高效解磷菌RL-7的鑒定、解磷能力及促生效應

摘要：解磷菌能夠提高土壤中有效磷供給，減少磷肥施用量，促進植物生長。本研究以筆者所在實驗室前期分離的高解磷菌RL-7為研究對象，利用形態學和分子生物學方法鑒定菌株種屬，采用正交試驗法明確菌株在不同初始pH值、培養溫度和接種量等培養條件下的解磷特性，通過高效液相色譜法檢測菌株發酵液中乙酸產生量，測定菌株產IAA能力和對番茄苗的促生效果。結果顯示，高解磷菌株RL-7為克雷伯氏菌（Klebsiella sp.），該菌株在溫度35 ℃、初始接種量3%、pH值7.0的條件下，溶磷量最高，達537.34 mg/L。不同的培養條件下，發酵液pH值均在4.23～4.67之間。菌株具有產乙酸能力，發酵液中乙酸含量達1.14 g/L。在不添加色氨酸和添加色氨酸LB培養基中培養，IAA濃度分別為24.13 μg/mL和110.90 μg/mL。在番茄苗促生試驗中，株高、莖粗、地上部鮮重和地下部鮮重與對照差異顯著，且番茄苗中全磷含量明顯高于對照。說明高解磷菌RL-7具有較高的解磷能力，同時具備產IAA能力，能夠很好地促進番茄苗期生長。

關鍵詞：根際；解磷菌；鑒定；條件優化；乙酸；促生

中圖分類號：S182 "文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）14-0280-05

收稿日期：2023-08-15

基金項目：重慶市農業發展資金項目（編號：cqaas2023sjczqn029、cqaas2023sjczhx004）；重慶市自然科學基金面上項目（編號：CSTB2022NSCQ-MSX0508）。

作者簡介：馬連杰（1982—），女，河北易縣人，碩士，助理研究員，主要從事肥效微生物和生防微生物開發利用研究。E-mail：malianjie_0816@163.com。

通信作者：廖敦秀，研究員，主要從事植物保護和農業廢棄物資源化利用研究。E-mail：664852751@qq.com。

磷是植物生長必需的三大元素之一，在光合碳循環、信號傳導等過程中起關鍵作用［1］。我國74%以上的耕地土壤缺磷，僅有0.1%的有效磷可供植物吸收利用［2］。為避免磷素缺乏對糧食增產的制約，每年對耕地施用大量磷肥；但大部分磷進入土壤后，易與Fe3+、Al3+等金屬離子結合為難溶性磷酸鹽形態［3］，導致磷素利用率較低，造成了大量的浪費。

解磷菌（phosphate solubilizing microorganism，PSM）是一類具有解磷效果的微生物，能夠將難溶性磷轉化為植物可吸收利用的有效磷，對土壤中磷素形態具有重要的影響［4-6］。目前報道的解磷菌包含細菌、真菌和放線菌，共20多個屬。其中種類和數量最多的為細菌，如芽孢桿菌屬、歐文氏菌屬、假單胞菌屬、伯克氏菌屬、腸細菌屬、微球菌屬、根瘤菌屬、土壤桿菌屬、色桿菌屬、黃桿菌屬等［7］。解磷菌主要通過分泌葡萄糖酸、乙酸、草酸及檸檬酸等有機酸溶解無機磷，通過分泌堿性和酸性磷酸酶分解有機磷［8-9］。目前，一些解磷菌已經制成生物肥料應用于農業生產中，能夠顯著促進植物生長，提高產量的同時降低了化學磷肥的投入［10-13］。本研究對前期從玉米根際土壤中分離篩選得到的1株高效解磷克雷伯氏菌RL-7，進行分子生物學鑒定，并對其解磷條件進行優化，并通過番茄苗促生試驗驗證該菌株的促生效果，以期為其在生物肥料的研發提供微生物資源和理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

菌株RL-7為前期通過透明圈篩選法，從玉米根際土中獲得。試驗于2020—2022年在重慶市農業科學院開展。

1.1.2 供試培養基

LB液體培養基：胰蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水定容至1 000 mL。LB固體培養基在LB液體培養基中加入瓊脂粉 15～20 g，121 ℃滅菌20 min備用。

NBRIP液體培養基：葡萄糖10 g，Ca3（PO4）2 5 g，MgCl2·6H2O 5 g，FeSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.2 g，（NH4）2SO4 0.1 g，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min備用。

PKO固體培養基：葡萄糖10 g，Ca3（PO4）2 5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，MnSO4 0.03 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，酵母膏0.5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.8～7.0。121 ℃滅菌20 min備用。

1.1.3 供試試劑與設備

PCR 擴增用試劑購自寶生物工程（大連）有限公司，DNA 細菌提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，PCR儀購自 BIO-RAD 公司。

1.1.4 供試種子

番茄種子：渝粉8號，重慶科光種苗有限公司生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的鑒定

在LB固體平板上進行菌株純化，在PKO固體培養基上觀測RL-7菌株產生的透明圈及單菌落形態特征，同時利用分子生物學手段進行初步鑒定。采用細菌DNA提取試劑盒提取細菌DNA，采用16S rDNA基因通用引物27F/1492R進行目的片段擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至重慶崇浩生物技術有限公司進行基因測序。測序片段結果在NCBI數據庫中進行序列比對分析，同時利用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹。

1.2.2 解磷條件優化

采用正交試驗方法，設置接種量、起始pH值和培養溫度3個因素，每個因素設置4個水平，詳見表1。接種量梯度設置為2%、3%、4%和5%，培養溫度梯度設置為25、30、35、40 ℃，起始pH值梯度設置為5、6、7和8，每個處理3次重復。采用NBRIP培養基培養菌株，培養基滅菌冷卻后在超凈臺內調節起始pH值。原始菌株在LB液體培養中培養36 h后利用紫外分光光度計測定菌液濃度，調節菌液濃度至D600 nm=1.0。按照設計的接種量轉接原始菌液至NBRIP培養基中，在轉速為160 r/min的搖床中培養7 d后，菌液在4 ℃、8 000 r/min 離心 10 min，棄沉淀，收集上清液，利用鉬銻抗比色法測定可溶性磷含量，同時測定上清液的pH值。

1.2.3 菌株產酸特性

將菌株接種至在NBRIP液體培養基中，在30 ℃、160 r/min搖床中培養48 h后，10 000 r/min離心15 min后收集上清液，用 0.22 μm 水系膜過濾，收集過濾后的上清液，參照高威等的方法［14］，利用液相色譜測定培養液中乙酸含量。

1.2.4 菌株產IAA能力

共設置3個處理，對照、RL-7（N）、RL-7（Y）。對照為不加菌不加色氨酸處理，RL-7（N）為加菌不加色氨酸處理，RL-7（Y）為加菌加色氨酸處理。每個處理3次重復。取0.3 mL菌原液加入裝有30 mL不同處理培養基的三角瓶中。30 ℃、180 r/min振蕩培養7 d后離心，每瓶取1 mL上清液轉移至2 mL EP管中備用。然后在每管中加入等量S2比色液，室溫黑暗靜置 30 min 后用紫外分光光度計在530 nm處測定吸光度，根據標準曲線計算各菌株的IAA分泌量。

標準曲線制備：配制濃度為0、3、6、9、12、15 μg/mL 的生長素標準溶液，各取1 mL加入等量的S2比色液，于黑暗中靜置反應30 min后用紫外分光光度計在530 nm處測定吸光度。利用測定數據在Excel軟件中制作標準曲線。

1.2.5 番茄苗期促生效果

將培養好的RL-7菌液在4 ℃、6 000 r/min離心10 min后，倒掉上清，用滅菌水清洗菌體2次，最后用無菌水稀釋獲得 107 CFU/mL 的菌液。購買商用育苗基質，育苗前 1 d 按5%比例將菌液加至基質中拌勻，整個育苗過程不再添加菌液，不施用其他肥料。設計空白對照，以無菌水代替菌液。育苗結束后隨機選取對照和添加菌液處理各10株，對番茄株高、莖粗、地上（下）部鮮重和葉綠素含量（SPAD值）等生長指標，水分、全氮、全磷和全鉀含量等養分指標進行測定。

1.3 數據測定與分析處理

所有試驗數據利用Excel、MEGA和SPSS軟件進行數據處理、統計分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 RL-7菌株平板解磷效果

RL-7菌株純化后，在PKO無機磷平板上培養2 d后，有明顯透明圈出現，單菌落呈圓形，米黃色、表面光滑、邊緣整齊、中間凸起，挑起有粘連、略透明（圖1）。

2.2 RL-7菌株分子生物學鑒定

利用通用引物27F和1492R對解磷菌株RL-7

基因組進行16S序列擴增，獲得1 410 bp長度序列。通過NCBI數據庫中序列比對，結果顯示，RL-7菌株與Klebsiella sp.同源性達99%。同時利用MEGA 7.0軟件根據序列構建系統發育樹（圖2），結合平板形態，將RL-7菌株初步鑒定為克雷伯氏菌。

2.3 發酵條件優化結果

最適發酵條件結果見表2，可以看出，最優條件下RL-7菌株最大溶磷量達537.34 mg/L，對應發酵條件為溫度35 ℃，接種量3%，初始pH值7。從極差（R）來看，對發酵結果影響最大的因素為溫度，

R為97.80；其次為接種量，R為78.92；最后為初始pH值，R為31.45。故最適發酵溫度為35 ℃左右。同時對發酵后上清液的pH值進行了測定，可以看到pH值范圍在4.23～4.67之間，初步判定發酵液pH值與初始pH值關聯不大，同時相應

條件下對照pH值在6.71～7.45之間。發酵液呈明顯酸性，推測溶磷作用可能與產生有機酸有關。

2.4 產乙酸能力

通過高效液相色譜手段檢測RL-7菌株發酵上清液中乙酸含量，結果如圖3所示，在5.0 min處出現最高峰，此峰為乙酸的出峰位點。根據出峰面積計算，發酵液中乙酸含量為1.14 g/L，說明RL-7菌株能夠分泌較高含量的乙酸。初步推斷分泌有機酸為RL-7解磷菌的主要解磷方式。

2.5 產IAA能力

RL-7菌株在不添加色氨酸和添加色氨酸LB培養基中培養時均具有產IAA能力，產IAA濃度分別為24.13、 110.90 μg/mL（表3）。 添加色氨酸后大大提升了產IAA能力，具有潛在促生能力。

2.6 苗期促生效果

在番茄育苗試驗中，添加RL-7菌株的基質表現出明顯的促生效果（圖4）。由表4可知，相較于

對照，菌液處理的番茄苗株高、莖粗、地上部鮮重和地下部鮮重差異顯著，分別比對照增加8.77%、20.44%、73.42%和50.00%。葉綠素含量在兩者之間沒有明顯差異，僅比對照增加0.16%。

2.7 菌株RL-7對番茄植株養分含量的影響

對番茄苗地上部分樣品水分、全氮、全磷和全鉀指標測定結果見表5， 菌液處理番茄苗全磷含量達6.26 g/kg，為對照的1.20倍，其他指標變化不明顯。說明解磷菌RL-7的施用能夠提升植株中全磷的含量。

3 討論

解磷微生物種類繁多，目前發現的主要有芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬、沙雷氏菌屬等［15］，但具有高效解磷效果的菌種資源仍非常有限。本研究篩選獲得的RL-7菌株為克雷伯氏菌，最優條件下解磷量為537.34 mg/L，相較于先前報道的解磷菌解磷能力處于較高水平。萬水霞等分離得到的2株優良PGPR菌株CH07和FD11，其溶磷量分別為368.5 mg/L和321.5 mg/L［16］。于淼對解磷菌623-3培養條件進行優化，發現在最優條件下，其解磷量為420.953 mg/L［17］。唐岷宸等發現1株高效解磷菌貝萊斯芽孢桿菌，其溶磷量達495.4 mg/L［14］。陳容彬等獲得的伯克霍爾德菌PB在優化培養條件后，溶磷量為569.33 mg/L［18］。選用3因素4水平正交試驗分析pH值、溫度和接菌量對 RL-7 菌株溶磷能力的影響，明確了3個因素的影響程度和水平，對后期菌株的應用具有一定的指導意義。

解磷菌次生代謝產物中是否含有IAA在研究中也備受關注。IAA具有能夠直接促進植物生長的作用，解磷菌RL-7 具有產IAA能力，分泌量為24.13 μg/mL，大部分解磷細菌的解磷作用與其代謝產物中的低分子有機酸密切相關。這些有機酸能夠與Ca+、Mg+、Fe+等陽離子結合釋放出磷酸根離子，同時能夠降低環境pH值，促進難溶性磷酸鹽的溶解［19］。RL-7菌株代謝產物中乙酸含量達1.14 g/L，與其他文獻中的解磷菌株［20-21］相比，分泌量較高。但乙酸是否為該菌株解磷的主要有機酸，還有哪些種類的有機酸參與，有待進一步研究。另外菌株發酵后pH值下降明顯，且與初始培養基pH值無關聯性。當初始pH值分別為5、6、7、8時，發酵后pH值均在4.23～4.67之間。pH值的大幅降低推測分泌有機酸是該菌株解磷的主要途徑，但仍需下一步研究驗證。

為驗證RL-7菌株的實際應用效果，選擇育苗基質中按5%的比例添加菌株的方法，測定該菌株對番茄苗期株高、莖粗、地上部鮮重和地下部鮮重均有明顯促進作用。另外，番茄地上部植株內全磷含量相比于對照有明顯增加，但本研究未對基質有效磷的含量以及磷的具體去向進行分析，可在后續研究中開展。

4 結論

本研究篩選得到1株具有高效解磷能力的細菌菌株RL-7，經鑒定為克雷伯氏菌。該菌株在溫度35 ℃、初始接菌量3%、pH值7.0的最適條件下，溶磷量為537.34 mg/L。該菌具有產大量乙酸的能力，分泌有機酸可能是其主要解磷途徑。添加該菌的育苗基質能夠促進番茄苗的生長和番茄植株內磷素的積累。

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