì)照增加8.77%、20.44%、73.42%和50.00%。葉綠素含量在兩者之間沒(méi)有明顯差異，僅比對(duì)照增加0.16%。

2.7 菌株RL-7對(duì)番茄植株養(yǎng)分含量的影響

對(duì)番茄苗地上部分樣品水分、全氮、全磷和全鉀指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5， 菌液處理番茄苗全磷含量達(dá)6.26 g/kg，為對(duì)照的1.20倍，其他指標(biāo)變化不明顯。說(shuō)明解磷菌RL-7的施用能夠提升植株中全磷的含量。

3 討論

解磷微生物種類繁多，目前發(fā)現(xiàn)的主要有芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬、沙雷氏菌屬等［15］，但具有高效解磷效果的菌種資源仍非常有限。本研究篩選獲得的RL-7菌株為克雷伯氏菌，最優(yōu)條件下解磷量為537.34 mg/L，相較于先前報(bào)道的解磷菌解磷能力處于較高水平。萬(wàn)水霞等分離得到的2株優(yōu)良PGPR菌株CH07和FD11，其溶磷量分別為368.5 mg/L和321.5 mg/L［16］。于淼對(duì)解磷菌623-3培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在最優(yōu)條件下，其解磷量為420.953 mg/L［17］。唐岷宸等發(fā)現(xiàn)1株高效解磷菌貝萊斯芽孢桿菌，其溶磷量達(dá)495.4 mg/L［14］。陳容彬等獲得的伯克霍爾德菌PB在優(yōu)化培養(yǎng)條件后，溶磷量為569.33 mg/L［18］。選用3因素4水平正交試驗(yàn)分析pH值、溫度和接菌量對(duì) RL-7 菌株溶磷能力的影響，明確了3個(gè)因素的影響程度和水平，對(duì)后期菌株的應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。

解磷菌次生代謝產(chǎn)物中是否含有IAA在研究中也備受關(guān)注。IAA具有能夠直接促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用，解磷菌RL-7 具有產(chǎn)IAA能力，分泌量為24.13 μg/mL，大部分解磷細(xì)菌的解磷作用與其代謝產(chǎn)物中的低分子有機(jī)酸密切相關(guān)。這些有機(jī)酸能夠與Ca+、Mg+、Fe+等陽(yáng)離子結(jié)合釋放出磷酸根離子，同時(shí)能夠降低環(huán)境pH值，促進(jìn)難溶性磷酸鹽的溶解［19］。RL-7菌株代謝產(chǎn)物中乙酸含量達(dá)1.14 g/L，與其他文獻(xiàn)中的解磷菌株［20-21］相比，分泌量較高。但乙酸是否為該菌株解磷的主要有機(jī)酸，還有哪些種類的有機(jī)酸參與，有待進(jìn)一步研究。另外菌株發(fā)酵后pH值下降明顯，且與初始培養(yǎng)基pH值無(wú)關(guān)聯(lián)性。當(dāng)初始pH值分別為5、6、7、8時(shí)，發(fā)酵后pH值均在4.23～4.67之間。pH值的大幅降低推測(cè)分泌有機(jī)酸是該菌株解磷的主要途徑，但仍需下一步研究驗(yàn)證。

為驗(yàn)證RL-7菌株的實(shí)際應(yīng)用效果，選擇育苗基質(zhì)中按5%的比例添加菌株的方法，測(cè)定該菌株對(duì)番茄苗期株高、莖粗、地上部鮮重和地下部鮮重均有明顯促進(jìn)作用。另外，番茄地上部植株內(nèi)全磷含量相比于對(duì)照有明顯增加，但本研究未對(duì)基質(zhì)有效磷的含量以及磷的具體去向進(jìn)行分析，可在后續(xù)研究中開(kāi)展。

4 結(jié)論

本研究篩選得到1株具有高效解磷能力的細(xì)菌菌株RL-7，經(jīng)鑒定為克雷伯氏菌。該菌株在溫度35 ℃、初始接菌量3%、pH值7.0的最適條件下，溶磷量為537.34 mg/L。該菌具有產(chǎn)大量乙酸的能力，分泌有機(jī)酸可能是其主要解磷途徑。添加該菌的育苗基質(zhì)能夠促進(jìn)番茄苗的生長(zhǎng)和番茄植株內(nèi)磷素的積累。

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