6種抑菌劑在藍莓開放組培初代培養中的應用試驗

摘 要：為簡化藍莓組培生產工序、降低生產成本、提高接種效率和加快優質種苗培育進程，探究了藍莓開放組培初代培養的適用抑菌劑配方。以南高叢藍莓品種珠寶莖段為外植體進行初代培養，將開放式組培專用的6種植物源殺菌劑清菌易、ZP抗菌素、菌殺光、植培凈Ⅱ型、植菌靈、植菌素/清應用于藍莓開放式組培培養基中，比較各抑菌劑不同濃度的抑菌效果及對試管苗初代培養污染率和苗高的影響。結果表明：除使用抑菌劑菌殺光不同濃度的污染率都在30%以上外，其他5種抑菌劑按低于推薦濃度使用后均可有效控制污染，污染率均在10%以下，實現了藍莓開放式組培。綜合考慮抑菌效果、對植物組織生長的影響及成本因素，認為植菌素/清2毫升/升在藍莓開放式組培中為最佳抑菌劑使用濃度。

關鍵詞：藍莓；開放組培；抑菌劑

藍莓（Blueberry）屬杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）植物。藍莓果實含有防止腦神經衰老、增強心臟功能、明目及抗癌等獨特功效物質，因此被聯合國糧農組織列為人類五大健康食品之一[1]。 據美國藍莓專家預測，藍莓將成為21世紀世界范圍內最具有發展潛力的果樹樹種。藍莓種苗的市場需求量較大，常規的藍莓組織培養技術具有繁殖速度快、脫毒效果好、保持品種性狀等優勢，但是對無菌環境要求較為嚴格，造成組培生產投入過高、操作程序繁雜、污染嚴重等問題，制約了該技術的應用和普及[2]。因此簡化組培環節、降低成本將是組培技術未來的發展方向。近年來，開放式植物組織培養技術可以有效地解決培養過程中的污染問題，讓常規的植物組織培養技術程序簡化，大大降低了組培生產成本[3]。目前市面上有很多種廣譜性的植物抑菌劑，需要篩選出抑菌效果最好又不影響藍莓苗木生長、價格適宜的植物源殺菌劑。為此，筆者在本研究中圍繞降低藍莓組培育苗生產成本、提高效率、減少污染等方面，不斷探索優化傳統組培技術的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

供試藍莓品種為珠寶（圖1），是目前麻江縣藍莓種苗培育的主要品種之一。WPM基本培養基成分（主要有NH4NO3，Ca（NO3）·4H2O，MgSO4，KH2PO4 ，CaCl2·2H2O等18種化合物配制而成。6種開放組培專用抑菌劑為植菌靈（深圳中科前錦科技有限公司）、ZP抗菌素（山東省威海市綠韻商行分裝）、菌殺光（桂林宏陽生物科技有限公司）、植培凈Ⅱ型（杭州康倍斯生物科技有限公司）；植菌素/ 清、清菌易（北京中科起源科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 培養基的配制 選擇在普通的房間開展培養基的配制，配制對照WPM培養基時，添加瓊脂5.5克/升，蔗糖25.0克/升，玉米素1.0毫克/升，pH值調整到5.4，分裝后備用。配制添加不同抑菌劑培養基時，根據每種抑菌劑推薦使用量、低于推薦使用量及高于推薦使用量分別設置3個濃度梯度，連對照一共19個處理。分裝容器均采用40毫升的一次性餐盒。

1.2.2 接種方法和培養條件 采集藍莓品種珠寶當年生半木質化生長健壯的枝條，切成2厘米左右帶腋芽的莖段，先用自來水沖洗10分鐘，70%酒精消毒2分鐘，0.1%升汞溶液浸泡8分鐘，后分別接種到各處理培養基中，每個處理各接種30株，共計570株。培養溫度為26 ℃，光照度2000 lx，光照周期為14小時/天。抑菌劑處理接種時，選擇潔凈的房間作為接種室，用75%酒精噴霧降塵滅菌，鑷子、剪刀、接種盤等器材121 ℃高溫滅菌20分鐘后使用，接種時不必使用超凈工作臺。

1.2.3 污染率及苗高的調查 采用培養容器規格40毫升、高度3.8厘米的一次性餐盒，當部分植株頂端長至一次性餐盒蓋子時，即在接種后第35天以瓶為單位調查各處理的污染率及苗高等情況。

2 結果與分析

2.1 對污染率的影響

6種抑菌劑的推薦使用濃度處理（各產品說明書推薦的使用濃度為：植菌素/清2.5毫升/升，清菌易80毫克/升，菌殺光2毫升/升，植菌靈3.5毫升/升，植培凈Ⅱ型2毫升/升、ZP抗菌素80毫克/升），添加有植菌靈和植菌素/清的幾組處理均沒有出現污染，其他都出現不同程度的污染，且未添加抑菌劑的污染率最高（詳見表1），說明添加抑菌劑后確實可有效控制污染率，不添加抑菌劑的處理在3～15天內污染率大幅上升，35天時污染率達70.00%，使用濃度低于推薦濃度的抑菌劑處理中除了植菌靈和植菌素/清無污染外，添加有清菌易、ZP抗菌素和植培凈Ⅱ型都出現了少量污染，清菌易60.0、80.0、100.0毫克/升處理的污染率分別為10.00%、0.00%、0.00%，ZP抗菌素50.0、80.0、100.0毫克/升處理的污染率分別為6.67%、0.00%、0.00%，植培凈Ⅱ型1、2、3毫升/升處理的污染率分別為3.33%、0.00%、0.00%，菌殺光1.0、2.0、3.0毫升/升處理的污染率最高，分別為50.00%、46.67%、36.67%，由此推測，污染率隨著抑菌劑使用濃度的增加而降低，使用濃度越高，抑菌效果越好。

2.2 對誘導出芽苗高的影響

從試驗結果看出，在6種抑菌劑不同濃度處理下藍莓外植體萌芽率在96.67%以上，對照與添加6種抑菌劑處理對藍莓外植體誘導沒有明顯差異。在各抑菌劑處理下，苗高差距在1.0厘米以內，苗高高低依次為菌殺光1.0毫升/升＞植菌素/清2.0毫升/升＞植培凈Ⅱ型1.0毫升/升＞植菌靈3.0毫升/升＞ZP抗菌素50.0毫克/升＞清菌易60.0毫克/升（詳見表2），說明添加抑菌劑對苗高影響不是很大。

2.3 藍莓外植體接種使用抑菌劑對成本的影響

由于開放式組培脫離了嚴格的無菌操作環境，簡化了組培操作流程，因此在一定程度上降低了成本[4]。根據6種抑菌劑目前的市場價格和用量，從表3可以看出，菌殺光價格最低，植培凈Ⅱ型價格最高。

3 討論與結論

在藍莓組培快繁體系中，使用開放式組培專用的6種植物源殺菌劑植菌素/清、植菌靈、菌殺光、植培凈Ⅱ型、清菌易和ZP抗菌素，在各抑菌劑的推薦濃度處理下，在不經高溫高壓滅菌和不使用超凈工作臺接種的情況下，除了菌殺光污染較嚴重外，其他5種抑菌劑只有極少的污染發生，說明5種抑菌劑確實可有效控制污染率，實現藍莓開放式組培。從藍莓外植體誘導苗生長情況來看，在6種抑菌劑各自低于推薦使用濃度下，組培苗苗高高低依次為菌殺光1.0毫升/升＞植菌素/清2.0毫升/升＞植培凈Ⅱ型1.0毫升/升＞植菌靈3.0 毫升/升＞ZP抗菌素50.0毫克/升＞清菌易60.0毫克/升，說明菌殺光對植物生長的影響最小，但是污染率最高，其他幾種抑菌劑隨著使用濃度的增加會一定程度地影響到植物的生長。在植物種苗組培工廠化育苗生產中污染是不可避免的，但是污染率能夠控制在10%以內[5]，即可提高生產效益。在本次試驗中，菌殺光1.0 、2.0、3.0毫升/升的處理污染率都在30%以上，不適宜于生產中使用。植菌素/ 清2.0毫升/升、植菌靈3.0毫升/升、植培凈Ⅱ型1.0 毫升/升、ZP抗菌素50.0毫克/升、清菌易60.0毫克/升低于推薦使用濃度的處理，污染率均在10%以下，對藍莓組織生長的影響也較小，差異不明顯，相對成本而言，植菌素/清2.0毫升/升比較適宜在生產中使用。綜合考慮抑菌效果、對藍莓組織生長的影響及成本因素，認為植菌素/清2.0毫升/升是藍莓開放式組培中的最佳使用濃度。

筆者在本試驗中根據藍莓外植體誘導莖段株型選擇高度適宜、價格低廉的一次性塑料餐盒作為培養容器，節約成本和提高藍莓外植體接種效率。看出植菌素/清在藍莓初代培養中的應用效果明顯，但其在增殖培養組培苗分化、生根培養中的應用效果還有待進一步試驗驗證。還需注意的是，人為因素、不同季節的接種都會導致開放式組培過程中的污染率提高，所以規范開放式組培操作流程、把控好組培污染也是開放組培急需解決的關鍵問題。

參考文獻

[1] 修英濤，常鳳英，姜河，等.我國藍莓（越橘）栽培研究現狀及發展措施[J].遼寧農業科學，2003（3）：21-23.

[2] 周亞輝.植物組培新方法：開放式組織培養研究概況[J].中國園藝文摘，2008（6）：57-59.

[3] 陳澤斌，李冰，高熹，等.抑菌劑在藍莓開放組培中的應用試驗研究[J].中國南方果樹，2017，46（3）：139-142.

[4] 崔剛，單文修，秦旭，等.植物開放式組織培養研究初探[J].山東農業大學學報（自然科學版），2004，35（4）：529-533.

[5] 王趙玉，張健雄，盧新宇，等.抑菌劑在開放式植物組織培養中的應用研究[J].北方園藝，2012（18）：125-127.